代謝工程改造釀酒酵母合成玉米黃質

趙崇屹,周景文,徐沙*

1(江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室,江蘇 無錫,214122)2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122) 3(江南大學 未來食品科學中心,江蘇 無錫,214122)

玉米黃質,也被稱作玉米黃素,其分子式為C40H56O2,是一種常見的橙黃色含氧烯萜類化合物,屬于類胡蘿卜素,作為四萜的含氧衍生物,同時包含11個共軛的碳碳雙鍵(圖1)。玉米黃質擁有較好的脂溶性,廣泛的存在于橙色、紅色以及黃色植物花朵或果實中,由β-胡蘿卜素經β-胡蘿卜素羥化酶CrtZ催化而來。玉米黃質與其同分異構體葉黃素都具有較強的抗氧化性,對一些如老年黃斑變性、白內障以及腫瘤之類的疾病有預防作用[1-3]。玉米黃質含有的多個共軛碳碳雙鍵,既可以吸收部分波長的可見光使玉米黃質晶體顯色,又會受到熱量的影響變得不穩定,還會受到缺電子的基團以及金屬離子的攻擊,在受到這些因素影響的同時,這些雙鍵還可以淬滅掉游離的單態氧[4]。這些效果導致了玉米黃質在較高溫度下及光照等條件下具有不穩定性,容易被氧化。玉米黃質和葉黃素都存在于視網膜中[5],并被證明與視網膜健康有關[6]。玉米黃質不能由人體合成,所以需要通過食物補充[7]。

圖1 玉米黃質化學結構Fig.1 Chemical structure of zeaxanthin

玉米黃質的主要合成方法包括植物提取法、化學合成法以及生物合成法3種。其中,植物提取法主要通過從黃色的蔬菜和水果(如玉米、辣椒、橙子、甜瓜和芒果)中提取玉米黃質,通過一些提取技術獲得的玉米黃質依舊可以保持多種功能活性,但這種方法帶來的問題(如較低的產率和產量、提取過程中帶來的廢料物質和環境污染)限制了植物提取法的發展空間[8-9]。而化學合成法獲得玉米黃質較為困難,合成過程成本較高且步驟繁雜,合成得到的玉米黃質具有較差的生物活性,只能用作染料用途[10],因此化學合成不是獲得玉米黃質的優先選擇。最后,玉米黃質的微生物生產可以用野生或工程微生物進行[11-12]。應用微生物合成玉米黃質具有原材料成本低、環境污染小的優點,這兩方面都提高了玉米黃質可持續生產的可能性。此外,微生物的代謝工程也提供了另一種從本身無法合成玉米黃質的菌株中得到玉米黃素的方法[13]。由于玉米黃質的安全性以及生物活性,利用新的生物技術合成玉米黃質受到了更多的關注,很多的基因操作可用于增強玉米黃質在細菌、酵母和微藻中的積累。

萜類化合物可以通過兩個基本的結構單元異戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)以及二甲基丙烯焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)合成,這兩種物質在一定的條件下可以互變。在釀酒酵母中含有可以為合成萜類物質提供前體的甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway,MVA)。將MVA中產生的IPP和DMAPP 作為前體,通過香葉基香葉基二磷酸合成酶(CrtE)生成香葉基香葉基二磷酸酯(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP),在八氫番茄紅素合成酶(CrtB)的作用下合成八氫番茄紅素,最后再由八氫番茄紅素去飽和酶(CrtI)得到一系列中間產物和最終的產物番茄紅素[14],番茄紅素再通過番茄紅素折疊酶(CrtYB)和β-胡蘿卜素羥化酶(CrtZ)反應生成玉米黃質,玉米黃質在釀酒酵母中合成的整個過程如圖2所示。

圖2 玉米黃質的從頭合成Fig.2 De novo synthesis of zeaxanthin

BHOSALE等[15]使用多食黃桿菌(Flavobacteriummultivorum)合成玉米黃質積累量達到(10.65±0.63) μg/mL。ASKER等[16]使用了玉米黃原中黃桿菌(Mesoflavibacterzeaxanthinifaciens)合成玉米黃質,積累量[以細胞干重(dry cell weight,DCW)計]可以達到910 μg/g DCW。SUN等[17]通過將木糖利用途徑以及玉米黃質合成途徑整合到釀酒酵母中得到了一株可以吸收木糖合成玉米黃質的菌株,玉米黃質的產量為0.74 mg/L。LIANG等[18]利用誘導型啟動子最終使產量提高了50倍,使釀酒酵母中玉米黃質的產量達到了37 mg/L。SINGH等[19]成功使用小球藻(Chlorellasaccharophila)作為工程菌合成了玉米黃質。玉米黃質在合成后會積累在細胞內部,有可能產生細胞毒性,李方迪等[20]構建合成番茄紅素釀酒酵母時,發現增加胞內脂滴的表達量可以提升番茄紅素的產量,推測與番茄紅素有著類似性質的玉米黃質也可以通過相同的方式降低細胞毒性進而增加產量。

本文以本實驗室的釀酒酵母YPH499-YthmgI為出發菌株,整合本實驗室構建的番茄紅素合成途徑后將外源的CrtYB和CrtZ整合得到產玉米黃質菌株。在得到產玉米黃質釀酒酵母后過表達脂質體表達相關基因再通過補料優化提升了產玉米黃質釀酒酵母在發酵罐中的產量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和引物

本文使用的所有菌株、質粒、引物見表1～表3。

表1 本研究使用菌株Table 1 Strains used in this study

表2 本實驗使用質粒Table 2 Plasmids used in this study

表3 本實驗使用引物Table 3 Primers used in this study

1.1.2 培養基

本實驗培養大腸桿菌所用培養基為LB(g/L):酵母粉5,蛋白胨10,NaCl 10;培養釀酒酵母所用培養基為YPD(g/L):酵母粉 10,蛋白胨20,葡萄糖20。

1.1.3 母液配制

抗生素母液:氨芐青霉素、硫酸諾爾斯菌素、潮霉素、遺傳霉素母液質量濃度分別按照500、100、100、500 mg/mL配制,以0.1%(體積分數)添加于培養基中。

1.1.4 酶與試劑盒

2×TaqPCR Master Mix、Phanta?Max Super-Fidelity DNA polymerase、FastPure Plasmid Mini Kit,諾唯贊生物科技(南京)有限公司;Fast DigestedTM、Solution 1,賽默飛世爾科技公司;T4 DNA Ligase,寶日醫生物技術(北京)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌表達盒的構建

本實驗中選用來源于紅法夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)的番茄紅素折疊酶基因CrtYB(AAO73816.1)以及來源于玉米細菌性枯萎病菌(Pantoeastewartii) β-胡蘿卜素羥化酶基因CrtZ(PANA_RS21155),按照釀酒酵母密碼子偏好性進行優化并規避常用酶切位點,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表達盒的構建:1)分別以質粒PUC57-CrtYB、PUC57-CrtZ和pY26為模板擴增CrtYB、CrtZ和ADH1終止子片段。以本實驗室保藏的釀酒酵母YPH499基因組為模板,擴增GAL1pr、TEFpr啟動子及YHR210C基因的開放閱讀框(open reading frame,ORF)和上下游同源臂。2)通過融合PCR將GAL1pr、TEFpr、CrtYB、CrtZ和tADH1終止子鏈接在一起,使用TA鏈接法將表達盒子連接在19T(simple)載體上,轉化到大腸桿菌JM109中進行PCR驗證。3)利用TA連接將靶點YHR210C連帶其左右同源臂連接到載體Vector 19T(simple)上,反向PCR擴增連帶左右同源臂的載體片段;4)挑取步驟2)驗證的菌落接入液體LB培養基,于37 ℃,200 r/min過夜培養后提取質粒并酶切純化得到目的片段,將該片段與步驟3)擴增出的攜帶同源臂的載體轉化至JM109,進行菌落PCR驗證。

1.2.2 轉化及篩選方法

本研究利用同源重組的方法進行基因整合,利用醋酸鋰轉化法將線性化重組片段轉入細胞,利用同源重組的機制完成整合,利用表達盒子攜帶的遺傳霉素抗性標簽進行重組菌株篩選,將完成轉化的菌液涂布至遺傳霉素抗性YPD平板上,倒置于30 ℃培養箱至長出轉化子,經菌落PCR初步篩選,再通過基因組測序驗證后獲得整合表達菌株。

1.2.3 重組菌發酵實驗

搖瓶培養:挑取轉化完成的菌落接種到YPD培養基中,30 ℃,220 r/min培養至對數生長中期,即OD值為0.6～0.8,以10%的接種量接至含50 mL培養基的250 mL搖瓶中,30 ℃,220 r/min進行培養,定時取樣對重組菌生長趨勢及胞內合成玉米黃質水平進行測定。

發酵罐培養:挑取轉化完成的菌落接種至含50 mL YPD培養基的250 mL搖瓶中,48 h后挑選生長狀況較好的作為種子液。培養條件:溫度30 ℃,pH值為6.5,攪拌轉速500 r/min。

1.2.4 生長趨勢測定及玉米黃質提取

取2 mL發酵液備用,其中1 mL菌液離心并棄上清液,再使用ddH2O洗滌兩次后烘至恒重,稱量并計算菌體量。剩余1 mL菌液同樣離心洗滌,先加入不小于菌體體積的直徑為0.5 mm的玻璃珠,再加入1 mL 氯仿并標記液面高度,振蕩10 min使菌體充分破碎,使用錫紙包裹后靜置過夜,萃取其中的產物。待菌體顏色褪去后提取溶液過膜。在處理樣品的過程中盡量避光防止產物氧化造成損失,存放時也需要放置在陰涼避光的位置。

1.2.5 檢測方法

實驗中使用島津20A HPLC,Hypersil ODS-2液相色譜柱,流動相選擇V(乙腈)∶V(水)=95∶5,流速1 mL/min,柱溫35 ℃,檢測波長450 nm,進樣量20 μL。

2 結果與分析

2.1 玉米黃質合成途徑的構建與發酵

本文中構建的表達盒子如圖3所示,利用已經敲除Gal80的釀酒酵母YPH499-tHMG1為出發菌株。敲除Gal80后GAL啟動子不再受半乳糖的誘導,但仍受到葡萄糖的部分抑制。表現為前期葡萄糖濃度較高,產物合成基因受到抑制,主要積累菌體,后期葡萄糖濃度下降大量積累產物。將β-胡蘿卜素羥化酶(CrtZ)和雙功能八氫番茄紅素合酶/番茄紅素環化酶(CrtYB)組成的玉米黃質合成表達盒子轉化至YPH499-tHMG1,替換YHR210C的ORF,之后提取基因組進行PCR驗證和測序驗證,結果表明重組菌成功構建。

圖3 玉米黃質的合成途徑的表達盒子結構Fig.3 Metabolic engineering pathway expression box of zeaxanthin

在YPD培養基中搖瓶培養72 h,發現玉米黃質在60 h積累量最高,為3.4 mg/L,單位細胞產量為0.58 mg/g CDW(圖4)。發酵60 h以后,產物玉米黃質的產量急劇下降,可能的原因是產物積累對細胞產生一定的毒性,影響細胞生長,并進一步影響產物在胞內的積累。因此,提高釀酒酵母對玉米黃質的耐受性應該可以增加玉米黃質的積累量。

圖4 玉米黃質產量及菌體量變化Fig.4 Changes of zeaxanthin yield and bacterial biomass

2.2 利用脂質體含量提高的重組酵母提高玉米黃質的積累

類胡蘿卜素都具有較好的脂溶性,增加釀酒酵母的脂質體表達可以讓玉米黃質溶解在脂質載體中。李方迪等[20]通過過量積累釀酒酵母中的脂質載體,將番茄紅素的產量提高1.7倍,通過熒光顯微鏡觀察發現番茄紅素積累在脂質體上。玉米黃質與番茄紅素同屬萜類化合物,推測脂質體的過表達對玉米黃質在釀酒酵母中的積累也有類似的作用。因此,利用本實驗室已構建的過表達脂質載體的釀酒酵母tHMG1-19,整合上述合成玉米黃質合成酶得到菌株19-09-zea-IB/IE。搖瓶發酵結果表明60 h時的玉米黃質積累到5 mg/L,此時菌體量為3.3 g/L(圖5-a)。搖瓶發酵24 h后每24 h補加0.8 mL 500 g/L的葡萄糖,玉米黃質的積累如圖5-b所示,玉米黃質產量提高到16 mg/L,此時的菌體量為5.3 g/L。

a-未補加葡萄糖時;b-補加葡萄糖時

2.3 補加半乳糖發酵產玉米黃質釀酒酵母

GAL作為玉米黃質合成酶在表達時利用的啟動子,受到半乳糖調控,半乳糖濃度提高,GAL啟動子表達強度也會相應提高,因此嘗試使用半乳糖代替葡萄糖作為補料碳源進行搖瓶培養,結果如圖6所示。菌體生長狀態相比補加葡萄糖有較大的區別,玉米黃質產量在72 h最高,為8 mg/L,此時的細胞菌體量為4.9 g/L。但在補加葡萄糖的發酵培養實驗中,玉米黃質產量在此后仍有較大幅度的提高。此外,本實驗室已有研究中發現,流加乙醇作為碳源能有效提高番茄紅素的積累[20],因此本研究中也嘗試使用分批補加乙醇的方式進行發酵,在發酵培養24 h后每24 h補加1 mL 37.5%(體積分數)的乙醇。結果如圖6-b所示,玉米黃質產量在96 h最高,僅為2.6 mg/L,此時的菌體量僅有3 g/L。因此本研究采用流加葡萄糖的方法進行下一步上罐實驗。

a-補加半乳糖;b-補加乙醇

2.4 5 L罐發酵培養重組釀酒酵母生產玉米黃質

菌株19-09-zea-IB/IE在5 L發酵罐中進行發酵。分別24、36、48、60 h開始以2.5 g/h的速度恒速流加葡萄糖,發酵的總時長為168 h。對玉米黃質產量、菌體生長情況進行測定,如圖7所示,不同時間開始補加葡萄糖時,都檢測到了乙醇和葡萄糖在后期的積累。從24、36、48 h 開始流加葡萄糖,玉米黃質分別在168、144、144 h產量最高,分別為32.5、38.3、42.3 mg/L。60 h開始流加玉米黃質產量急劇下降,細胞菌體量也有明顯降低,因此選取48 h為起始流加時間。

a-玉米黃質產量;b-菌體量

進一步嘗試采用指數流加的方式維持酵母細胞的持續生長,進而獲得更高的產物積累和菌體量。根據之前的發酵罐實驗中獲得的數據計算得出在本次研究中應用在發酵罐上的指數流加參數分別為μ=0.028 8 h-1,k0=0.006 L/h,流加起始時間為48 h,葡萄糖質量濃度250 g/L。玉米黃質的產量以及菌體量如圖8所示。玉米黃質產量在144 h最高達到47.7 mg/L,菌體量為6.5 g/L,相比48 h開始恒速流加葡萄糖時的玉米黃質產量有所提高,因此利用指數流加的方法對釀酒酵母合成玉米黃質更為有效。

a-玉米黃質產量以及菌體量;b-罐內物質積累量

3 結論與討論

釀酒酵母適于生產玉米黃質。已有研究表明,一些微生物能夠積累大量的脂質載體,產物附著其上能夠降低對細胞的毒性[14]。本研究利用前期構建的脂質體積累工程菌,使產物玉米黃質的產量提高1.5倍。以葡萄糖為碳源進行補料,發現48 h開始補料產量最高。結合前期實驗,優化了補料方法,以指數流加方式維持酵母細胞的進一步持續生長和產物的積累,最終玉米黃質產量在144 h最高,達到47.7 mg/L,此時菌體質量濃度為6.5 g/L。

目前,國內外對玉米黃質生產的研究較少,普遍產量較低。本研究發現即使以指數流加的方式進行葡萄糖補料,達到的最高菌體量依舊較低。因此,玉米黃質產量不高的主要瓶頸在于菌體濃度過低。由于YPH499是多重氨基酸營養缺陷型菌株,雖然實驗采用YPD完全培養基,但其氨基酸含量可能仍然低于細胞生長和產物合成所需,因此后續可以通過敲入缺失的氨基酸合成必需基因,使其成為非營養缺陷型菌株,并進一步優化發酵培養基、補料策略等,提高重組菌玉米黃質的產量。