黑曲霉耐熱型葡聚糖酶纖維素結合結構域的替換與融合體酶性質

單逸藍,楊夢蓮,趙琳,沈微*,楊海泉,夏媛媛,陳獻忠

1(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)2(安徽華恒生物科技有限公司,安徽 合肥,231131)

β-葡聚糖主要存在于廣泛應用于釀造、飼料等工業中的大麥、高粱等谷物的胚乳細胞壁中[1]。由于家禽缺乏相應的腸酶來有效分解胚乳細胞壁的主要多糖:β-葡聚糖[2],谷物應用于家禽飼料中往往營養價值較低。β-葡聚糖遇水會膨脹,黏度增加,不僅導致家禽腸道中的食糜黏稠度增高、養分吸收受阻,而且含有β-葡聚糖的黏性糞便極大增加了養雞場清潔工作的勞動量,并帶來一定的環境污染問題[3]。在飼料中加入β-葡聚糖酶有利于改善以上問題。由于家禽特殊的攝食習慣,其飼料需要保持較高的顆粒穩定性(particle stability,PDI)。在造粒生產環節階段中采用高溫處理使飼料中的淀粉充分糊化是提高飼料PDI的主要方法。張亮等[4]研究了造粒溫度對顆粒飼料質量的影響,發現溫度的升高(80～90 ℃)可以改善顆粒飼料的質量,其中造粒溫度達到90 ℃時獲得的飼料的PDI等指標顯著優于采用85 ℃或80 ℃獲得的飼料。目前市場上尚沒有能耐受80 ℃以上高溫的β-葡聚糖酶。本課題組在前期工作中,發現了一種來源于黑曲霉的高耐熱葡聚糖酶AnEglA6[5-6],這種酶在乳酸克魯維酵母中的表達產物AnEglA6K能短時耐受85 ℃高溫[6]。序列比對發現,AnEglA6分子由兩部分組成,前端311個氨基酸殘基形成催化功能結構域,而羧基端的36個氨基酸殘基則構成纖維素結合結構域(cellulose binding domain,CBD)[6],兩者之間是由44個氨基酸殘基組成的連接橋。在葡聚糖酶系中,CBD往往與結晶型纖維素的水解有關[6-7],但AnEglA6K對微晶纖維素只具有很微弱的水解能力。碳水化合物結合模塊(carbohydrate binding module,CBM)是一類多模塊酶蛋白,其功能是與纖維素、木聚糖等碳水化合物底物結合[7],CBM通常與催化多糖水解反應的催化結構域(catalytic domains,CD)連接[8]。CBD是最早被發現的碳水化合物結合模塊[9]。部分CBM家族具有與結晶型纖維素結合的能力,廣泛應用于碳水化合物生物材料的功能化,促進異源蛋白質的表達、純化、穩定和固定化等[10]。纖維素酶應用于畜禽飼料中能提高仔雞、肉牛等動物營養物質的消化率[11]。替換或增加CBD是提高纖維素酶降解結晶型纖維素活性的方法之一[12]。本課題組在前期工作中,將不同微生物來源的碳水化合物結合模塊CBM更換AnEglA6自身的CBD,結果發現所獲得的融合體酶的催化活性基本喪失或大幅度下降,但AnEglA6與來自嗜熱菌(Caldicellulosiruptorkristjanssonii)的木聚糖酶的碳水化合物結合模塊CBM9[13]以及來自熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的木聚糖酶的模塊CBM10[14]重組獲得的融合酶保持了較高的葡聚糖酶活力,兩者均獲得了明顯的降解微晶纖維素的能力,后者的熱穩定性顯著提高。本文主要研究上述融合酶的獲得方法及應用性能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

含有eglA6基因的質粒pPIC9K-eglA6為實驗室前期構建[5]。表達載體pPIC9K、宿主菌巴斯德畢赤酵母GS115為Invitrogen公司產品,為本課題組保藏。含有碳水化合物結合模塊CBM9[13]和CBM10[14]的編碼基因按文獻報道的序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,片段合成后插入載體pUC57后分別獲得重組質粒pUC-CBM9和pUC-CBM10。

1.1.2 菌株和質粒

限制性內切酶、DNA聚合酶PrimerStar、核酸標準分子質量,寶日醫(北京)有限公司;無縫克隆連接試劑盒,寶日醫公司;質粒提取和DNA片段回收試劑盒,蘇州康寧生物科技有限公司;蛋白標準分子質量,翌圣生物科技有限公司;茯苓多糖、酵母葡聚糖、大麥葡聚糖、樺樹木聚糖、CMC-Na,MegaZyme公司;熱凝膠、甘露聚糖、微晶纖維素,上海源葉生物技術公司;蛋白純化鎳親、層析填料,無錫天演技術有限公司。

1.1.3 主要培養基與試劑的配制

LB培養基(luria-bertani medium)、酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(yeast extract peptone dextrose medium, YPD)、MM基本培養基(mineral medium)、甘油緩沖復合培養基(buffered glycerol-complex medium, BMGY) 和誘導表達培養基(buffered methanol-complex medium, BMMY)均參考文獻[5]。

檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液參考文獻[5]。

1.1.4 引物及基因的合成

根據eglA6的核苷酸序列(NCBI登錄號:MG913988)以及CBM9和CBM10的核苷酸序列[11-12]設計引物,序列如下:

Peg01:5′-CTGAAGCTTACGTAGAATTCAGTCCG-AGGGCTAAGCGGTC-3′

Peg02:5′-GCGAATTAATTCGCGGCCGCCTATTA-atggtgatggtgatggtgCAAACACTGCGAATACCAC-3′

Peg9:5′-CTTACATATATCCTCTTTGCCGCAGCT-ACAGCCGTCGATG-3′

Peg10:5′-CAATTACATTGCTGGTTACCCGCAGCTACAGCCGTCGATG-3′

其中Peg01和Peg02用于擴增eglA6完整的成熟肽編碼區。Peg01和Peg9、Peg10用于擴增eglA6中不含纖維素結合結構域編碼區的部分。引物中單下劃線部分為內切酶EcoR Ⅰ和NotI識別位點,雙下劃線部分與CBM9、CBM10編碼區5′-端互補,用于片段間的無縫連接。單下劃線小寫字母部分為His-tag編碼區。

根據核苷酸序列[13-14]設計擴增CBM9、CBM10的引物如下:

P901:5′-GCAAAGAGGATATATGTAAG-3′

P902:5′-GCGAATTAATTCGCGGCCGCCTATTA-atggtgatggtgatggtgGGTAACCAGCAATGTAATTG-3′

P1001:5′-GGTAACCAGCAATGTAATTG-3′

P1002:5′-GCGAATTAATTCGCGGCCGCCTATTA-atggtgatggtgatggtgGCCGCTCCCCACAATACCAA-3′

雙下劃線部分與CBM基因5′-端一致,用于CBM基因的擴增,同時也用于與eglA6擴增片段的無縫連接。

1.2 實驗方法

1.2.1 融合酶表達載體構建

以質粒pPIC9K-eglA6作為模板,用引物Peg01、Peg9擴增eglA6基因中不含纖維素結合結構域編碼區的片段。PCR條件為:98 ℃預變性 3 min;94 ℃變性 30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸 1 min,30個循環。擴增片段大約為1.1 kb。再以pUC-CBM9為模板,以引物P901、902擴增片段CBM9。PCR條件為:98 ℃預變性 3 min,94 ℃變性 30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸 40 s,30個循環。上述PCR擴增產物均以膠回收方法進行純化。載體pPIC9K以EcoR Ⅰ和NotⅠ酶切線性化,以PCR產物純化試劑盒純化后與兩次PCR獲得的片段混合,用無縫連接試劑盒進行連接。連接產物轉化大腸桿菌JM109,轉化子提取質粒后經酶切電泳鑒定,獲得重組質粒pPIC9K-eglA6-CBM9。用引物Peg01、Peg10擴增eglA6基因,以pUC-CBM10為模板,以P1001、P1002為引物擴增片段CBM10,擴增產物約為0.15 kb。上述擴增片段與線性化的載體pPIC9K連接獲得重組質粒pPIC9K-eglA6-CBM10。操作方法與質粒pPIC9K-eglA6-CBM9構建方法一致。用引物Peg01、Peg02擴增eglA6基因中包含纖維素結合結構域的完整編碼區的片段,由于該片段末端帶有His-tag標簽,為便于和已有文獻報道[5]區別,將該片段命名為eglA6T。上述擴增產物純化后直接與經EcoR I和NotI雙酶切的pPIC9K連接。

1.2.2 酵母轉化及篩選

將1.2.1節中獲得的重組質粒用BglⅡ線性化后分別電轉化畢赤酵母GS115,畢赤酵母的電轉化及轉化子篩選方法參考文獻[15]。獲得酵母轉化子后取單菌落劃線分離后再取單菌落參考文獻[5]的方法搖瓶發酵檢測葡聚糖酶酶活力。

1.2.3 融合酶的純化

離心并收集重組菌發酵上清液。由于融合酶C端帶有His-tag標簽,用鎳柱進行蛋白純化,方法參考文獻[16]。SDS-PAGE及蛋白濃度測定方法均參考文獻[5]。

1.2.4 融合酶酶學性質的測定

酶活力檢測、酶學性質分析等方法均與文獻[6]相同。其中酶活力定義:以大麥葡聚糖為底物,每分鐘分解底物產生的還原糖,其還原力相當于1 μmol葡萄糖所需的酶量,用1 U表示。濾紙纖維素酶檢測方法[17]:將濾紙裁剪成0.5 cm×0.5 cm大小的正方形,在2 mL的離心管中放入2片裁剪好的新華濾紙,加入400 μL的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液和100 μL酶液,在最適溫度、pH的反應條件下反應1 h立即加入750 μL的DNS溶液,沸水浴5 min。每分鐘降解濾紙釋放1 μmol 葡萄糖所需的酶量,定義為一個濾紙纖維素酶活力單位U。

1.2.5 融合酶水解產物的分析

取葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和麥芽六糖混合后用體積分數75%的乙醇配制成10 mg/mL的溶液,作為薄層層析的標準糖溶液。展層溶劑體積比為乙酸乙酯∶冰醋酸∶水=2∶2∶1,顯色劑為1 g二苯胺、1 mL苯胺和5 mL磷酸溶于50 mL丙酮。將融合酶與大麥葡聚糖于75 ℃下進行充分反應,待酶將底物水解徹底后進行薄層層析,操作方法與文獻[6]相同。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的構建

以pPIC9K-eglA6為模板,Peg01、Peg9為引物,擴增獲得1.1 kb左右的片段,與eglA6基因中不含CBD編碼區的片段大小一致。以pUC-CBM為模板,以P901、P902為引物,PCR擴增獲得約0.6 kb的片段,與CBM9編碼區大小一致。上述2個擴增產物與經雙酶切的表達載體pPIC9K混合后進行無縫連接并轉化大腸桿菌后獲得轉化子,提取質粒以EcoR I、NotI雙酶,電泳結果如圖1中泳道2所示。由電泳圖可見,該重組質粒酶切后得到大約9.3 kb和1.7 kb的片段,分別與pPIC9K及片段eglA6-CBM9一致,該質粒命名為pPIC9K-eglA6-CBM9。采用同樣的方法構建重組質粒pPIC9K-eglA6-CBM10,其酶切電泳圖如圖1泳道3所示。以Peg01、Peg02為引物擴增獲得的含完整編碼區的eglA6T片段直接與經雙酶切的載體pPIC9K連接,獲得重組質粒pPIC9K-eglA6T,其酶切電泳圖如圖2泳道1所示。

M1-10 000 bp的核酸Marker;M2-5 000 bp的核酸Marker; 1-重組質粒pPIC9K-eglA6T以EcoR I、Not I雙酶切產物; 2-重組質粒pPIC9K-eglA6-CBM9以EcoR I、Not I雙酶切產物; 3-重組質粒pPIC9K-eglA6-CBM10以EcoR I、Not I雙酶切產物

2.2 重組酵母的構建、融合酶的表達與純化

上述3種重組質粒線性化后電轉化畢赤酵母GS115,在MM平板上篩選轉化子。3種重組質粒的轉化子各任取20個,劃線分離后取單菌落經搖瓶發酵檢測酶活力。結果顯示,重組質粒pPIC9K-eglA6T轉化子的酶活力大約在500～900 U/mL,與韓冰等[5]報道的采用類似方法構建的表達同一條基因的酵母轉化子酶活力基本一致。pPIC9K-eglA6-CBM9轉化子的酶活力大約為150～250 U/mL,pPIC9K-eglA6-CBM10轉化子的酶活力大約在600～750 U/mL。其中pPIC9K-eglA6-CBM9轉化子中編號為11的轉化子發酵酶活力最高,命名為PichiapastorisGS115/pPIC9K-eglA6-CBM9 YL11,簡稱AnEg-CB9 YL11,所表達的融合酶命名為AnEg-CBM9用于后續實驗。質粒pPIC9K-eglA6-CBM10轉化子中酶活力最高的為PichiapastorisGS115/pPIC9K-eglA6-CBM10 YL05,簡稱AnEg-CB10 YL05,所表達的融合酶命名為AnEg-CBM10。質粒pPIC9K-eglA6T轉化子中酶活力最高的為PichiapastorisGS115/pPIC9K-eglA6TYL19,簡稱AnEglA6T YL19,所表達的融合酶命名為AnEglA6T。

上述菌種的發酵上清液按1.2.3節進行純化。純化產物蛋白電泳如圖2所示。用圖像分析軟件Image Lab 4.0對電泳條帶進行推算,結果顯示,AnEg-CBM9和AnEg-CBM10的表觀分子質量分別為81 kDa和59 kDa。含野生酶完整結構的AnEglA6T的表觀分子質量為52 kDa,與本課題組前期研究獲得的AnEglA6的分子質量基本一致[5]。根據核苷酸序列推算,AnEg-CBM9、AnEg-CBM10的理論分子質量分別為62 kDa和43 kDa,AnEglA6T理論分子質量為41 kDa。顯然3種酶的表觀分子質量均明顯高于理論分子質量,這是真核生物分泌表達的常見現象。真核生物的胞外蛋白在分泌表達過程中往往在內質網中被糖基化修飾,因此胞外蛋白的表觀分子質量往往大于理論分子質量。將上述3種純化得到的融合酶分別用于酶學性質的研究。

M-Protein Ladder;1-AnEglA6T;2-AnEg-CBM9; 3-AnEg-CBM10

2.3 酶學性質

2.3.1 融合酶的葡聚糖酶性質

以大麥葡聚糖為底物,在pH值為4.5的條件下,測定60～90 ℃下2種融合酶的相對酶活力,結果如圖3-a所示。這3種酶的催化活性與溫度的關系非常相似,最適溫度均為75 ℃,在90 ℃時只有AnEg-CBM10有酶活力,AnEg-CBM9和AnEglA6T的酶活力幾乎為0。AnEglA6T的性質與韓冰等[5]報道的eglA6基因在巴斯德畢赤酵母中的表達產物AnEglA6的性質基本一致。

在最適溫度75 ℃下,測定pH 3～7 時2種融合酶的相對酶活力。結果如圖3-b所示。2種融合酶活力與pH的關系有一定的差異。AnEglA6T的最適pH值為4,這與韓冰等[5]的報道一致,而融合體酶AnEg-CBM9和AnEg-CBM10的最適pH值分別是4.5和5.0,略有改變。

a-溫度;b-pH

2.3.2 融合酶的穩定性

在各自的最適pH條件下,分別測定了融合酶在75、80、85 ℃下的相對酶活力變化。由圖4可見,3種酶的熱穩定性有相當大的差異。其中,AnEglA6T和AnEg-CBM9的耐熱性十分接近,AnEg-CBM10的熱穩定性顯著高于AnEglA6T和AnEg-CBM9。在85 ℃高溫下,AnEglA6和AnEg-CBM9在保溫1 h后殘余酶活力均只有10%左右,而同樣條件下AnEg-CBM10的殘余酶活力約為30%。進一步檢測顯示,85 ℃下AnEg-CBM10的酶活力半衰期大約為40 min,另兩種酶均不足5 min。在90 ℃下,AnEglA6T和AnEg-CBM9快速失活,大約在5 min后即完全失活。AnEg-CBM10可以短時耐受90 ℃高溫,其90 ℃下的酶活力半衰期大約為7 min。

圖4 融合酶的熱穩定性Fig.4 Thermal stability of fusion enzymes

2.3.3 融合酶水解產物分析

將融合酶與大麥葡聚糖混合反應后檢測反應產物,結果如圖5所示。3種葡聚糖酶與底物反應后的產物為不同分子質量的寡糖,主體產物均比較接近麥芽糖和麥芽三糖,也形成少量分子質量稍大的寡糖。

內切型葡聚糖酶的特點就是產生大量不同分子質量的寡糖,AnEglA6因這一特點被判定為內切型葡聚糖酶[5]。由圖5可知,融合酶AnEg-CBM9和AnEg-CBM10的水解產物與AnEglA6基本相同,可見AnEg-CBM9和AnEg-CBM10也是內切型葡聚糖酶。

M-標準糖溶液(葡萄糖、麥芽二糖、麥芽三糖和麥芽六糖的混合 溶液);1-AnEglA6T的水解產物;2-AnEg-CBM9的水解產物; 3-AnEg-CBM10的水解產物;箭頭所指處為5 g/L大麥葡聚糖

2.3.4 融合酶的底物特異性

在最適條件下,將2種融合酶分別與10 g/L的不同底物反應并測定比酶活力,結果如表1所示。與野生型酶AnEglA6T相比,兩種融合酶的底物特異性有明顯的變化。大麥葡聚糖和燕麥葡聚糖為底物時,3種酶的比酶活力基本一致。以地衣多糖為底物時,兩種融合酶的比酶活力均比野生型酶AnEglA6有較大幅度的下降。以CMC-Na為底物時,兩種融合酶的比酶活力明顯高于AnEglA6T,其中AnEg-CBM10的比酶活力幾乎達到AnEglA6T的2倍。內切型β-1,3-1,4-葡聚糖酶的特點是水解葡聚糖分子內部β-1,4-糖苷鍵,但優先水解與1,3-鍵相鄰的β-1,4鍵[1],因此這一類酶對β-1,3-鍵豐富的地衣多糖具有更高的水解效率,而對只有β-1,4-鍵的CMC-Na水解效率較低。由表1可知,3種酶以地衣多糖為底物時比酶活力最高,而以CMC-Na為底物時的活性較低,結合前文對水解產物的研究結果可知,3種酶均具有內切型β-1,3-1,4-葡聚糖酶的特點,但是它們對不同底物的水解效率又表現出明顯的差異。兩種融合酶的一個特點是對地衣多糖的水解活性明顯低于AnEglA6T,而對CMC-Na的活性又明顯高于AnEglA6T,可見β-1,3-鍵對兩種融合酶的影響相對較小。兩種融合酶的另一個特點是其底物范圍明顯擴大,均對微晶纖維素表現出明顯的水解活性,具有纖維素酶的特點,這顯然是纖維素結合結構域賦予融合酶的新功能。同時,這兩種融合酶還獲得了水解酵母葡聚糖和茯苓多糖的能力,這是一個意外的結果,因為提供催化結構域的AnEglA6和提供纖維素結合結構域的兩種木聚糖酶均不具有水解β-1,3型葡聚糖的能力。兩種融合體酶對木聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖等非葡萄糖單元構成的多糖沒有表現出水解活性,由此推測融合體酶可能只限于水解葡萄糖單元構成的底物。以濾紙為底物對兩種融合體酶的反應條件進行檢測,結果顯示,AnEg-CBM9和AnEg-CBM10的最適溫度均為60 ℃,最適pH值分別為5.5和6.0。進一步以纖維素酶為依據檢測融合酶的熱穩定性,結果與采用葡聚糖酶為依據獲得的結果基本一致。實驗結果看,融合體酶在高溫下對結晶型纖維素的催化活性顯著下降,但這一變化與酶的高溫失活并不存在必然關系。

表1 底物特異性分析Table 1 Substrate specificity analysis

2.3.5 融合酶結構變化影響催化活性改變的初步分析

利用I-Tasser對融合酶進行同源建模,底物口袋使用網站POCASA 1.1進行預測,結果如圖6所示。淺灰色區域為蛋白結構部分,深灰色區域為預測的蛋白質底物口袋。初步測算顯示兩種融合體酶的底物結合口袋顯著大于AnEglA6T,這可能間接說明了這3種酶對底物利用能力的改變。融合酶AnEg-CBM9的結合結構域CBM9也顯示了兩個可能的底物結合口袋,如圖6箭頭所指,這可能證明了CBM的不同改變了重組蛋白的結構,賦予了融合酶一些新的功能[18]。在上述同源建模的基礎上可以進一步預測可能的催化反應的配體以及與配體結合的氨基酸殘基位點,結果如圖7及表2所示。

a-AnEglA6T;b-AnEg-CBM9;c-AnEg-CBM10

表2 融合酶配體名稱及配體結合位點殘基Table 2 Ligand names and ligand binding site residues of fusion enzymes

所預測結果中,AnEglA6T與AnEg-CBM10的預測的最適配體均為β-1,4-D-葡聚糖,與配體結合的氨基酸殘基均為6個,其中僅有一個殘基不同,由His100變為了ASN99。AnEg-CBM9的預測的最適配體為纖維三糖。從結構分析結果看,兩種融合體酶的催化活性中心均與AnEglA6T有差異,這在一定程度上解釋了融合體酶底物范圍發生變化的原因。AnEg-CBM9預測的活性中心變化更大,顯示其底物特異性發生變化的可能性也較大,這與表1所列底物特異性分析結果基本相符,AnEg-CBM9對微晶纖維素、茯苓多糖等新底物的活性顯著高于AnEg-CBM10。上述預測結果與實驗結果也有一定的差異,例如兩種融合體酶預測的所有配體中均沒有β-1,3-葡聚糖。結構預測與實驗結果之間出現差異的一個重要原因可能是酵母表達的酶有糖基化修飾但規律尚不完全清楚,因此分析時還難以考慮這方面的影響。

3 討論

本文將不同來源的纖維素、木聚糖等多糖水解酶類的碳水化合物結合結構域更換黑曲霉耐熱型葡聚糖酶AnEglA6T本身的纖維素結合結構域,篩選到兩種保留了較高葡聚糖水解活性的融合體酶,AnEg-CBM9和AnEg-CBM10。檢測結果表明這兩種酶都具有明顯的水解微晶纖維素的能力,并且對濾紙的水解能力也有大幅度提高,可見CBM結構域對葡聚糖酶能否水解結晶型纖維素具有關鍵性的作用。本文最有價值的研究結果是發現AnEglA6的CBD被來源于熒光假單胞菌的木聚糖酶的CBM10取代后得到的融合體酶AnEg-CBM10的熱穩定性相較于AnEglA6T有顯著的提高。AnEg-CBM10在85 ℃下半衰期達到40 min左右,而AnEglA6T在同樣條件下半衰期不足5 min,同一條基因在乳酸克魯維酵母中的表達產物AnEglA6K在85 ℃下半衰期大約為15 min[5]。本文構建AnEg-CBM9的CBM9來源于極端嗜熱菌C.kristjanssonii,但獲得的融合體酶的耐熱性并沒有提高,這可能是由于CBM9的分子過大。有研究發現,較大的CBM在改善融合體的熱穩定性方面并不具有優勢[19]。較大的 CBM 內部通常包含多個較小的串行子模塊,這些子模塊具有不同的功能[20],后續研究可以考慮分別選取CBM9的部分模塊來構建融合體,進一步探索獲得高穩定性葡聚糖酶的方法。與之相反,CBM10來源于假單胞菌,本身并不具有優越的耐熱性,但獲得的融合體AnEg-CBM10的熱穩定性卻有顯著的提高,這也在一定程度上說明較小的CBM可能更有利于耐熱酶的構建。通過添加或更換CBM提高酶的耐熱性的研究已有報道,THONGEKKAEW等[21]將來自于里氏木霉的纖維素酶的CBD融合到隱球酵母的脂肪酶的羧基端,融合酶在80 ℃保溫2 h還具有80%的活性,而野生酶在80 ℃下保溫30 min就幾乎完全失活。王春娟等[22]將來自海棲熱袍菌的CBM27與宇佐美曲霉來源的β-甘露聚糖酶(Au Man5A)進行融合,使后者的熱穩定性提高了8 ℃。從文獻報道的研究結果看,融合體酶的耐熱性有時比兩種供體來源的酶更加耐熱,本文獲得的AnEg-CBM10也具有這一特點,因此利用CBM探索構建耐熱型融合體酶時不一定要局限于使用耐熱酶來源的CBM。

4 結論

本文將真菌高耐熱葡聚糖酶AnEglA6催化結構域與熒光假單胞菌P.fluorescens的纖維素結合結構域CBM10融合獲得的融合體酶AnEg-CBM10在85 ℃下酶活力半衰期達到40 min,能短時耐受90 ℃高溫,并且對結晶型纖維素也有一定的水解能力,與AnEglA6相比,融合體酶在禽類飼料加工中具有更大的應用潛力。