應用雌激素受體β抑制劑建立腸道屏障受損的便秘動物模型

梅春霞,王嘉良,唐楠,余強慶,王順合,王琳琳,王剛,張灝

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

便秘是一種常見的胃腸動力障礙疾病,飲食結構、藥物使用、生活方式、結腸推進或直腸排空障礙、菌群失調、代謝紊亂等因素均與便秘密切相關。便秘不僅造成人們生理不適,還易引起情緒障礙,已嚴重影響了人們的生活質量。其治療的主要手段是飲食、生活方式干預、藥物治療(如滲透性瀉藥聚乙二醇、乳果糖、刺激性瀉藥番瀉葉、促分泌藥、促動力藥物普蘆卡必利)及手術治療等。在全球,便秘的發生率高達11%～20%[1],而女性便秘的患病率幾乎是男性的2倍[2]。值得注意的是,便秘在兒童和老人中患病率無差異,猜測性激素在便秘患病率中可能發揮著重要的影響作用。

女性比男性更易受到便秘的困擾,這種患病性別差異可能與性激素水平、心理承受能力以及活動量等因素有關。女性在懷孕期、月經期經常會出現便秘加重的癥狀,這就提示我們性激素可能是影響胃腸轉運的重要因素。雌激素作為最主要的性激素之一,可以穿過細胞膜,與細胞質中的專一性受體結合,形成復合體。雌激素受體(estrogen receptor, ER)包括ERα和ERβ 2種亞型,而ERβ則是結腸中主要表達的ER[3]。研究表明,ERβ通過參與電解質的轉運[4]增加鈉吸收,上調鈉/氫交換因子3(sodium/hydrogen exchanger 3, NHE3)影響孕期小鼠便秘。ERβ在便秘患者結腸黏膜層、肌間神經叢及黏膜下神經叢中的表達顯著下調[5]。便秘大鼠結腸中ERβ蛋白也明顯低于正常對照組[6]。這些研究均表明ERβ受體下調可能會影響便秘。有研究表明,敲除ERβ基因后雌性小鼠通過ERβ/PI3K/Akt通路下調大腦中腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)蛋白水平[7],BDNF繼而通過BDNF-PLC-γ/DAG-IP3信號通路影響了腸神經與平滑肌重構。這又進一步說明ERβ受體下調會影響宿主的腸神經系統。

基于此,本文擬應用ERβ受體抑制劑(枸櫞酸他莫昔芬)處理大鼠,以洛哌丁胺處理組作為陽性對照,通過檢測糞便含水量、小腸推進率及排首粒黑便時間,判定ERβ受體抑制劑處理組是否可成功構建靶向女性便秘的動物模型。由于便秘同時伴有腸屏障的損傷,結合ERβ受體下調對腸神經系統的影響,本文擬通過進一步檢測ERβ受體抑制劑(枸櫞酸他莫昔芬)處理對大鼠腸屏障及腸神經系統的影響,最終探究ERβ在腸蠕動中發揮的重要作用,為構建靶向篩選緩解女性便秘的益生菌動物模型提供理論依據和基礎支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸洛哌丁胺膠囊,西安楊森制藥有限公司;枸櫞酸他莫昔芬片,四川海匯藥業有限公司;阿拉伯樹膠粉、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、活性炭粉,國藥集團化學試劑公司;大鼠5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)ELISA試劑盒,上海酶聯生物科技有限公司;大鼠S100β抗體,Abcam公司。

1.2 動物實驗設計

24只6周齡雌性SPF級Sprague Dawley大鼠,南京維通利華實驗動物技術有限公司;動物倫理委員會審核批準文號:JN.No20211115 s1200201[440],研究遵循的程序符合負責動物試驗委員會(單位性的、地區性的或國家性的)所制訂的倫理學標準。飼養環境溫度20～26 ℃,相對濕度40%～70%,噪聲控制在≤60 dB,動物照度應為15～20 LX。大鼠隨機均分為4組:正常組(normal control, NC組)、鹽酸洛哌丁胺組(LOP組)、枸櫞酸他莫昔芬組(TAM組)、鹽酸洛哌丁胺+枸櫞酸他莫昔芬處理組(TAM+LOP組)。適應性飼養1周后進入干預期,干預期持續7 d,NC組每天灌胃1 mL生理鹽水,LOP組每天灌胃1 mL鹽酸洛哌丁胺懸液(10 mg/kg BW),TAM組每天灌胃1 mL枸櫞酸他莫昔芬懸液(40 mg/kg BW),TAM+LOP組每天灌胃0.5 mL鹽酸洛哌丁胺懸液(10 mg/kg BW)和0.5 mL枸櫞酸他莫昔芬懸液(40 mg/kg BW)。動物實驗按圖1所示進行。試驗期間各組大鼠均飼喂標準飼料,每周收集大鼠糞便,并盡快帶回實驗室,保存于-80 ℃冰箱備用。實驗結束后,大鼠腹腔注射100 mg/kg BW的氯胺酮麻醉后,腹部主動脈取血至死。血液在4 ℃、3 000×g下離心10 min,取血清,-80 ℃凍存備用。

圖1 動物實驗流程Fig.1 Animal experiment schedule

1.3 實驗方法

1.3.1 糞便含水量

將每只大鼠單獨放入透氣籠盒中每周收集糞便,稱重后使用凍干機冷凍干燥,糞便含水量的計算如公式(1)所示:

(1)

1.3.2 首粒黑便時間

將阿拉伯樹膠與水以料液比1∶10(g∶mL)混合均勻后加熱至透明,再加入100 g/L的活性炭粉,煮沸3次保證混合均勻。在實驗結束前1 d測大鼠排首粒黑便時間,并在前1 d禁食不禁水12 h。測定時,每只大鼠灌胃1 mL活性炭溶液,記錄每只大鼠從灌入活性炭溶液開始到排出第1粒黑便的時長,將此時長定義為排首粒黑便時間。比較各個處理組排首粒黑便時間與正常組之間的差異,用于說明各個藥物處理組構建便秘模型的情況。

1.3.3 小腸推進率

大鼠處死前一天禁食不禁水12 h,在處死前1 h,每只大鼠灌胃1 mL上述活性炭溶液。處死后,小心剪取胃至回腸末端,小心展開全段小腸,避免拉扯,測量無拉伸的小腸總長度,以及活性炭墨汁自胃在小腸中推進的距離,大鼠小腸推進率的計算如公式(2)所示:

(2)

1.3.4 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, RT-qPCR)

采用RT-qPCR測定大鼠結腸組織中水通道蛋白AQP3基因、AQP8基因、c-kit基因、Klf4基因、Atoh1基因、Claudin-5蛋白基因。

在NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找大鼠AQP3基因、AQP8基因、c-kit基因、Klf4基因、Atoh1基因、claudin-5蛋白基因引物序列,并委托上海生工生物科技有限公司進行合成,具體引物信息見表1。

表1 幾種基因的引物序列及產物長度Table 1 Length of primers and products

取-80 ℃保藏的大鼠結腸(同一部位)20 mg左右,使用Trizol法提取結腸總RNA,通過測定RNA在OD260/280吸光度比值,檢驗其純度及完整性。然后按照試劑盒中說明,以提取的總RNA為模板合成cDNA,進行RT-qPCR檢測,根據HiScript III RTSuperMix for qPCR的說明配制體系并進行RT-qPCR程序運行。

1.3.5 蘇木精和伊紅(hematoxylin and eosin)病理染色

將固定后的結腸組織經流水過夜沖洗,樣品脫水浸蠟后包埋。使用手動輪轉切片機切出5 μm的薄片,放入40 ℃的去離子水中進行展片,用載玻片將其撈出。之后進行脫蠟、H&E染色、脫水與透明。染色完成后使用中性樹膠進行封藏。待中性樹膠完全凝固后,放入數字組織切片掃描機中進行觀察。結腸組織的病變分析主要測定上皮細胞、隱窩和杯狀細胞的形態、結構以及黏膜厚度。

1.3.6 酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測

分別從-80 ℃冰箱中取出約100 mg結腸組織,按料液比1∶9(g∶mL)加入PBS,加入鋯珠并使用高通量組織破碎儀將結腸組織研磨破碎,5 000×g離心取上清液為組織勻漿。按照5-HT,P物質ELISA試劑盒的說明書進行操作,采用外標法制作標準曲線,根據吸光度計算出樣品中所含待測物質的濃度。

1.3.7 免疫熒光檢測

結腸石蠟切片經脫蠟水化處理后加S100β一抗(1∶100)孵育過夜,滴加(Cy3) Rabbit Anti-Goat標記的熒光IgG二抗(1∶500),用數字切片掃描儀觀察并拍照,Image J圖像分析系統分析單位面積內陽性染色的平均光密度值,以陽性染色的平均光密度變化評估腸神經膠質細胞數目。

1.3.8 統計分析

實驗數據用Graphpad Prism 8.0軟件統計,組間多重比較,分別用單因素方差分析及SNK-q檢驗,兩組間單獨比較用t檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。注:*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.000 1;ns表示無顯著性,以上顯著性均是與正常組(NC)比較。

2 結果與分析

2.1 應用ERβ受體抑制劑可構建便秘動物模型

通常,在構建便秘動物模型時,常用的藥物為洛哌丁胺。如圖2所示,洛哌丁胺(10 mg/kg BW)灌胃后,大鼠會呈現便秘的癥狀(小腸推進率和糞便含水量降低,排首粒黑便時間延長)。單獨使用ERβ受體抑制劑(他莫昔芬,40 mg/kg BW)后,大鼠的糞便含水量顯著降低,排首粒黑便時間顯著延長,根據《保健食品檢驗與評價技術規范(2022版)》中有關通便功能檢驗方法陽性結果的判斷標準可知:單獨使用ERβ受體抑制劑他莫昔芬可成功構建便秘動物模型。灌胃(ERβ受體抑制劑40 mg/kg BW+洛哌丁胺10 mg/kg BW)后,大鼠同樣呈現便秘的癥狀,上述2種結果均表明應用ERβ受體抑制劑處理大鼠可成功構建便秘模型。

a-小腸推進率;b-排首粒黑便時間;c-糞便含水量

2.2 ERβ受體抑制劑造成腸屏障損傷

2.2.1 他莫昔芬對大鼠腸道生物屏障的影響

LOP組Chao1指數與observed-OTUs指數與空白組相比無顯著性差異。而TAM組和TAM+LOP組則顯著改變了大鼠腸道菌群α-多樣性(Chao1指數、observed-OTUs)(P<0.05),這些結果表明他莫昔芬處理后,大鼠腸道內物種豐富度提高。根據主坐標分析圖所反映的β多樣性結果可知,不同藥物處理后對大鼠腸道菌群的影響非常顯著,且不同藥物影響作用也不同(圖3-c)。其中他莫昔芬上調了unculturedBacteroidalesbacterium,Bifidobacterium,Clostridiumsensustricto1,Turicibacter和Faecalibaculum的相對豐度(P<0.05)。相較于洛哌丁胺所引起的菌群改變,他莫昔芬顯著增加了大鼠腸道中促炎菌Turicibacter的豐度,這與H&E病理染色結果中的炎癥浸潤現象一致。同時,他莫昔芬與洛哌丁胺處理組均降低了Blautia、Marvinbryantia、Fournierella、Lactococcus的相對豐度(P<0.05)。

a-Chao 1指數;b-Observed-OTUs指數;c-主坐標分析;d-TAM組與NC組的差異菌株比較;e-LOP組與NC組的差異菌株比較

2.2.2 他莫昔芬對機械屏障影響

在H&E病理染色結果中,他莫昔芬導致結腸隱窩結構受損(深度變淺),杯狀細胞明顯減少,黏膜下層出現水腫浸潤,黏膜層皺縮(圖4)。

a-NC組;b-LOP組;c-TAM組;d-TAM+LOP組

但檢測杯狀細胞關鍵分化因子Klf4、Atoh1基因轉錄(圖5)有下調趨勢卻無顯著差異,故推測他莫昔芬處理可能是通過誘導杯狀細胞的凋亡引起了杯狀細胞數量的減少,從而破壞了大鼠腸道機械屏障。腸上皮細胞通過細胞間緊密排列有效阻擋細菌、病毒及內毒素的進入,形成機械屏障。qPCR結果顯示洛哌丁胺與他莫昔芬均下調了緊密連接蛋白Claudin5的轉錄(圖5),說明2種造模藥物均對于腸道機械屏障造成了一定程度的損傷。這些結果均表明他莫昔芬處理后,大鼠不僅呈現出便秘的狀態,同時腸道的機械屏障也出現了不同程度的損傷。

a-Claudin5;b-Klf4;c-Atoh1

2.2.3 他莫昔芬對化學屏障影響

在TAM和LOP組,2種水通道蛋白AQP3和AQP8的轉錄水平都未出現顯著改變,他莫昔芬也僅表現出上調AQP8轉錄的趨勢(圖6-a、圖6-b),因此他莫昔芬下調大鼠糞便含水量可能并不由通過AQP3與AQP8主要介導。5-HT作為一種腸神經系統中關鍵的神經遞質在調節腸道運動中起著重要作用,5-HT能刺激腸道的局部收縮,而實驗結果顯示洛哌丁胺減少5-HT的釋放,他莫昔芬并不會引起結腸中5-HT的變化,甚至存在上調5-HT的趨勢(圖6-c)。說明,應用洛哌丁胺構建便秘模型和應用他莫昔芬構建的便秘模型對于5-HT相關信號通路的影響是不同的。此外,結腸中興奮性胃腸活性肽P物質在TAM組、LOP組、TAM+LOP組均顯著降低(圖6-d,P<0.05),P物質或是他莫昔芬與洛哌丁胺導致便秘癥狀所涉及到的共同途徑,可能都減少了該類神經遞質的釋放,對腸道平滑肌舒張收縮產生影響,抑制了腸道蠕動。

a-AQP3相對表達量;b-AQP8相對表達量;c-5-HT含量;d-P物質含量

2.2.4 抑制ERβ引起免疫屏障損傷

腸道黏膜炎癥也與運動功能有著密切的關系,在TAM組和TAM+LOP組中大鼠的結腸都出現了淋巴細胞的聚集,表現出免疫炎癥,而在LOP組未見明顯的病理損傷(圖4)。與此同時,如圖7所示,血清中炎癥性指標C反應蛋白在他莫昔芬處理后大幅上升,說明他莫昔芬激活了腸道炎癥反應,對腸道黏膜免疫屏障造成了一定程度的破壞。

圖7 血清中C反應蛋白含量Fig.7 C-reactive protein content in serum

2.3 他莫昔芬損傷了結腸黏膜肌層與外肌層腸神經膠質細胞

在腸神經系統中,腸神經膠質細胞、腸神經元中都有著較高水平的ERβ表達[8]。S100β是一種鈣結合蛋白,主要存在于神經膠質細胞中,使用S100β標記腸神經膠質細胞(圖8中紅色熒光)。免疫熒光結果顯示,他莫昔芬處理后腸神經膠質細胞密度下降(圖8),而洛哌丁胺在一定劑量范圍內對腸神經膠質細胞數量無影響,故推測ERβ在引起便秘的同時也會對腸神經膠質細胞正常的神經發育及信號傳遞具有一定程度的影響。

a-NC組;b-LOP組;c-TAM組;d-TAM+LOP組

3 結論與討論

便秘患者常表現為排便次數減少,糞便干硬,排便不充分等癥狀。應用藥物構建便秘模型時,常用的藥物為鹽酸洛哌丁胺,作為一種阿片受體抑制劑,其會干擾神經遞質的釋放,抑制腸蠕動與收縮。本文旨在構建靶向女性便秘的動物模型,用于靶向篩選適合女性便秘的藥物或益生菌。

前期研究發現激素尤其是雌二醇和/或其受體在女性便秘中發揮著重要的作用[9]?；诖?本文主要探討激素受體特別是雌二醇受體對便秘的影響。研究發現,宿主腸道內主要為ERβ受體[3],因此我們假設應用雌激素β受體的特異性抑制劑他莫昔芬可構建靶向女性便秘的動物模型,并以洛哌丁胺作為陽性造模藥物對照。通過檢測小腸推進率、排首例黑便時間和糞便含水量3個指標來反映他莫昔芬對大鼠腸道轉運能力的影響。結果表明應用他莫昔芬可成功構建便秘模型。

目前,影響腸蠕動的因素主要有神經系統(腸神經系統和自主神經系統)、免疫系統、腸道菌群及其代謝產物。這些方面的任何一個環節出現紊亂或功能障礙都會引起腸道能動性失調(便秘或腹瀉)。因此,我們進一步解析了他莫昔芬在構建便秘模型后對大鼠上述系統,即腸道屏障功能及腸神經系統的影響。結腸黏液層厚度的減少會阻礙糞便的推進,黏液主要由杯狀細胞分泌,覆蓋腸上皮表面,杯狀細胞的減少導致黏蛋白分泌不足,這主要是隱窩干細胞分化不足或杯狀細胞凋亡增加的結果[10]。ERβ在結腸隱窩中有著較多表達,ERβ表達量的下降可能抑制了隱窩干細胞分化相關基因的表達,使隱窩干細胞分化不足[11]。同時他莫昔芬作為乳腺癌的臨床用藥抑制乳腺癌細胞增殖的同時或許誘導了杯狀細胞的凋亡,從而導致結腸黏液分泌不足,糞便推進受阻,糞便含水量的下降。

葡聚糖硫酸鈉處理后,ERβ敲除小鼠在糞便微生物群組成的α和β多樣性方面表現出顯著變化,并出現結腸炎和焦慮樣行為的惡化[12]。ERβ的激活能調節自噬炎癥小體途徑,抑制白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的分泌,調節腸道微生物群,最終緩解結腸炎[13]。與誘導結腸炎后的雄性小鼠相比[14],雌性小鼠的Turicibacter和未分類梭菌科顯著富集,這與我們的實驗結果具有一致性。Turicibacter在腸道中異常增殖或能預示女性腸道菌群的紊亂以及潛在的胃腸疾病。氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉處理后,缺失ERβ的小鼠富集了影響碳水化合物代謝和細胞運動的微生物群,同時減少了影響內分泌系統的微生物群[15]。變形桿菌門、擬桿菌門和厚壁菌門(包括乳酸桿菌門)的代表性順序也因小鼠ERβ存在與否而異[16]。ERβ在重構腸道微生物群、緩解胃腸道疾病上發揮著重要作用。

雌激素的激活是在信號通路上與相關受體結合被觸發活化的結果,雌激素的抗炎效應是通過激活ERβ受體介導[17]。GOODMAN等[18]研究證明ERβ通過調控GILZ轉錄因子介導了調節性T細胞對于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)中免疫穩態的修復。IL-6和TNF-α在IBD患者中有顯著的性別差異,男性明顯高于女性,與對照組相比,ERβ在IBD患者中表達明顯降低。便秘癥狀中ERβ表達與炎癥相關因子IL-6、IL-10、TNF-α、MCP-1等之間的相關性也有待進一步研究,以解析ERβ通過免疫途徑影響腸道運動的機制。

人類的ERβ蛋白存在于肌間神經叢和黏膜下神經叢的腸神經元中[19]。RASTELLI等[20]的體外實驗結果顯示ERβ的激動劑處理會促進腸神經膠質細胞的神經發生,本研究結果表明ERβ的抑制劑減少了結腸中腸神經膠質細胞的數量,抑制其對神經遞質的反應,造成結腸動力不足。通過刺激ERβ的增殖或恢復ERβ在結腸中的表達或許能夠促進腸神經膠質細胞數量及功能恢復到正常水平,達到緩解便秘的效果。

綜上所述,應用ERβ受體抑制劑可成功構建靶向女性便秘的動物模型。同時ERβ受體抑制劑在造成便秘的同時也會造成結腸腸神經受損及腸屏障的損傷?？傊?本研究為構建靶向篩選緩解女性便秘的益生菌動物模型提供了理論依據和基礎支持。