全蛋液微波巴氏殺菌動力學及蛋白質變化研究

孫孟琦,楊化宇,閆博文*,張娜娜,范大明

1(江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇 無錫,214122)2(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

全蛋液的傳統巴氏殺菌過程主要以傳導加熱為主,為保證管路中心達到蛋液殺菌溫度,會導致管壁區域物料的過度加熱并造成熱量冗余。高強度熱處理會使全蛋液中熱敏性蛋白質變性,致使全蛋液的功能特性受損、品質劣變。此外,管路內部溫度梯度方向也加劇了管路結焦現象的發生,從而導致管路清洗難度增大和能效降低等問題。在保障微生物安全性的前提下,降低熱敏蛋白質在巴氏殺菌處理過程中的熱損傷程度,對全蛋液的加工及在食品領域中的應用尤為重要。

微波作為一種新型的物理場加工方式,憑借其體積式靶向加熱原理,能夠實現無需傳熱介質的選擇性加熱過程,在縮短熱處理時間的同時可以針對性的改善傳統巴氏殺菌方法的缺陷。微波的冷熱點現象一直是影響其進一步應用與發展的障礙。連續式微波熱處理通過改善內部電磁場分布情況,可以有效改善溫度分布均勻性,減少熱失控[1-2]。目前連續式微波巴氏殺菌技術的研究多集中在牛奶和果汁上,盡管在一定程度上證明了其商業可行性,但連續式微波巴氏殺菌技術的產業化應用還處于起步階段,鮮有適用于流體食品的實驗室或工業規模的連續式微波處理系統;針對不同類型食品的微波巴氏殺菌方法的工藝開發并不充分;亦缺乏全蛋液的連續式微波殺菌的研究,對于殺菌效果和熱敏蛋白質的影響還需要進一步探究[3]。

因此,本研究首先構建了全蛋液的連續式微波巴氏殺菌系統,探究了不同微波功率-溫度組合下的微生物致死效果、微波殺菌動力學及全蛋液蛋白質變化,全蛋液微波巴氏殺菌的研究有助于解決傳統巴氏殺菌方法的痛點,為工業生產提供導向性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

全蛋液,蘇州歐福蛋業股份有限公司;生雞蛋,北京正大蛋業有限公司;大腸桿菌CGMCC1.8745、金黃色葡萄球菌CGMCC1.1861、沙門氏菌CICC21482,保藏于江南大學生物技術中心。

1.1.2 試劑

去離子水,無錫華晶飄之霖有限公司;Tris、甘氨酸、8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS),國藥集團化學試劑有限公司;DTNB,美國西格瑪奧德里奇有限公司;BCA蛋白濃度增強型測定試劑盒,賽默飛世爾科技有限公司;LB、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(violet red bile agar,VRBA)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽(xylose lysine desoxycholate,XLD)、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptone soy broth,TSB)培養基,青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-3600紫外分光光度計,日本Shimazu公司;F-7000熒光光譜儀,美國HORIBA公司;FX36型高速乳化均質機,德國弗魯克公司;XO-SM400微波反應體系,南京先歐儀器制造有限公司;WT600-2J蠕動泵,蘇州諾方科精密設備有限公司;FOT-L-SD光纖溫度傳感器,加拿大FISO公司;MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋,三洋電子有限公司;BSC-1000 A2生物安全柜,蘇州安泰空氣技術有限公司;HWS-150型恒溫恒濕培養箱,上海森信實驗儀器有限公司;ZQZY-HC型振蕩培養箱,上海知楚儀器。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋液原料制備

活化后菌液離心5 min(6 000×g,4 ℃),菌泥重新懸浮于全蛋液中,使樣品中的菌體濃度達到107～108CFU/mL,用于殺菌實驗。用低速攪拌器對生雞蛋進行均質處理,過80目篩網除雜,得到新鮮均一的全蛋液用于品質特性實驗。

1.3.2 微波巴氏殺菌系統構建

如圖1所示,體系主要包括:原料桶、磁力攪拌器、蠕動泵、微波腔體(0.5 m×0.5 m×0.5 m)、4個矩形波導及磁控管、硅膠管、溫度傳感器、水浴鍋、酒精燈等。管路內徑為0.010 m,外徑為0.015 m,螺旋管匝數為3.5,直徑為0.130 m,螺距為0.030 m。微波腔內管路的有效長度為2.56 m。為了建立微波加熱的穩態流動條件,全蛋液在體系中預循環一段時間后開啟微波,通過調節流速和微波功率使蛋液達到所需殺菌溫度(56、60、64 ℃),腔體出口處設置取樣點,當蛋液達到所需溫度時立即取樣,迅速置于水浴鍋中密封保溫處理(1、2、3 min),隨后置于冰水浴中冷卻。試驗中所使用的器材均經過滅菌處理,取樣處放置酒精燈保證無菌環境,所有接種、涂布等操作步驟均在生物安全柜中進行。6組微波巴氏殺菌條件LPT 56 ℃、LPT 60 ℃、LPT 64 ℃、HPT 56 ℃、HPT 60 ℃和HPT 64 ℃對應流速分別為0.146、0.131、0.119、0.292、0.263、0.239 m/s。低功率微波巴氏殺菌(low power treatment,LPT)和高功率微波巴氏殺菌(high power treatment,HPT)分別指實驗所用微波功率密度8 W/mL和16 W/mL,56、60、64 ℃指殺菌溫度,例如LPT 56 ℃指的是在8 W/mL的微波功率密度下使蛋液樣品達到56 ℃的處理條件,RAW指未處理全蛋液。

圖1 微波巴氏殺菌系統原理圖Fig.1 Schematic diagram of the microwave pasteurization system

1.3.3 微生物培養與計數

根據GB 4789.1—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 總則》進行微生物的培養與計數,培養基選擇:大腸桿菌-VRBA;沙門氏菌-XLD;金黃色葡萄球菌-TSB。

1.3.4 殺菌動力學

殺菌動力學的計算如公式(1)～公式(4)所示:

Log-Logistic模型[4]:

(1)

Log-linear+Shoulder模型[5]:

(2)

Log-linear+Tail模型[6]:

log10(N)=log10{[10log10(N0)-10log10(Nres)]× e(-kmax×t)+10log10(Nres)}

(3)

用均方根誤差(root mean square error,RMSE)和R2來評價殺菌動力學模型的預測優度:

(4)

式中:α,曲線上漸近線,lg CFU/mL;ω,曲線下漸近線,lg CFU/mL;σ,最大失活速率,min-1;τ,最大失活速率對應殺菌時間的對數值;kmax,曲線對數線性部分的失活率,min-1;Sl,肩長,min;log10(N0),初始菌群預測對數,CFU/mL;log10(Nres),剩余菌群預測對數,CFU/mL;n,觀測值的數量,個。

1.3.5 溶解度測定

樣品離心15 min(10 000×g,4 ℃),取上清液和原樣進行蛋白質含量測定,溶解度的計算如公式(5)所示[7]:

(5)

1.3.6 內源熒光光譜測定

首先用PBS(0.01 mol/L,pH 7.2)將樣品稀釋到0.5 mg/mL。激發和發射波長分別設定為280、300～500 nm,狹縫寬5 nm,掃描速度1 200 nm/min。PBS(0.01 mol/L,pH 7.2)作為空白對照[8]。

1.3.7 表面疏水性測定

用ANS熒光探針法對表面疏水性進行測定,用外源熒光強度大小來表示疏水性大小。取40 μL的8.0 mmol/L ANS溶液加入4 mL的稀釋后的樣品溶液中。室溫下避光孵育20 min后進行熒光掃描。激發及發射波長分別為390、400 nm,狹縫寬5 nm,掃描速度1 200 nm/min[9]。

1.3.8 游離巰基含量測定

將樣品與Tris-甘氨酸緩沖液以體積比1∶3混勻,加入40 μL Ellman試劑混勻,25 ℃水浴保溫30 min后測定吸光度。Ellman試劑用作空白對照[10],游離巰基含量測定的計算如公式(6)所示:

(6)

式中:A412為412 nm處吸光度;ρ為樣品質量濃度,mg/mL;D為稀釋倍數。

1.4 數據分析

每項實驗至少重復3次,數據以均值±標準差的形式記錄。使用Origin 2018C進行繪圖,SPSS 21.0進行統計分析。使用Duncan’s multiple range test分析實驗數據之間的顯著性差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 微波巴氏殺菌動力學分析

螺旋連續式微波巴氏殺菌系統可以避免因電磁場分布不均勻和微波穿透深度短引起的加熱不均勻現象,有效改善傳質傳熱速率和溫度分布均勻性,實現對全蛋液的均勻高效加熱[11-12]。微波巴氏殺菌升溫迅速,可在50 s內到達穩態(圖2)。不同微波巴氏殺菌條件下大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的存活率分別降低3.84～5.85 log10、4.11～6.19 log10和3.11～5.54 log10。金黃色葡萄球菌對巴氏殺菌處理的抗性略高于大腸桿菌和沙門氏菌,可能與革蘭氏陽性和陰性細菌在結構和細胞壁分子組織上的差異有關,革蘭氏陽性菌細胞壁上較厚的肽聚糖結構可以抑制失活[13]。

圖2 微波巴氏殺菌處理升溫曲線Fig.2 Temperature-rising curve of microwave pasteurization treatments

傳統一級線性動力學模型只與時間相關,認為存活曲線呈線性趨勢,然而非等溫微波巴氏殺菌過程中,存活曲線呈現明顯的非線性趨勢(圖3),這會導致使用線性模型擬合可能發生致死率過高或過低程度的預測,不能準確描述微生物的失活行為,因而本文使用3種非線性模型進行回歸擬合分析[4-5]。圖4～圖6可以看出,Log-Logistic模型具有最好的擬合精度和穩定性(R2:0.998～0.999,RMSE:0.002～0.072),其次是Log-linear+Tail模型(R2:0.982～0.999,RMSE:0.026～0.298),Log-linear+Shoulder模型擬合效果相對較差(R2:0.980～0.999,RMSE:0.041～0.314)。本研究中存活曲線出現輕微拖尾現象,可能是由于較高耐熱性的微生物細胞亞群的存在[14-15]。

a-大腸桿菌;b-沙門氏菌;c-金黃色葡萄球菌

a-大腸桿菌;b-沙門氏菌;c-金黃色葡萄球菌

a-大腸桿菌;b-沙門氏菌;c-金黃色葡萄球菌

a-大腸桿菌;b-沙門氏菌;c-金黃色葡萄球菌

2.2 微波巴氏殺菌對全蛋液蛋白質的影響

2.2.1 微波巴氏殺菌對蛋白質溶解度的影響

如表1所示,相較于未處理樣品,微波巴氏殺菌并未使全蛋液的蛋白質溶解度降低。LPT處理下,蛋白質溶解度顯著提高(P<0.05),功率密度相同處理溫度不同的組別溶解度無顯著差異(P>0.05),HPT處理下樣品溶解度略低于LPT處理,但與未處理樣品相比溶解度無顯著差異(P>0.05)。

表1 微波巴氏殺菌全蛋液蛋白質溶解度Table 1 Solubility of proteins in liquid whole egg under microwave pasteurization treatments

2.2.2 微波巴氏殺菌對蛋白質結構的影響

蛋白質熒光光譜圖的變化有效表征其三級結構的變化。內源熒光光譜利用蛋白質自身具有的發色基團來檢測熒光強度的變化[16],微波處理后樣品的最大波長藍移,表明微波處理影響了內部微環境的極性(圖7)。微波處理后全蛋液樣品的熒光強度降低,可能是由于微波促使蛋白質分子內部包埋的色氨酸殘基暴露在強極性水溶液中,微環境極性增加,激發態和基態顯色基團的能量受影響,從而造成本征熒光強度降低。

圖7 微波巴氏殺菌全蛋液蛋白質內源熒光光譜Fig.7 Endogenous fluorescent spectrometry of proteins in liquid whole egg under microwave pasteurization treatments

2.2.3 微波巴氏殺菌對蛋白質表面疏水性的影響

如圖8所示,微波巴氏殺菌處理后全蛋液樣品的外源熒光強度增加,說明微波巴氏殺菌處理促進了蛋白質分子展開,埋藏在分子內部的疏水鏈暴露,表面疏水性增加,有利于功能特性的改善[17]。

圖8 微波巴氏殺菌全蛋液蛋白質表面疏水性Fig.8 Surface hydrophobicity of proteins in liquid whole egg under microwave pasteurization treatments

2.2.4 微波巴氏殺菌對巰基含量的影響

巰基在蛋白質的凝膠、泡沫等特定結構的形成中起重要作用[7]。與未處理樣品相比(表2),微波巴氏殺菌處理后的全蛋液樣品巰基含量呈上升趨勢,隨著微波功率和處理溫度的增加,巰基含量整體呈增加趨勢(P<0.05)?？赡苁怯捎谖⒉ò褪蠚⒕幚硎沟鞍踪|去折疊或離子化程度有所增加,游離巰基暴露,巰基含量增加[18-19]。

表2 微波巴氏殺菌全蛋液蛋白質巰基含量Table 2 Sulfhydryl contents of proteins in liquid whole egg under microwave pasteurization treatments

3 結論與討論

本文研究了全蛋液的微波巴氏殺菌,探究了不同微波功率-溫度組合下的微生物致死效果、微波殺菌動力學及全蛋液蛋白質變化,具體內容如下:

a)微波巴氏殺菌升溫時間短,可以有效縮短全蛋液在巴氏殺菌過程中的非等溫加熱滯后期。通過對微波功率密度及殺菌溫度的調控,微波巴氏殺菌可以使大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌存活率降低5 log10以上,殺菌效果顯著。

b)非線性模型是擬合非等溫微波巴氏殺菌過程的有效模型(R2≥0.980,RMSE≤0.314)。Log-Logistic模型擬合精度和穩定性最好,Log-linear+Tail模型擬合效果好且變量少。模型擬合結果與存活曲線趨勢呈現良好的一致性,進一步證明非線性模型的準確性和有效性。

c)微波誘導蛋白質分子適度展開,更多帶電和極性基團暴露,溶解度有所提高,游離巰基含量增加,有利于全蛋液品質特性的改善。

微波巴氏殺菌針對性地彌補了全蛋液傳統巴氏殺菌方法的缺陷,通過降低高溫處理時間和熱加工程度,減少全蛋液在熱敏溫度下的停留時間,降低蛋白質熱損傷程度,有助于全蛋液品質的改善以及在食品加工領域的進一步應用。全蛋液微波巴氏殺菌的研究有助于解決傳統巴氏殺菌方法的痛點,為工業生產提供導向性。連續式微波加熱模式的開發以及在全蛋液殺菌領域中的應用,對黏稠態熱敏性流體食品高效微波熱處理技術的開發具有重要意義。