苯乳酸與DNA相互作用及其抑菌機制研究

賈以澤,舒泉先,叢瑞濤,毛銀,周勝虎*,鄧禹*

1(江南大學 糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122)2(江南大學 江蘇省生物活性產品 加工工程研究中心,江蘇 無錫,214122)3(山東渤海實業集團有限公司 山東省油脂油料精深 加工技術重點實驗室,山東 濱州,256599)

苯乳酸(phenyllactic acid, PLA)又稱3-苯基乳酸/β-苯基乳酸,分子式為C9H10O3,是一種天然有機酸,首次于蜂蜜中鑒別出來,后被發現廣泛存在于奶酪、泡菜、酸面團等發酵食物中[1]。PLA主要是由乳酸菌合成,如植物乳桿菌[2]、魯氏乳桿菌[3]、乳酸片球菌[4]和布氏乳桿菌[5]等。此外,一些非乳酸菌菌株也具有合成PLA的能力,如凝結芽孢桿菌[6]、丙酸桿菌[7]和白地霉[8]。在微生物合成PLA途徑中,L-苯丙氨酸經脫氨被催化為苯丙酮酸,然后再經乳酸脫氫酶加氫還原,生成PLA[9]。PLA對包括細菌和真菌在內的許多微生物具有廣泛的抑菌作用[10],是天然的高效、無毒害作用的生物防腐劑。與以山梨酸鉀和苯甲酸鈉為代表的傳統化學防腐劑相比,PLA具有更安全、更高效的優勢,是未來食品工業應用的趨勢[11]。PLA由于其親水性而具有良好的水溶性,使其能夠在食物系統中進行均勻擴散[12],而且PLA在酸性和高溫環境下性質依然不容易改變[13]。因此,PLA在食品和飼料工業中有廣泛的應用。例如,PLA應用于乳制品行業抑制李斯特氏菌的生長,能夠延長乳制品的保質期[14]。再者,PLA還可以抑制腸道沙門氏菌的生長,這是許多食源性細菌性疾病的主要病原體,也是許多動物性食品污染的原因,如雞蛋、牛肉、家禽和豬肉[15]。正因PLA在抑菌方面出色的性能,其抑菌機理引起了學者們的極大關注。

作為一種有潛力的防腐劑和抗菌劑,研究人員已經從細胞和分子水平上研究了PLA的抗菌機理。到目前為止,已發現PLA通過與多種靶點相互作用來抑制有害微生物的生長,主要包括對細胞壁、細胞膜和核酸的破壞作用[16]。黃云坡等[17]通過掃描電子顯微鏡在微觀結構上觀察到經PLA脅迫后的單增李斯特菌細胞形態發生變形,且細胞表面出現孔洞,證實了PLA的作用靶點之一是細胞壁。ZHOU等[18]通過凝膠阻滯實驗驗證了PLA能夠通過與DNA結合破環DNA的結構。本研究在此基礎上,利用熒光光譜方法,結合分子對接技術,系統分析了PLA與DNA的相互作用模式,并確定了兩者之間的相互作用力。此外,為了驗證PLA在胞內與DNA結合帶來的基因轉錄變化,通過轉錄組測序對比了乳酸片球菌DY15在PLA脅迫下基因表達差異,挖掘了PLA作用的相關靶基因,探討了PLA通過與DNA作用引起基因調控變化的抑菌機制,為PLA作為抗菌劑在食品領域的應用提供了理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸片球菌DY15于37 ℃、180 r/min條件下在MRS培養基中生長。培養基成分為20 g/L葡萄糖、8 g/L牛肉提取物、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L CH3COONa、4 g/L酵母提取物、2 g/L檸檬酸三銨、2 g/L K2HPO4、0.58 g/L MgSO4·7H2O、0.19 g/L MnSO4·H2O和1 mL/L吐溫80,pH 6.5。加入20 g/L的瓊脂粉即為固體培養基。L-PLA,國藥沃凱公司;小牛胸腺DNA(ctDNA),Sigma-Aldrich公司,純度檢測符合要求A260/A280>1.8,用Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)配制ctDNA母液,根據260 nm處的吸光度測定其終濃度為2.5 mmol/L[ε260nm=6 600 L/(mol·cm)]。L-PLA于雙蒸水中溶解,終濃度為1 mmol/L,于4 ℃保存。其他試劑均為分析純。

F-7000熒光分光光度計,日本日立公司;UV-1800紫外分光光度計,日本島津公司;迷你金屬浴,上海生工生物工程有限公司;ZQZY-CF9.9振蕩培養箱,上海知楚儀器有限公司;LightCycler 480 II熒光定量PCR儀,上海羅氏制藥有限公司。

1.2 PLA與DNA相互作用的測定

1.2.1 熒光光譜的測定

在7份Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)體系中,加入L-PLA母液和ctDNA母液,并定容至1 mL,使PLA終濃度為5×10-5mol/L,ctDNA終濃度分別為0、4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6、24×10-6mol/L,在298 K恒溫水浴中充分混合10 min,得到PLA-ctDNA二元體系。使用熒光分光光度計對二元體系進行熒光光譜掃描,熒光光譜的激發波長為260 nm,發射波長范圍為270～400 nm,狹縫寬度為5 nm,掃描速度為100 nm/min,石英電池的路徑長度為1 cm。改變水浴鍋溫度條件分別為310 K和320 K,并重復上述實驗,以獲得不同溫度下的熒光光譜。

1.2.2 KI猝滅實驗

取ctDNA(2×10-5mol/L)和L-PLA(5×10-5mol/L)-ctDNA(2×10-5mol/L)溶液,分別加入KI溶液,使KI的終濃度分別為0、0.002、0.006、0.008、0.01 mol/L。充分混合5 min 后,使用1.2.1節中的方法在室溫下進行光譜掃描。

1.2.3 DNA熔解曲線的測定

將ctDNA(2×10-5mol/L)和L-PLA(5×10-5mol/L)-ctDNA(2×10-5mol/L)溶液分別置于20～95 ℃的環境中,每5 ℃設為1個梯度。10 min后,快速取出溶液并于紫外分光光度計中測量DNA的吸光度A258nm。根據公式(1)計算。

(1)

式中:A0,20 ℃時的A258nm,Af,95 ℃下的A258nm,A,實時溫度下的A258nm。通過計算不同溫度下的fss值,得到fss關于溫度的曲線,在fss=0.5時對應的溫度即為DNA的Tm。

1.3 PLA與DNA的分子對接模擬

使用AutoDock 4進行分子對接模擬,在ZINC小分子化合物數據庫中下載L-PLA的晶體結構文件(ZINC ID:388089)。在蛋白質數據庫中為ctDNA選擇了晶體結構d(CGATCG)2(PDB ID:1nab)。先使用AutoDock 4對二者進行預處理(去水、加氫和添加電荷)。分子對接位置的活性區域包含整個DNA分子,活性區域大小為40 ?×40 ?×160 ?,晶格步長為160 ?,采用拉馬克遺傳算法(Lamarckian genetic algorithm,LGA)全面搜索可能的構象和結合位點,結合能最低的結構被認為是最佳的相互作用模式。

1.4 轉錄組測序與實時熒光定量PCR驗證

將過夜培養的乳酸片球菌DY15以2%的比例分別接種于10 mL MRS液體培養基和10 mL MRS(含2 g/LL-PLA)液體培養基中,培養8 h后,收集菌體送至蘇州金唯智生物技術公司進行轉錄組測序與基因注釋。進行實時熒光定量PCR實驗時,取上述菌體,通過Ultrapure RNA試劑盒(康為世紀)提取總RNA。使用HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis試劑盒(康為世紀)將總共500 ng的總RNA逆轉錄成cDNA。然后在LightCycler 480 Ⅱ qPCR儀上進行熒光定量PCR實驗。選取16S rRNA基因作為內參,并進行3次生物學重復。所有數據均采用2-ΔΔCt方法進行分析。具體引物序列見電子版增強出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035182)。

2 結果與分析

2.1 熒光光譜法研究PLA與DNA的相互作用

2.1.1 ctDNA對PLA的熒光猝滅模型

圖1顯示了PLA隨著ctDNA濃度的增加而產生的熒光發射光譜。PLA在260 nm處被激發后,在290 nm處有一個很強的熒光發射峰,隨著DNA濃度的提高,PLA的熒光強度顯著降低。結果表明,DNA能與PLA相互作用,猝滅PLA的特征熒光。

圖1 添加ctDNA后PLA的熒光猝滅變化Fig.1 Changes in fluorescence quenching of PLA after the addition of ctDNA

為了研究DNA對PLA的熒光猝滅機理,用Stern-Volmer方程[19]F0/F=1+Kqτ0[DNA]=1+Ksv[DNA]進行數據處理。其中,F0和F為PLA在無猝滅劑和有猝滅劑(DNA)存在時的穩態熒光強度;Kq為生物分子的猝滅速率常數;τ0為沒有猝滅劑的熒光團的平均壽命,它的值是10-8s;[DNA]為猝滅劑的濃度;Ksv為Stern-Volmer猝滅常數。

圖2顯示了Stern-Volmer方程擬合的F0/F與CctDNA的關系曲線。由該曲線的斜率可以得到PLA在ctDNA體系中的猝滅常數Kq和Ksv。數據表明,Ksv隨著溫度的升高而降低,這表明猝滅不是由碰撞引起的,而是由絡合物的形成引起的。此外,如表1所示,猝滅速率常數Kq遠大于2×1010L/(mol·s),這是各種猝滅劑與生物聚合物的最大散射碰撞猝滅常數。這些證據表明PLA-ctDNA的熒光猝滅機制是靜態猝滅而不是動態猝滅。

圖2 不同溫度下ctDNA對PLA熒光猝滅的 Stern-Volmer擬合直線Fig.2 Stern-Volmer plots for ctDNA quenching of PLA fluorescence at different temperatures

2.1.2 結合常數與結合位點數

根據Lineweaver-Burk對數方程lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlg[DNA][20],確定了PLA與ctDNA的結合常數Ka與結合位點數n。

由線性擬合方程式的截距得Ka,斜率為n(圖3),不同溫度下的Ka與n的計算數值列于表1。在不同溫度下,PLA和ctDNA的結合位點數均大于1,表明在ctDNA上至少有一個PLA結合部位。此外,結合位點數隨著溫度的升高而降低,Ka也隨溫度的升高而降低,與Ksv對溫度的依賴關系一致。這表明,升高溫度不利于PLA的結合。由于本文的實驗溫度遠低于ctDNA的Tm值,ctDNA應始終保持雙螺旋結構。因此,Ka隨溫度升高而降低的原因不是由于ctDNA的變性,而是PLA與ctDNA的結合過程是放熱反應,溫度升高,反應平衡左移,結合常數減小。T=298 K時,Ka值為8.57×104,而經典DNA嵌入劑溴化乙啶的結合常數Ka=1.4×106,證明PLA結合能力低于溴化乙啶。

圖3 不同溫度下ctDNA對PLA熒光猝滅的 Lineweaver-Burk擬合直線Fig.3 Lineweaver-Burk plots for ctDNA quenching of PLA fluorescence at different temperatures

2.1.3 熱力學參數與作用力的測定

配體-DNA相互作用的確切模式通常通過熱力學表征來確定。從本質上講,氫鍵、范德華力、靜電力及疏水作用等作用力在DNA和配體之間的相互作用中發揮著主要作用。PLA與DNA結合反應的熱力學參數可以確定主要的結合力與反應的自發性。根據從光譜方法獲得的數據,使用公式(2)、公式(3)計算熱力學參數(ΔH,ΔS, ΔG):

(2)

ΔG=ΔH-TΔS

(3)

表1總結了ΔH,ΔS和ΔG的值。ΔG<0表明結合過程是自發的。已知當ΔH≈0或ΔH<0且ΔS>0時,靜電引力為主要作用力;當ΔH>0且ΔS>0時,疏水作用力發揮主要作用;當ΔH<0且ΔS<0 時,主要的作用力為范德華力和氫鍵作用[21]。結論表明ΔH<0和ΔS<0,這說明PLA與DNA的結合過程中既有氫鍵作用,也有范德華力?？傊?通過熒光光譜實驗對PLA-ctDNA之間相互作用研究發現PLA能夠自發通過氫鍵作用力和范德華力結合到ctDNA上,且至少存在1個結合位點。

表1 PLA-DNA體系在不同溫度下的猝滅常數和熱力學參數。Table 1 Quenching constants and thermodynamic parameters for PLA-DNA system at different temperatures.

2.2 PLA與DNA結合方式的測定

DNA雙螺旋結構中的大溝、小溝及磷酸骨架、堿基對等部位是配體小分子常見的識別位點。配體與DNA的非共價結合的作用模式主要有3種:靜電結合(通過靜電作用吸附到DNA外部的磷酸骨架)、溝槽結合(結合到DNA的大溝或小溝的堿基邊緣)和插嵌結合(插入DNA內部的堿基對之間)。通過非共價結合往往能夠導致許多生物效應,比如抑制DNA的正常復制與轉錄。

2.2.1 KI猝滅實驗

KI是研究小分子與DNA結合方式的常用陰離子猝滅劑。它能有效地猝滅小分子的熒光,根據DNA存在和不存在時熒光的變化,可以推斷DNA與小分子的相互作用模式。如果PLA在溝槽中與DNA結合,則結合DNA溝槽中的PLA的Ksv應大于游離PLA的Ksv。這是因為結合的PLA會被暴露在溶劑中,其熒光很容易被陰離子猝滅劑在溝槽中猝滅。相反,插入到DNA堿基對中的PLA的Ksv值應該低于自由小分子的Ksv,因為DNA的雙螺旋可以保護結合的分子不受陰離子猝滅劑的影響。圖4顯示了KI在PLA和PLA-ctDNA體系中的猝滅行為。結果表明,兩者的Ksv值分別為154、135 L/mol,說明ctDNA的雙螺旋結構對PLA的猝滅起到了保護作用。因此,PLA與ctDNA的相互作用模式應為插嵌結合。

圖4 在不存在和存在ctDNA的情況下,KI對PLA的 Stern-Volmer的擬合直線Fig.4 Stern-Volmer plots of PLA by KI in the absence and presence of ctDNA

2.2.2 PLA對ctDNA熔點的影響

配體小分子以插嵌方式與DNA結合可提高雙螺旋結構的穩定性,使DNA的Tm值提高,但非插嵌結合對DNA熔點影響較小。通過繪制熔解曲線能夠進一步確定PLA-ctDNA的相互作用模式,根據公式(4)計算不同溫度下的fss值,得到fss關于溫度的曲線,在fss=0.5時對應的溫度即為DNA的Tm。

(4)

結果如圖5所示,PLA與DNA結合時,Tm值約為80 ℃,相比于純ctDNA體系的Tm值提高了約7 ℃,這說明PLA的嵌入增強了雙螺旋結構的穩定性。通過上述兩個實驗驗證,證實了PLA是以插嵌的方式與DNA結合。

圖5 在不存在和存在PLA的情況下,ctDNA的熔解曲線Fig.5 Melting curve of ctDNA in the absence and presence of PLA

2.3 分子對接模擬PLA與DNA相互作用

分子建?？梢愿玫乩斫馀潴w和受體之間的相互作用。在這項研究中,使用AutoDock 4程序,驗證PLA與選定的DNA片段的結合模式。由于蛋白質數據庫(Protein Data Bank,PDB)中沒有ctDNA的結構信息,而B型雙鏈DNA的結構是其主要形式,因此選擇d(CGATCG)2序列代替ctDNA。通過LGA遺傳算法,在得到的50個對接模擬結果中,選擇能量相對較低、結合次數最多的構象作為PLA與DNA結合的最佳構象。圖6顯示PLA與DNA相互作用模式的構象,PLA滑入堿基對CG之間,與CG堿基對之間的結合能為-20.40 kJ/mol。PLA脂肪鏈部分的羥基和羧基作為氫鍵受體(供體)與堿基和脫氧核糖形成氫鍵,結合距離分別為2.2、2.0、1.7 ?,苯環部分通過堆積作用嵌入堿基對之間,與周圍的堿基形成大量π—π作用。分子對接的結果證實了上述光譜結果。因此,本研究為PLA與DNA之間的結合作用提供了進一步的證據,證明PLA與DNA之間的結合是通過插嵌結合發生的。

圖6 PLA與B-DNA d(CGATCG)2的分子對接模型Fig.6 Molecular docking model of PLA with B-DNA of sequence d(CGATCG)2

此外,為了驗證L-PLA對于插入不同堿基對的偏好性,選取不同的B-DNA鏈進行了分子對接模擬。電子版增強出版附圖1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035182)中展示了PLA分子對于不同嵌入位點(CG, GA, TG)的模擬對接結果。氫鍵作用與π—π作用依然為主要作用力,當PLA嵌入CG堿基對之間時,苯環能夠與堿基平面形成更多的π—π作用力,且氫鍵鍵長更短(2.2、2.0、 1.7 ?),說明有較強的氫鍵作用力。且當插入CG堿基對之間時,配體與受體之間擁有最低的結合能,種種證據表明,PLA更傾向于插入雙鏈DNA的CG堿基對之間。

2.4 轉錄組學分析PLA與基因組DNA相互作用的影響

先前的實驗證明了PLA能夠通過插嵌的方式與DNA穩定結合,為了進一步解析PLA通過與DNA結合是如何影響細菌生長,通過轉錄組測序分析了PLA在與基因組DNA結合下對細菌轉錄的影響,解析細菌生長受到抑制的關鍵基因。以受2 g/LD-PLA脅迫(D組),受2 g/LL-PLA脅迫(L組)和未受脅迫(CG組)的乳酸片球菌DY15為樣本,在MRS液體培養基中生長到對數中后期時(8 h),收集菌體進行轉錄組測序(NCBI登錄號:PRJNA921976)。對PLA脅迫條件下與未受脅迫的乳酸片球菌DY15的RNA-seq結果進行分析,以log2(Fold Change)>2,Pval≤0.05作為篩選標準,篩選具有顯著差異表達的基因。結果,經D-PLA脅迫生長后,共758個基因表達量發生顯著變化,261個上調基因,497個下調基因。經L-PLA脅迫生長后,共630個基因表達量發生顯著變化,194個上調基因,436個下調基因。

2.4.1 差異表達基因的GO注釋分析

為進一步分析PLA脅迫條件下細胞損傷機理,對差異表達基因進行GO富集分析。結果如圖7所示,差異表達基因可分為分子功能、細胞成分和生物過程3大類,又分別分為了11、2、12個亞類。細胞組分中涉及生物膜組分和質膜的差異表達基因占比最高,說明PLA作用靶點之一可能在生物膜上。涉及到核酸合成和復制的差異表達基因也較多,可以看出PLA進入細胞內能夠破壞基因組的結構。以上結果可以看出兩種PLA脅迫下,差異基因富集趨勢基本一致,PLA主要影響的是涉及生物膜組分及核酸合成方面的基因。

圖7 差異表達基因的GO注釋Fig.7 GO analysis of differentially expressed genes

2.4.2 差異表達基因的KEGG注釋分析

為了進一步分析差異表達基因的生物學功能,對差異基因進行了KEGG注釋。兩種脅迫條件下差異表達基因分別富集到了73、70條代謝通路中,最后選取了28條富集最顯著的代謝通路展示在圖8中。分析發現,兩種脅迫條件中均顯著富集的代謝通路有20條,分別為錯配修復、氧化磷酸化、氨酰-tRNA合成、核糖體和精氨酸代謝等,其中與核酸合成和修復相關的富集通路最多,側面印證了PLA與DNA的結合是其攻擊細菌的一種方式。

圖8 差異表達基因的KEGG注釋Fig.8 KEGG analysis of differentially expressed genes

2.4.3 對細胞壁合成和DNA修復關鍵基因的實時熒光定量PCR驗證

通過對差異基因的GO與KEGG注釋發現,較多差異基因與生物質膜合成及核酸損失修復相關,因此推測細胞壁與基因組是PLA主要作用靶點。當PLA破環細胞壁或基因組時,胞內的應激反應會使相關基因轉錄水平上調。選取與細胞壁肽聚糖合成途徑中的一系列mur基因進行了實時熒光定量PCR驗證,所選的6個基因在L-PLA脅迫下均發生不同程度的轉錄上調(圖9-a)。此外,還分析了DNA損傷修復相關的基因,如:用于DNA損傷修復的DNA聚合酶Ⅳ基因dinB、重組修復基因radA、修復-轉錄偶聯因子mfd、DNA糖基化酶基因mutM和切除修復蛋白基因uvrA,以上代表了細菌幾種不同修復機制的基因轉錄水平也均發生了上調(圖9-b)?？傊?上述基因轉錄水平的應激上調間接證實了PLA的主要作用靶點是細胞壁與基因組。

a-實時熒光定量PCR測定受L-PLA脅迫后細胞壁合成 關鍵基因表達變化;b-實時熒光定量PCR測定受L-PLA 脅迫后DNA損傷修復相關基因表達變化

2.4.4 對精氨酸代謝途徑中差異基因的實時熒光定量PCR驗證

乳酸菌在生長發酵時會不斷產生乳酸,從而降低生長環境中的pH,而乳酸菌之所以能夠在酸性環境下生存下來,與其自身的酸脅迫應答機制相關。乳酸菌中常見的耐酸應答機制有質子泵理論、谷氨酸脫羧體系、堿性氨基酸代謝、蛋白修復以及DNA損傷修復機制等[22](圖10-a)。

通過對乳酸片球菌DY15的轉錄組數據分析發現,乳酸片球菌DY15中不存在谷氨酸脫羧酶,在受到PLA脅迫時,與質子泵、蛋白修復和DNA損傷修復相關的基因普遍受到上調,而精氨酸代謝途徑受到了極大抑制。在精氨酸代謝途徑中,精氨酸經3種酶催化生成2分子NH3從而起到降低pH的作用。通過實時熒光定量PCR對該途徑的4個關鍵蛋白進行基因表達量測定(圖10-b),證實經L-PLA脅迫該途徑的基因會受到抑制,說明該PLA可能是通過抑制該途徑來降低細菌酸耐受性,從而實現抑菌效果。

a-乳酸乳球菌DY15的耐酸應答機制,紅色代表基因上調,藍色代 表基因下調,括號里為下調倍數;b-實時熒光定量PCR測定受 L-PLA脅迫后精氨酸代謝途徑中關鍵基因表達變化

3 結論與討論

PLA作為天然抑菌物質,在食品工業、動物飼料方面有著巨大的應用前景。早前關于PLA研究主要集中于對不同微生物的表觀抑制效果,如最小抑菌濃度、與其他有機酸的協同抑菌作用[23]等,以及其破壞生物膜的機理研究。本研究集中于研究PLA與DNA的相互作用以及在PLA對于細菌基因表達的影響。通過熒光光譜實驗確定了PLA與模式DNA相互作用方式,并通過分子對接模擬獲得了PLA-DNA結合模型,說明PLA能夠通過插入DNA進而可能會影響復制和轉錄。進而通過轉錄組學分析了PLA與DNA結合可能造成轉錄變化,發現PLA主要影響細胞壁合成、核酸的復制與修復相關的基因,側面證實了PLA的攻擊靶點是細胞壁和基因組的可能性。同時PLA通過抑制精氨酸代謝途徑的關鍵基因表達從而降低了細菌酸耐受性,進而通過生長環境的酸性來抑制細菌生長,這也與PLA和有機酸的協同抑菌能夠達到更好效果的結論相印證。綜上,本研究對PLA抑菌機理做出了補充,為PLA的應用提供了理論基礎。