補肺納腎丸治療慢性阻塞性肺疾病大鼠的效果及對肺組織ERK 1/2的影響

閆文瑞， 張常喜， 平昕翀， 趙思超

（1.寧夏醫科大學中醫學院，銀川 750004； 2.寧夏回族自治區中醫醫院暨中醫研究院，銀川 750021； 3.甘肅中醫藥大學，蘭州 730000）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以氣道炎癥及持續氣流受限為主要特征的呼吸系統疾病，病變累及氣道、肺實質、肺血管；病情進展呈持續性，且病程遷延反復，發病率及病殘病死率均逐年增高[1]，也是全球呼吸系統慢性疾病的主要死亡原因之一[2]?，F代醫學治療COPD 的療效肯定，但仍然存在諸多局限性[3-4]。長期使用激素類藥物可出現如耐藥性、胃腸功能紊亂等情況。本課題組采用補肺納腎丸（bufeinashen pills，BFNSP）復方制劑防治COPD 及肺相關疾病，發現BFNSP 不僅可以改善COPD 患者臨床癥狀、提高患者生活質量，還可改善肺功能，降低炎性因子白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）的表達[5-6]。香煙煙霧是COPD 發展的主要危險因素[7]，且煙霧會導致肺部明顯的慢性炎癥，增加炎性介質的釋放，如白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等[8]。同時有研究[9]顯示，炎性細胞因子是加快COPD 患者病情進展的重要因素，如IL-1β 在COPD 患者中的水平明顯升高，加重肺部炎癥的發展。COPD 病理生理學改變是外周氣道炎癥及結構改變致氣道狹窄的相互作用過程[10]，細胞外信號調節激酶（ERK）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）之一，是包括炎癥反應在內的細胞轉錄活性的重要介質[11]，煙霧暴露（cigarette smoke，CS）激活ERK，在慢性氣道炎癥中起重要作用[12-13]。有研究[14]表明，ERK 1/2 在COPD 模型大鼠中廣泛表達。本研究通過觀察不同濃度的BFNSP 對COPD 大鼠模型干預效果及對肺組織中ERK 1/2 蛋白的活化情況及炎性因子IL-1β 的變化，以期為BFNSP 防治COPD 的臨床實踐提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠38 只，10～12 周齡，體質量（200±20）g，購于成都達碩實驗動物有限公司，生產許可證號SCXK（川）2020-030；大鼠飼養造模及灌胃于四川大學華西醫院科技武侯區科園四路1 號的動物房內。大鼠自由進食、飲水，溫度20～26 ℃，相對濕度45%～75%，適應性喂養1周后進行實驗。動物實驗經四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會批準（批準號：20230625001）。后續大鼠組織實驗于寧夏回族自治區中醫醫院進行。

1.2 藥物與試劑

BFNSP（黃芪、肉蓯蓉、細辛、蟬蛻、防風、續斷、白術、荊芥穗、紫蘇葉、黨參、紫蘇子、益智仁、瓜蔞、葶藶子、地龍、全蝎等）購于寧夏回族自治區中醫醫院暨中醫研究院（規格：60 g/瓶），分別制備0.125 g·mL-1、0.25 g·mL-1、0.5 g·mL-1的藥液，4 ℃保存備用；脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）（批號：517 L031，規格10 mg/瓶，北京索萊寶科技有限公司）；地塞米松片（批號：LB21135，浙江仙琚制藥股份有限公司）。

蘇木素染色液（G1004X，武漢賽維爾生物科技有限公司）；伊紅染色液（YE2080，合肥博美生物科技有限責任公司）；鹽酸（7647-01-0，成都市科隆化學品有限公司）；Rat IL-1β ELISA 試劑盒（ZC-36391，上海茁彩生物科技有限公司）；BCA蛋白含量檢測試劑盒（P0009，上海碧云天生物技術股份有限公司）；細胞裂解液（P0013；上海碧云天生物技術股份有限公司）；P-ERK 1/2 抗體（AP0974X，美國ABclonal 生物科技有限公司）；鼠抗β-actin（AC026，美國ABclonal 生物科技有限公司）；Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP（S0001，美國affbiotech 公司）；Molpure?Cell/Tissue Total RNA Ki［t19221ES50，翌圣生物科技（上海）股份有限公司］；PrimeScriptTMRT reagent Ki［tRR047A，寶日醫生物技術（北京）有限公司］；TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）［RR820A，寶日醫生物技術（北京）有限公司］。

1.3 儀器

組織石蠟包埋機（BMJ-A，常州市郊區中威電子儀器廠）、輪轉式石蠟切片機（徠卡-2016，德國徠卡公司）；數字切片掃描儀（Pannoramic 250，3DHISTECH 公司）；酶標儀（SpectraMAX Plus384，上海美谷分子儀器有限公司）；實時熒光定量（RT-PCR）儀（QuantStudioTM3，美國Thermo Fisher 科技公司）；垂直電泳槽（JY-SCZ4+，北京君意東方電泳設備有限公司）；熒光圖像分析系統（5200 Multi，上海天能科技有限公司）。

1.4 COPD 大鼠模型的構造

除對照組外，其余大鼠采用香煙煙熏法（煙堿量15 mg，尼古丁量1.0 mg，一氧化碳量13 mg）聯合LPS 制備大鼠COPD 模型。在造模期的第1、14、28 天對大鼠進行麻醉，當日不熏蒸，在氣道內滴注LPS 溶液（1 mg·kg-1）；在第2～13、15～27、29～49 天將大鼠置于自制染毒箱被動吸煙，每次吸30 支香煙，每次30 min，2 次/d，兩次間隔時間12 h，共49 d。同時對照組大鼠在熏蒸箱中呼吸正?？諝?，并于麻醉后第1、14、28 天用生理鹽水0.2 mL 代替LPS 溶液滴入氣道。期間，觀察大鼠呼吸狀態、毛發、進食情況、活動度等；第50天，隨機解剖2 只大鼠進行肺組織病理觀察，顯示COPD 建模成功。

1.5 分組及給藥

將38 只大鼠按隨機數表法分為對照組（6只）、COPD 組（8 只）、BFNSP 高劑量（BFNSP-H）組（6 只）、BFNSP 中劑量（BFNSP-M）組（6 只）、BFNSP 低劑量（BFNSP-L）組（6 只）、地塞米松組（6 只）。隨機選取COPD 組2 只大鼠解剖進行肺組織病理觀察，顯示COPD 建模成功后，中藥給藥劑量按照成人日用量與裸鼠體表面積折算成等效劑量，對照組（6 只）和COPD 組（6 只）灌胃生理鹽水2 mL/次，1 次/d；BFNSP-H 組（6 只）灌胃（0.5 mL/100 g）、BFNSP-M 組（6 只）灌胃（0.25 mL/100 g）、BFNSP-L 組（6 只）灌胃（0.125 mL/100 g），1 次/d，地塞米松組（6 只）灌胃（0.02 mL/100 g），1 次/d；各組大鼠均連續給藥8 周。

1.6 HE 染色觀察大鼠肺組織病理學變化

灌胃給藥結束24 h 后，取肺臟組織以4%多聚甲醛固定24 h，經脫水、浸蠟、包埋、切片、展片、撈片、烤片后，進行蘇木精和伊紅染色，封片，在光鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.7 酶聯免疫吸附試驗測定大鼠氣管肺泡灌洗液中IL-1β 水平

將大鼠安樂處死，軟管氣管插管后，5 μL 預冷PBS 灌洗，重復3 次，收集其支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），采用酶聯免疫吸附試驗測定BALF 中IL-1β 水平，操作過程嚴格按照試劑盒說明進行。

1.8 免疫印跡法檢測大鼠肺組織中P-ERK 1/2蛋白表達

肺組織樣本在預冷的RIPA 裂解液中均質，提取總蛋白，使用BCA 試劑盒進行蛋白定量，并在95 ℃條件下變性5 min。通過SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質，轉膜，封閉，4 ℃條件下用特異性抗體P-ERK 1/2（1∶2 000）及內參β-actin（1∶50 000）孵育過夜。1×TBST 洗膜3 次，每次10 min。加入山羊抗兔IgG（H+L）HRP（1∶50 000）二抗，室溫孵育2 h。1×TBST 洗滌后，最后ECL化學發光液顯影，Image J 8.0 軟件測定條帶灰度值，β-actin 作為內參蛋白。

1.9 RT-qPCR 檢測大鼠肺組織中ERK 1/2 mR－NA 表達

取-80 ℃保存肺組織標本，用Trizol 試劑提取組織總RNA，反轉錄合成cDNA。PCR 反應參數：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃反應30 s，45 個循環。使用Thermo Scientific PikoReal 軟件對實驗過程中樣品的CT值進行PCR 結果分析，以β-actin 為內參，并使用2-ΔΔCt計算mRNA 的相對表達。ERK 1/2 引物由Sangon Biotech 設計合成。引物序列見表1。

表1 各基因PCR 引物序列

1.10 統計學方法

數據采用SPSS 26.0 軟件進行統計分析，對數據進行正態性及方差齊性檢驗，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物一般狀況

大鼠共38 只，實驗過程中，除確認造模隨機處死2 只COPD 大鼠外，其余各組大鼠均無死亡。實驗結束時，對照組大鼠精神狀態良好，發育正常，無咳喘等表現；其余各組大鼠均有不同程度精神差、活動性差、飲食差、被毛脫落、咳嗽、呼吸急促、打噴嚏、鼻腔分泌物增多等表現。經藥物干預后，BFNSP-L 組、BFNSP-M 組、BFNSP-H 組及地塞米松組大鼠癥狀逐漸減輕，精神及活動狀態等較COPD 組明顯改善。

2.2 BFNSP 減輕COPD 大鼠肺組織病理損傷

對照組肺臟組織表面被覆漿膜，未見明顯水腫、炎性浸潤或纖維結締組織增生；各級支氣管結構完整清晰，支氣管上皮細胞形態正常，無明顯變性、壞死或脫落；肺泡上皮細胞形態較為正常，未見明顯變性、壞死，間質未見明顯炎性細胞浸潤及纖維組織增生。COPD 組少量肺泡上皮細胞脫落于肺泡腔內，見少量肺泡上皮細胞變性、壞死，壞死細胞胞質溶解，胞核固縮崩解，亦見不同程度的肺泡腔擴張，肺泡腔體積擴大，肺泡隔斷裂，周圍肺泡腔被擠壓、皺縮；間質內見不同程度炎性細胞浸潤，主要為分葉核或桿狀核的中性粒細胞，并伴有極少量纖維組織增生，可見核呈長橢圓形的成纖維細胞，見組織內血管瘀血，可見紅細胞蓄積。BFNSP 低中高劑量組、地塞米松組病理改變較模型組均有不同程度的改善，在不同濃度BFNSP 處理組中，以高劑量組肺組織病理改善最為明顯，見圖1。

圖1 BFNSP 減輕COPD 大鼠肺組織損傷（HE×200）

2.3 BFNSP 降低COPD 大鼠支氣管BALF 中IL-1β 含量

與對照組比較，COPD 組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β 含量升高（P<0.05）。與COPD 組比較，BFNSP-L 組、BFNSP-M 組、地塞米松組、BFNSP-H組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β 含量依次降低（P 均<0.05）；BFNSP-H 組肺泡灌洗液中IL-1β 含量較地塞米松組降低（P<0.05）；BFNSP 不同劑量組內比較，以高劑量組肺泡灌洗液中IL-1β 含量降低最明顯（P<0.05），見表2。

表2 ELISA 檢測BFNSP 對COPD 大鼠支氣管BALF 中IL-1β 含量的影響（±s）

表2 ELISA 檢測BFNSP 對COPD 大鼠支氣管BALF 中IL-1β 含量的影響（±s）

與對照組比較*P＜0.05；與COPD 組比較△P＜0.05；與地塞米松組比較#P＜0.05；與BFNSP-L 組比較○P＜0.05。

組別nIL-1β/（pg·mL-1）對照組62.858±0.687 COPD 組67.811±0.744*BFNSP-H 組63.696±0.267△#○BFNSP-M 組65.219±0.823△BFNSP-L 組66.323±0.799△地塞米松組65.067±0.403△

2.4 免疫印跡檢測BFNSP 對COPD 大鼠肺組織中P-ERK 1/2 的表達

與對照組比較，COPD 組肺組織中P-ERK 1/2 表達升高（P<0.05）；與COPD 組比較，BFNSP-L組、BFNSP-M 組、地塞米松組、BFNSP-H 組大鼠肺組織中P-ERK 1/2 表達依次降低（P 均<0.05）；且BFNSP-H 組肺組織中P-ERK 1/2 表達較地塞米松組降低（P<0.05）；BFNSP 不同劑量組內比較，以高劑量組肺組織中P-ERK 1/2 表達降低最明顯（P<0.05）。見圖2、表3。

圖2 免疫印跡法檢測BFNSP 對COPD 大鼠P-ERK 1/2 表達的影響（n=3）

表3 BFNSP 對COPD 大鼠肺組織中P-ERK 1/2 相對表達量的影響（±s）

表3 BFNSP 對COPD 大鼠肺組織中P-ERK 1/2 相對表達量的影響（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與COPD 組比較，△P＜0.05；與地塞米松組比較，#P＜0.05；與BFNSP-L 組比較，○P＜0.05。

組別n蛋白相對表達量對照組30.805±0.433 COPD 組37.298±1.862*BFNSP-H 組31.636±0.891△○BFNSP-M 組33.006±0.739△○BFNSP-L 組35.069±1.022△#地塞米松組32.895±0.413△

2.5 RT-qPCR 檢測BFNSP 對COPD 大鼠肺組織中ERK 1/2 mRNA 表達量的影響

與對照組比較，COPD 組肺組織中ERK 1/2 mRNA 表達量升高（P<0.05）；與COPD 組比較，BFNSP 高、中劑量組及地塞米松組肺組織中ERK 1/2 mRNA 表達量均降低（P 均<0.05）；與地塞米松組比較，BFNSP-H 組肺組織中ERK 1/2 mRNA 表達量明顯降低（P<0.05）；不同濃度BFNSP組內比較，以BFNSP-H 組肺組織中ERK 1/2 mRNA 表達量降低最明顯（P<0.05），見表4。

表4 BFNSP 對COPD 大鼠肺組織中ERK 1/2 mRNA表達量的影響（±s）

表4 BFNSP 對COPD 大鼠肺組織中ERK 1/2 mRNA表達量的影響（±s）

與對照組比較*P＜0.05；與COPD 組比較△P＜0.05；與地塞米松組比較#P＜0.05；與BFNSP-L 組比較○P＜0.05。

組別nERK 1/2 mRNA 表達量對照組30.730±0.242 COPD 組38.446±0.787*BFNSP-H 組31.466±0.151△#○BFNSP-M 組36.237±3.794△BFNSP-L 組34.920±0.582地塞米松組34.238±3.147△

3 討論

COPD 是慢性呼吸系統疾病，慢性氣道炎癥和氣道重塑是COPD 的重要表現，且氣道重塑是COPD肺部病理核心[15]，尤其在小氣道（內徑＜2 mm）更為明顯[16]；由于COPD 患者長期反復受氣道炎癥刺激，引起氣道損傷后非正常修復，導致一系列氣道壁、結構壁改變等病理狀態，包括氣道上皮細胞增生、網狀基底膜（RBM）增厚、膠原蛋白沉積、氣道上皮間質轉化、支氣管平滑肌增厚纖維化等病理改變[17]。這與多種細胞因子及細胞信號通路存在密切關系。目前認為，COPD 發病機制與氣道炎癥[18]、上皮間質轉化[19]、蛋白酶—抗蛋白酶失衡[20]、氧化應激等有關[21]。吸煙被公認為是導致COPD 發展的重要危險因素[22]，同時大量煙霧刺激氣道促炎細胞因子的募集（如IL-1β），研究顯示[18]，IL-1β 在COPD 大鼠血清中水平增高，IL-1β 可刺激單核細胞和巨噬細胞介導對中性粒細胞的趨化，也可誘導內皮細胞活化直接參與炎性反應，由此發生呼吸道反復炎癥并加重氣道阻塞[23-24]；從本研究各組大鼠的一般情況及組織病理形態可以看出，COPD 造模大鼠在模型制備期間出現咳嗽、打噴嚏、氣喘、鼻腔分泌物增多、精神狀態差等癥狀，與患者臨床表現一致，且HE 染色結果發現，COPD 大鼠的支氣管壁存在大量炎性細胞，肺泡腔擴大融合，與慢性阻塞性肺疾病的主要病理特征相似，證明本研究模型制備成功。同時，COPD 大鼠模型BALFIL-1β 含量升高，且不同濃度BFNSP 干預組能顯著下調COPD 大鼠中IL-1β 的含量，說明BFNSP 能夠緩解COPD 大鼠模型中性粒細胞的聚集，從而抑制相關炎性因子的釋放，減輕炎癥反應，緩解COPD進展。結合本實驗HE 染色病理結果，不同濃度BFNSP 藥物組及地塞米松組大鼠肺組織形態等各方面均較COPD 組大鼠明顯改善，BFNSP-H組肺組織中IL-1β 含量較地塞米松組降低明顯，且BFNSP 高、中、低劑量組內比較，高劑量組降低顯著。這提示BFNSP 可能在慢性阻塞性肺疾病的治療過程中具有積極的意義。

細胞外調節蛋白激酶是MAPKs 信號通路的關鍵調控因子，ERK 的上游蛋白會磷酸化ERK，活化后的P-ERK 作用于細胞質內多種信號分子，同時也會進入細胞核，進而作用于轉錄因子，對基因表達進行調控[25]，促進細胞增殖、分化、凋亡等過程[26]，同時也參與炎性反應的調控，可以促進炎性細胞因子和趨化因子的釋放[27]。ERK 信號通路可被多種炎性介質激活，包括CS[28]。研究[29-30]表明，在COPD 病程進展中，ERK 激活產生促炎性細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6 等，加重肺部炎癥。也有研究[31-32]表明，ERK 在氣道平滑肌細胞中廣泛表達，參與COPD 細胞增殖與氣道重塑。有報道[33]顯示，香煙提取物可通過P-ERK 1/2 上調線粒體自噬及溶酶體活性，進而誘導氣道平滑肌細胞增殖惡化，導致COPD 支氣管的組織損失和結構重塑。有研究[34]表明，HDAC6 可通過抑制ERK 1/2 表達發揮抑制膠原合成及COPD 患者氣道和血管重塑的支氣管平滑肌細胞和肺動脈平滑肌細胞增殖。本研究的Western blot 及RT-qPCR 結果顯示，COPD 大鼠肺組織中ERK 1/2 mRNA 表達增加，ERK 1/2 蛋白被激活，P-ERK 1/2 增加，經過不同濃度BFNSP 中藥干預后，肺組織中ERK 1/2 mRNA 表達及ERK 1/2 磷酸化可被抑制，與西藥地塞米松組比較，BFNSP-H 組肺組織中ERK 1/2 mRNA表達及ERK 1/2 磷酸化表達降低，BFNSP 高、中、低劑量組內比較，以BFNSP-H 組作用最佳。

中醫學根據反復咳、痰、喘的臨床特點，COPD 多屬中醫肺脹、喘證等范疇?！鹅`樞·脹論》日：“肺脹者，虛滿而喘咳”。中醫學認為肺主肅降，其認為本病多因長期反復咳喘氣逆發作，久病肺虛在此基礎上，痰、飲、瘀阻為其病理因素，且貫穿疾病始終[35]。肺氣虛證是痰瘀互結的基石，痰瘀互結、氣道澀滯則是導致肺氣受阻不能斂降而成肺脹的基礎[36]。以此為依據，研制出寧夏回族自治區中醫醫院暨中醫研究院院內制劑BFNSP，由黃芪、黃精、肉蓯蓉、細辛、蟬蛻、防風、續斷、白術、荊芥穗、紫蘇葉、黨參、紫蘇子、益智仁、瓜蔞、葶藶子、地龍、全蝎等17 味藥物組成。諸味藥聯合運用，共奏調補肺腎、止咳平喘、化痰祛瘀之效。

綜上所述，BFNSP 對COPD 大鼠肺組織形態結構及氣道炎癥均有一的定改善作用；并可抑制肺組織中ERK 1/2 mRNA 及蛋白表達，其機制可能與ERK 1/2 信號通路有關，但其具體干預機制仍需進一步研究。