腸道菌群代謝產物氧化三甲胺介導骨質疏松機制研究

元寶華 李興勇 劉學睿 唐兆鵬 李大娟 劉曉婷 姚興璋 楊琛 楊博文

1.甘肅中醫藥大學,甘肅 蘭州 730030

2.甘肅省人民醫院,甘肅 蘭州 730030

3.甘肅省中醫院,甘肅 蘭州 730030

4.蘭州市第一人民醫院,甘肅 蘭州 730030

腸道菌群(gut microbiome,GM)是人體內最大的生態系統,代表了一個隱藏的寶庫,其中包含數萬億種居住在宿主腸上皮屏障中的微生物[1]。在過去的十年中,隨著16 S核糖體RNA測序、宏基因組測序技術、代謝組和宏轉錄組測序等分子工具和技術的進步,宿主-GM之間復雜的相互作用正在逐步被破譯,揭示了GM維持許多機體生理功能,包括免疫力、新陳代謝和炎癥反應,可以影響人體健康的各個方面[2]。同時GM受到外界的侵擾,微生物組成和代謝能力發生的變化會影響宿主生物學相關分子,對免疫功能、神經調控和疾病進展產生深遠的影響。然而,與人類基因組的穩定性相比,腸道微生物群的可塑性使其成為個體化治療的有希望的機會。

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)作為一種全身性骨代謝疾病,與社會人口老齡化密切相關,以骨密度降低、骨微結構破壞和脆性骨折發生風險增加為主要特征,已成為全球主要公共衛生問題之一[3]。目前OP的治療策略主要集中在抗骨質溶解(如雌激素、雙膦酸鹽)和合成代謝藥物(如特立帕肽、阿巴帕肽)上,上述藥物由于副作用大且缺乏長期療效的證據,因此這類藥物的治療方案存在一些局限性[4],而“腸骨”軸理論證明了GM及其代謝產物有希望成為治療OP新的選擇,并且有很大的潛力和價值。

GM衍生代謝產物的種類和數量眾多,GM衍生代謝產物不僅影響遺傳和表觀遺傳調控,還影響免疫細胞的新陳代謝,包括免疫抑制和炎癥細胞[5]。氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide,TMAO)是一種重要的GM衍生代謝產物,又稱為三甲胺-N-氧化物(化學結構式見圖1)[6],食物中的膽堿、甜菜堿和左旋肉堿等物質在腸道菌群的作用下轉化為三甲胺(Trimethylamine,TMA),TMA極易被腸道上皮細胞吸收,通過門靜脈循環被轉運至肝臟并被黃素單加氧酶家族(flavin-containing mono-oxygenase,FMO)氧化,其中黃素單加氧酶3(flavin-containing mono-oxygenase 3,FMO3)在整個氧化過程中起主要作用,使TMA氧化為三甲胺-N-氧化物(trimethylamine N-oxide,TMAO)[7]。TMAO在心腦血管疾病中被認為是評估為不良心血管事件生物標志物之一[8],在阿爾茨海默氏癥、糖尿病、腎臟疾病、代謝功能障礙相關性脂肪肝、前列腺癌以及肥胖等疾病的發展扮演了重要角色[9],同時最新研究發現TMAO在OP的發生與發展發揮了重要作用,本文就TMAO促進OP的作用機制及藥物干預的研究進展做一綜述,探究TMAO作為OP的生物標志物及潛在治療靶點的可行性。

圖1 三甲胺-N-氧化物化學結構式Fig.1 Chemical structural formula of trimethylamine N-oxide

1 TMAO和OP的關系

TMAO是一種關鍵的GM衍生代謝物,血漿TMAO升高致使促炎細胞因子增加,最終導致多種炎癥相關疾病,包括OP、心血管疾病、糖尿病、腦卒中和代謝綜合征[10]。根據現有報道,TMAO主要從氧化應激(oxidative stress,OS)、NF-κB信號通路、NLRP3炎癥小體、骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)等方面來介導促進OP,加速OP的病程進展[11]。TMAO通過促進OS激活炎癥通路,進而促進破骨細胞(osteoclast,OC)的形成導致骨量流失加重。另一方面TMAO激活炎癥通路導致BMSCs成脂分化比例增多并抑制BMSCs成骨分化,使成骨細胞(osteoblast,OB)的分化減少,骨形成的量大幅度降低,繼而導致OP的發生與加重,同時OP相對特殊的內環境會加速一些炎癥因子的生成與釋放,反過來促進OP的進展,形成一個循環。因此TMAO對于OP病程具有顯著推進作用,并且主要是以炎癥反應為作用渠道。

1.1 TMAO誘導活性氧促進并加重OS

活性氧(reactive oxygen species,ROS)引發的OS介導了多條關于OP形成的通路,在OP的整個進程中扮演了重要角色[12]。TMAO可以抑制 SIRT3-SOD2信號通路促使線粒體ROS(mtROS)的產生[13],SIRT3-SOD2信號通路對于調節mtROS產生至關重要,SIRT3通過脫乙酰激活線粒體超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 2,SOD2),并將超氧自由基轉化為無害的氧[14]。TMAO誘導過量的ROS產生并導致OS,TMAO還可通過上調尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NADPH oxidase 4,NOX4)和下調SOD2來加重OS[15]。過量的ROS積累會使天然抗氧化防御機制引起的氧化還原穩態失衡,繼而阻礙成骨細胞的形成,從而導致骨吸收相對增加,從而導致OP的發生[16]。同時mtROS的大量累計會導致信號改變、膜損傷、細胞色素c的釋放以及線粒體蛋白質和DNA的氧化損傷,引起線粒體凋亡并促進ROS的產生,引起OB凋亡造成骨量丟失,促進OP的發生和病程進展[17]。

1.2 TMAO激活NF-κB信號通路和NLRP3炎癥小體

TMAO會導致ROS在機體過量積累,ROS是核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體被激活的已知機制之一,其中mtROS的形成對于NLRP3激活尤其重要[18]。NLRP3炎癥小體活化后致使白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-18(IL-18)的生成增加,IL-1β作為骨吸收的強刺激劑,與巨噬細胞的受體結合并促進核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for NF-KappaB,RANKL)的產生,RANKL與OC前體細胞上的受體活化因子(receptor activator of NF-KappaB,RANK)結合,導致破骨細胞活化[19]。在下頜骨缺損模型小鼠的研究中發現,NLRP3缺乏可以顯著促進成骨細胞分化并加速下頜骨愈合[20]。NLRP3炎癥小體廣泛參與OC形成及骨吸收的過程,NLRP3炎癥小體被激活之后會持續刺激體內OC分化,導致骨吸收升高和隨后的骨質流失[21]。

TMAO升高和隨后的OS會進一步抑制組蛋白去乙?；?(sirtuin 6,Sirt6)表達,研究發現骨髓Sirt6缺乏會促進卵巢切除術誘導的小鼠加快衰老和松質骨質流失,Sirt6缺乏會激活NF-κB和組織蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)促進小鼠破骨形成并抑制成骨細胞的生成[22]。NF-κB是一種轉錄因子,涉及固有免疫和適應性免疫的多種功能,可作為炎癥和骨重塑的主要調節因子,而持續的慢性炎癥和ROS水平升高也會增強NF-κB活性。研究發現在NF-κB信號傳導缺陷的轉基因小鼠中觀察到過量的骨形成,表明NF-κB在骨形成和重塑中起著重要作用[23]。NF-κB被OS以及其他細胞因子激活后繼而促進腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等相關炎癥過度表達,TNF-α與TNF-α受體(TNFR)結合后,促使RANKL分泌增多,促進OC的增殖與分化,TNFα也可以通過Smad或Smad非依賴機制抑制骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)誘導的OB分化,TNF-α還可以刺激OC分泌IL-6,IL-6進而促進OC前體的分化與成熟,從而促進骨吸收[24]。TNF-α也可以激活NF-κB通路加速骨質的流失,形成一個骨量丟失的惡性循環。

TMAO和后續的OS可以激活NLRP3炎癥小體和NF-κB信號通路,促進OC分化,導致骨質流失,最終引發OP[25]。

1.3 TMAO降低BMSCs的分化能力

骨髓間充質干細胞(BMSCs)是一種廣泛存在于骨髓腔中的干細胞,具有分化成多個細胞譜系的能力,包括OB、脂肪細胞、成纖維細胞和軟骨細胞,并且BMSCs的分化過程受多種分子通路的調控,BMSCs在成骨性疾病的干細胞治療中顯示出良好的潛力[26]。BMSCs的成骨和脂肪形成之間的平衡在維持骨穩態方面起著至關重要的作用,并且是OP發展的決定因素[27]。研究表明骨質疏松性的BMSCs內在信號具有不同程度的缺陷,導致其正常分化功能改變,成骨分化能力差,并有利于脂肪生成增加[28]。Lin等[11]研究發現,TMAO水平與骨密度(bone mineral density,BMD)值呈顯著負相關,TMAO可誘導和促進BMSCs的成脂分化,并抑制BMSCs的成骨分化。同時,成脂分化標志蛋白過氧化物酶增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARγ)和CCAAT增強子結合蛋白β(C/EBP-α)的表達上調,成骨分化蛋白Runt相關轉錄因子2 (runt-related transcription factor 2,Runx 2)蛋白和骨橋蛋白(osteopontin,OPN)的表達下調,在經過TMAO處理后的BMSCs細胞增殖顯著降低,促炎細胞因子水平(IL-1β、TNF-α、IL-6)顯著增加。另一項TMAO處理BMSCs的實驗研究結果表明,TMAO可以明顯促進BMSCs的成脂分化同時提高ROS濃度水平和活性,并且使IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎細胞因子大量產生,抑制BMSCs的成骨分化,導致骨代謝失衡,加重骨量丟失,進而導致或加重OP發生和進程[29]。

TMAO可以干預BMSCs的成骨分化能力,使骨量生成減少,繼而骨量吸收-增加的平衡被打破,總體骨量出現減少,導致OP的出現并時期進程加快。見圖2。

圖2 TMAO生成途徑和TMAO介導OP路徑示意圖Fig.2 Schematic diagram of TMAO generation pathway and TMAO mediated OP pathway

2 小結

TMAO對于OP的發生和發展有直接關聯,主要通過介導OS、NF-κB信號通路、NLRP3炎癥小體和BMSCs等方面來促進OP,但大部分GM衍生代謝產物是通過多渠道、多階段及多步驟介導機體相關生理病理過程,因此TMAO不單獨通過炎癥相關通路介導OP,其他信號通路(如自噬信號通路)也可能參與其中,同時TMAO抑制BMSCs成骨分化的具體機制過程也不明確,這些內容還需要在相關研究中進一步去驗證。

TMAO作為心血管不良疾病的生物標志物之一,其臨床檢測方式已經成熟且結果快速準確,并且TMAO和OP因果關系已經明確,因此TMAO作為OP的觀測指標是十分合理的,能夠方便快捷地檢測臨床這一指標更具有推廣研究的實際意義。隨著關于TMAO和OP的作用機制被逐步揭示,未來其已有望成為OP的生物標志物之一。藥物干預TMAO治療OP的研究目前較少,但根據已有的研究結果表明藥物干預TMAO治療OP是有效的[30-32]。然而目前這方面的研究開展的較少,還需要等多相關研究來支持豐富上述結論。因此將TMAO作為OP治療靶點的觀點還有待商榷,但其有望在未來成為OP新的治療靶點,從而為OP的新藥研發和治療方案提供新的方向和理論支持。