氣相色譜法測定國公酒中7種摻偽香精成分

鄭利軍，鄧曉慶*，陳 雄，方宣啟，唐萬里，唐文杰，陳同強

（1.中大智能科技股份有限公司，湖南 長沙 410000；2.湖南振華檢測技術有限公司，湖南 長沙 410000；3.湖南省產商品質量檢驗研究院，湖南 長沙 410007）

國公酒也稱史國公浸酒，該酒作為一種中藥酒，是明、清朝代的宮廷秘方，由數十種中藥經科學浸泡配制而成，其氣味濃郁芳香，酒味醇厚甘美，常飲有益健康，實為中國知名之良酒[1]。國公酒為骨傷科腰腿痛內科痹證類非處方藥藥品，主要用來散風祛濕，舒筋活絡。用于經絡不和、風寒濕痹引起的手足麻木、半身不遂、口眼歪斜、腰腿酸痛、下肢痿軟、行步無力[2]。由于國公酒中添加有多種藥材，一些藥材成分聞起來具有較強的刺激性氣味，喝起來也不會太有食欲，讓人產生一種厭惡感，因此，一些不法生產廠家在實際生產過程中可能會摻入一些香精成分用于改善藥酒的口感和氣味，從而提高患者的服藥率。

一般來說，藥酒輔料中添加香精為可食用香精，使用時必須符合《食品用香料、香精使用原則》相關規定，確保香精不會超過安全限量。盡管香精在醫藥領域中廣泛使用，但如果濫用，一些香精（如香蘭素、乙基香蘭素等）可能會對人體健康帶來一定風險。由于香精的味道比較濃郁，如果長時間接觸或誤食后，容易對肝臟部位造成刺激，也會增加肝臟負擔，當肝臟超負荷工作時，會出現肝臟損傷引起嘔吐[3-7]。如果人體自身屬于易過敏體質，盲目接觸香精后，有可能會使局部的毛細血管通透性改變，引起皮膚紅腫，部分人群會伴有疼痛感和瘙癢感。摻偽香精成分多為人體難以消化的化學物質，長期過量食用，勢必會對人體造成傷害。同時，一些研究表明，某些香精可能會對脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）產生影響，導致細胞突變，甚至致癌[8]。此外，某些香精可能會對神經系統、肝臟和腎臟等產生影響[9-14]。目前對于酒中香精成分研究主要集中在酒本身香氣成分，而對于摻偽香精檢測研究甚少。因此，為了更好地保障藥酒的質量安全，對藥酒中添加香精含量進行檢測是有必要的。

目前，對于香精的報道較多，如食品中香精檢測以及香精中污染物檢測[15-17]；化妝品中香精香料的應用及含量測定[18-19]；香精在香煙中的應用[20-22]，而針對藥酒中香精成分檢測方法較為鮮見。本研究擬建立一種氣相色譜（gas chromatography，GC）法同時測定國公酒中香蘭素、乙基香蘭素、2-乙?；拎?、2-丙?；拎?、2-乙?；拎?、2-乙?；?1-吡咯啉、5,6,7,8-四氫喹喔啉共7種摻偽香精成分的分析方法，通過所建方法對市面上出售的國公酒中7種摻偽香精成分進行測定，從而為保障國公酒的用藥安全性以及防止香精在藥酒中的濫用提供一定技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

國公酒（酒精度42%vol）：市售，均為同一廠家；香蘭素標準品、乙基香蘭素標準品、2-乙?；拎藴势罚荷虾０沧V實驗科技股份有限公司；2-丙?；拎藴势?-乙?；拎簶藴势?、2-乙?；?1-吡咯啉標準品、5,6,7,8-四氫喹喔啉：壇墨質檢標準物質中心；乙酸乙酯、丙酮、氯化鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水均為二級純水。

1.2 儀器與設備

7890A氣相色譜儀[配備氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID）]：美國Agilent公司；BS224S電子分析天平：德國Sartorius公司；TGL-20M臺式高速冷凍離心機：杭州川一實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 混合標準溶液的配制

分別準確移取香蘭素、乙基香蘭素、2-乙?；拎?、2-丙?；拎?、2-乙?；拎?、2-乙?；?1-吡咯啉、5,6,7,8-四氫喹喔啉標準品各1.0 mL于10 mL容量瓶中，丙酮溶解并定容，得到100 μg/mL混合標準儲備溶液，渦旋混勻，再分別移取混合標準儲備溶液于10 mL容量瓶中，丙酮溶解并定容，渦旋混勻，得到質量濃度分別為0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L的系列混合標準工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

稱取試樣5.0 g于50 mL塑料離心管中，加入5 mL蒸餾水，加入3 g氯化鈉固體，再加入10 mL乙酸乙酯提取30 min，4 ℃低溫離心（8 000 r/min、5 min），取上層乙酸乙酯層，殘渣重復提取一次，合并上清液，40 ℃條件下氮吹至近干，加1.0 mL丙酮溶解，過0.45 μm濾膜，裝進樣小瓶，待GC分析[23-25]。

1.3.3 色譜條件

氣相色譜條件：InertCap 624毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度250 ℃，分流比5∶1，進樣體積1.0 μL。升溫程序為初始溫度60 ℃，保持1 min；以20 ℃/min升溫至180 ℃，保持2 min；以20 ℃/min升溫至260 ℃，保持8 min；FID溫度280 ℃。

定性定量方法：在上述色譜條件下，根據目標物標準品色譜圖保留時間定性，以各目標物質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，分別繪制標準工作曲線，按照標準曲線回歸方程計算樣品中各目標物含量。

1.3.4 提取條件優化[26-27]

設置基礎條件為稱樣量5.0 g，加入5.0 mL蒸餾水，考察不同提取溶劑（乙醚、乙酸乙酯、乙腈、正己烷、石油醚）、不同提取溶劑體積（5 mL、10 mL、20 mL）、不同氯化鈉加入量（1.0 g、2.0 g、3.0 g、4.0 g、5.0 g）對香精成分加標回收率的影響。

1.3.5 色譜柱優化

比較DB-5毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、HP-1701毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、InertCap 624毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、HP-INNOWAX毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）4種常見色譜柱分離效果。

1.3.6 數據分析

數據處理及繪圖采用Excel 2010軟件完成。

2 結果與分析

2.1 提取條件優化

2.1.1 提取溶劑的選擇

7種香精成分（香蘭素、乙基香蘭素、2-乙?；拎?、2-丙?；拎?、2-乙?；拎?、2-乙?；?1-吡咯啉、5,6,7,8-四氫喹喔啉）均屬于有機化合物，因此，根據相似相容原理，這些摻偽香精成分在有機試劑中均具有一定溶解性，實驗室常見可供選擇的提取試劑有乙醚、乙酸乙酯、乙腈、正己烷、石油醚等。在相同加標水平（1.0 mg/kg）下，考察5種提取溶劑對7種香精成分加標回收率的影響，結果見圖1。

圖1 不同提取溶劑對7種摻偽香精成分加標回收率的影響Fig.1 Effect of different extraction solvents on the adding standard recovery rates of 7 adulterated essence components

由圖1可知，在相同加標水平下，采用乙酸乙酯作為提取溶劑，7種香精成分的加標回收率均處于90%以上，采用正己烷、石油醚作為提取溶劑，7種香精成分的加標回收率基本處于80%以下，采用乙腈與乙醚作為提取溶劑，7種香精成分的回收率處于80%～90%范圍內，故選擇乙酸乙酯作為本試驗樣品的提取溶劑。

2.1.2 提取溶劑體積

提取溶劑體積的選擇需同時考慮到實驗的取樣量及檢測靈敏度。當提取溶劑體積較小時，可增加組分在其中的濃度，從而提高檢測靈敏度，然而，當提取溶劑體積過小，樣品很難被提取完全，回收率難以達到要求，影響結果的準確性。本實驗以2.1.1中優化的結果作為提取溶劑，考察不同體積提取溶劑對7種香精成分檢測靈敏度以及加標回收率的影響，結果見圖2。

圖2 提取溶劑體積對7種摻偽香精成分加標回收率的影響Fig.2 Effect of extraction solvent volume on the adding standard recovery rates of 7 adulterated essence components

由圖2可知，當提取溶劑體積為5 mL時，2-乙?；?1-吡咯啉、5,6,7,8-四氫喹喔啉這兩種香精成分的加標回收率均低于80%。當提取溶劑體積為10 mL與20 mL時，7種香精成分的回收率均在90%以上。同時考慮到取樣量對檢測靈敏度的影響以及經濟成本等，綜合上述因素，最終設定提取溶劑的體積為10 mL。

2.1.3 氯化鈉添加量的影響

氯化鈉的加入可減少7種香精成分在試樣中的溶解程度。在其他條件最優情況下，考察氯化鈉加入量對7種香精成分加標回收率的影響，結果見圖3。

圖3 氯化鈉添加量對7種摻偽香精成分加標回收率的影響Fig.3 Effect of sodium chloride addition on the adding standard recovery rates of 7 adulterated essence components

由圖3可知，當氯化鈉添加量為1.0～5.0 g時，不同目標物響應強度隨氯化鈉添加量的增加而增大。這是由于鹽析效應增加了溶液的離子強度及在有機相中的分配系數，降低了目標物在水溶液中的溶解度，導致響應強度及檢測靈敏度提高。當氯化鈉添加量達到3.0 g時，繼續增加氯化鈉，則試樣溶液中會析出氯化鈉固體，同時7種香精成分的回收率基本不再上升，因此，選擇加入3g氯化鈉較為適宜。

2.2 色譜柱的選擇

選用4種常見的色譜柱DB-5毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、HP-1701毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、InertCap 624毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、HP-INNOWAX毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）進行試驗，考察不同色譜柱對7種摻偽香精成分分離效果的影響。結果表明，DB-5色譜柱與HP-INNOWAX色譜柱分離對于2-乙?；拎号c2-丙?；拎どV峰分離效果較差，而HP-1701色譜柱則整體色譜峰拖尾現象較嚴重，使用InertCap 624色譜柱依據1.3.2色譜條件下的混合標準溶液色譜圖見圖4。由圖4可知，使用InertCap 624色譜柱條件下7種摻偽香精成分分離效果佳，7種成分可以完全分開，因此，選擇InertCap 624色譜柱進行測定。

圖4 7種香精成分混合標準溶液氣相色譜圖（InertCap 624色譜柱）Fig.4 Gas chromatogram of 7 kinds of essence components mixed standards (InertCap 624 chromatogram column)

2.3 線性關系及檢出限

取已配制好的7種香精成分混合標準溶液置于進樣小瓶中，供GC分析，分別以7種香精成分標準溶液質量濃度（X）為橫坐標，其峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，依據1.3.2方法處理后進行GC分析，將3倍信噪比（S/N）作為檢出限，選擇一定合適濃度的7種香精成分混合標準溶液加入到樣品中，經計算得7種香精成分混合標準溶液的檢出限，7種香精成分的標準曲線線性方程、線性范圍、檢出限及定量限結果見表1。

表1 7種香精成分標準曲線回歸方程、線性關系、檢出限及定量限Table 1 Standard curve regression equation, linear range, correlation coefficient, detection limit and quantitative limit of 7 essence components

由表1可知，7種香精組分在質量濃度0.5～10 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數R2均高于0.999。方法檢出限為0.5～0.9 mg/L，定量限為1.0～2.0 mg/L。

2.4 精密度與加標回收試驗

取未檢出7種香精成分的試樣，分別加入一定量混合標準溶液，設置低、中、高三種不同水平的加標量進行試驗，按照1.3.3步驟處理，進行方法的精密度及加標回收率實驗，經6次平行測定，計算方法的加標回收率及相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表2。由表2可知，7種摻偽香精成分加標回收率在82.0%～98.1%范圍內，精密度試驗結果RSD均低于10%，結果表明該方法具有準確性較好，重現性好等特點。

表2 精密度和加標回收試驗結果（n=6）Table 2 Results of precision and adding standard recovery tests (n=6)

2.5 樣品測定

按照上文所述步驟隨機網購10批次不同生產日期同一生產廠家的國公酒，依據1.3.2方法處理后進行試樣檢測，結果見表3。由表3可知，共有4批次產品中檢出了摻偽香精成分，其中3批次產品中檢出了香蘭素，1批次產品檢出乙基香蘭素，但含量均較低，處于檢出限附近，其他5種香精成分在國公酒中均未檢出。

表3 市售國公酒樣品7種香精檢測結果Table 3 Determination results of 7 essence components in commercial Guogong liquor samples mg/L

3 結論

本研究通過考察提取溶劑、氯化鈉固體加入量、色譜柱型號、以及分流比等參數條件，建立了氣相色譜法同時測定國公酒中7種摻偽香精成分的分析方法。采用10 mL乙酸乙酯作為提取溶劑，氯化鈉添加量為3.0 g，通過InertCap 624毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）分離，分流比設為5∶1，7種摻偽香精成分可以實現完全分離。通過方法學考察，結果表明標準系列溶液曲線線性關系良好，相關系數R2均大于0.999。在1.0～10 mg/L范圍內，加標回收率為82.0%～98.1%，精密度實驗結果的相對標準偏差（n=6）均低于10%。同時對網購國公酒樣品進行了檢測。結果表明，該方法具有簡單、快速及重現性好等特點，可應用于國公酒中香精成分的快速定量檢測，為保障國公酒的質量安全提供一定的技術支持。