蚯蚓多肽的提取純化工藝及應用研究進展

劉忠慧,周燕代子,王存文

(武漢工程大學化工與制藥學院 綠色化工過程教育部重點實驗室 新型反應器與綠色化學工藝湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430205)

蚯蚓又名地龍,為巨蚓科動物參環毛蚓或縞蚯蚓的全體蟲,是我國重要的動物類中藥材之一?！渡褶r本草經》記載,蚯蚓具有清熱、定驚、通絡、平喘、利尿的功效;《本草綱目》記載,蚯蚓具有通經活絡、活血化瘀、預防心腦血管疾病的功效。蚯蚓是陸地生態系統中生物量最大的無脊椎土壤動物,且生長周期較短,在環保領域具有極大的開發價值。例如在濕地中人工養殖蚯蚓,可去除廢水中的TP、TN、COD及重金屬Cu、Zn等[1];在污泥中養殖蚯蚓,可去除污泥中的大部分有機物[2],對生態環境起到極大的優化作用。但目前蚯蚓大多以鮮體或干體的形式作為飼料應用于水產和家禽養殖等領域[3],存在利用率較低、附加值不高、浪費嚴重等問題。因此,提高蚯蚓的利用價值成為目前亟需解決的問題。

蚯蚓含有豐富的營養成分,如氨基酸、有機酸、核苷酸、含氮類物質等[4],其中蛋白含量高達70%,多肽活性成分高達55%～68%[5],在醫藥和臨床方面極具應用價值。因此,蚯蚓多肽的提取純化受到廣泛關注。覃麟等[6]利用Alcalase蛋白酶提取蚯蚓多肽,發現其具有良好的抗氧化性能。Hidayat等[7]利用木瓜蛋白酶提取蚯蚓蛋白中的氨基酸,可用作食品添加劑,極大地提高了蚯蚓蛋白的利用率。劉廷強等[8]利用蚯蚓自溶酶提取蚯蚓中的小分子多肽,發現其能有效提高成人皮膚成纖維細胞和表皮角質形成細胞的活性,可用作化妝品添加劑。在此,作者對蚯蚓蛋白的酶解工藝進行介紹,對蚯蚓多肽純化工藝的優缺點進行分析,包括層析法、電泳法、膜分離法等,并對蚯蚓多肽在神經系統、呼吸系統、心血管系統、免疫系統、運動系統等方面的藥理作用進行綜述,擬為蚯蚓多肽的進一步研究和高效利用提供參考。

1 蚯蚓蛋白的酶解工藝

利用外源蛋白酶分解未溶解的蛋白質可以最大限度地提高蛋白質的水解程度,并且不會影響或減少蛋白質中的營養物質[9]。Baehaki等[10]研究證明,酶比化學試劑更加溫和,酶解蛋白工藝不會破壞蛋白質中的活性多肽和氨基酸結構,相較于化學水解蛋白工藝更有利于活性物質的提取。此外,蚯蚓蛋白水解得到的多肽多用于藥物類研究,而化學試劑的添加會降低多肽作為藥物成分的安全性,因此,酶解工藝是目前水解蚯蚓蛋白的最優選擇。

酶解法是在特定的溫度和pH值下,利用蛋白酶對蛋白質進行水解,將高分子量蛋白質分解成低分子量多肽。不同酶水解蛋白質可以得到不同的生物活性肽,且同一種酶以不同的酶解工藝得到的生物活性肽也會有所差異。因此,針對不同種類的小分子生物活性肽產物,篩選合適的酶及酶解工藝尤為重要。

Alcalase蛋白酶往往被用于提取抗氧化肽和更小分子量的N-氨基化合物,其中抗氧化肽可作為一種優良的天然抗氧化劑,應用于藥食兩用食品中,而N-氨基化合物作為生物生長的必要營養成分通常用作營養品添加劑[7]。酸性蛋白酶具有極強的水解活性,可以將蚯蚓蛋白水解成分子量更小的氨基酸[11];而彈性蛋白酶和胰蛋白酶可水解蚯蚓蛋白得到含有抑制肺腺癌細胞的多肽物質[12];將胃蛋白酶和胰蛋白酶混合后水解蚯蚓蛋白,得到具有抗凝活性的多肽物質[13];蚯蚓自溶酶作為蚯蚓自身存在的一種水解酶,對蚯蚓中各種活性成分的提取安全性最高,但其水解程度相對較低[14-15]。表1總結了不同酶的酶解工藝。

表1 不同種類酶的酶解工藝

2 蚯蚓多肽的純化工藝

蚯蚓蛋白酶解后會產生多種不同分子量的活性多肽,往往具有不同的功效,針對不同分子量多肽的純化尤為重要。常見的蚯蚓多肽純化工藝主要有層析法、電泳法、膜分離法等。

2.1 層析法

層析法由俄國植物學家Tswett首先提出,是基于待分離物質的理化性質差異建立的分離方法。層析體系由固定相和流動相組成,其中固定相為固體物質或固定于固體物質上的成分,流動相是可以流動的物質,如水或各種溶劑。由于多肽為小分子活性物質,應用于多肽純化的層析法通常分為凝膠過濾層析法、柱層析法和離子交換層析法等3種。

2.1.1 凝膠過濾層析法

凝膠過濾層析法又稱排阻層析或分子篩方法,主要是根據蛋白質質量的大小差異進行分離和純化,其分離原理如圖1所示。

圖1 凝膠過濾層析法的分離原理Fig.1 Separation principle of gel filtration chromatography

凝膠過濾層析法所用的凝膠屬于惰性載體,不帶電荷,吸附力弱,操作條件較溫和,可在相當寬的溫度范圍內進行,不需要有機溶劑。張蘭娥等[24]采用凝膠過濾層析法成功提純了蚯蚓中的活性多肽,發現其對血管緊張素轉化酶(ACE)活性有抑制作用。Li等[25]采用凝膠過濾層析法提取了蚯蚓酶解液中的三肽復合物,發現其對HeLa細胞的病變和凋亡起到一定作用,且對正常人類皮膚成纖維細胞的細胞毒性很低,可用于新抗癌化合物的開發。

2.1.2 柱層析法

柱層析法又稱柱色譜法,主要是根據樣品混合物中各組分在固定相和流動相中分配系數的不同將組分有效分離。相較于其它純化方法,柱層析法使用的固定相的成本較低,且易處理。杜智勇等[26]通過柱層析法從蚯蚓中提取了谷胱甘肽轉硫酶,其比活力達到1.236 U·(mg Pr)-1,純化倍數達到14倍,收率為17.7%,具有良好的純化效果。

2.1.3 離子交換層析法

離子交換層析法是在一定pH值條件下,根據蛋白質所帶電荷不同來分離蛋白質的一種方法,其分離原理如圖2所示。

圖2 離子交換層析法的分離原理Fig.2 Separation principle of ion exchange chromatography

離子交換層析法具有操作簡單、流動相成本低、蛋白回收率高等優點,尤其對于蚯蚓多肽的純化,保證其活性尤為重要。李嬌等[27]利用CM-22離子交換層析和DEAE離子交換層析實現了蚯蚓葡萄糖氧化酶的純化,回收率達到60.8%,比活力達到2 684.2 mU·mg-1,純化倍數達到37.2倍。

2.2 電泳法

電泳法是指在電場作用下,帶電荷的供試品(如蛋白質、多肽等)在惰性介質(如紙、醋酸纖維素、聚丙烯酰胺凝膠等)中,向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動,使組分分離成狹窄的區帶,達到分離純化的目的。由于多肽的分子量通常在10 kDa以下,常采用毛細管電泳法、雙向電泳法純化多肽。

2.2.1 毛細管電泳法

毛細管電泳法是一類以毛細管為分離通道、高壓直流場為驅動力的新型液相分離技術。根據樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異實現分離,其分離原理如圖3所示。

圖3 毛細管電泳法的分離原理Fig.3 Separation principle of capillary electrophoresis

周鑫悅等[28]通過高效毛細血管電泳法同時分離檢測出6種蚯蚓多肽,6種蚯蚓多肽可在10 min內達到基線分離。顏松益等[29]通過毛細管電泳-大體積樣品堆積法同時富集4種蚯蚓多肽VQ-5、OEP3121、F-1和AQ-5,測得蚯蚓蛋白粉中多肽AQ-5含量為0.0012%,4種蚯蚓多肽的回收率在91.97%～102.67%之間,達到了極好的分離純化效果。

2.2.2 雙向電泳法

雙向電泳是等電聚焦電泳(根據pH值分離)和SDS-PAGE電泳(根據分子量大小分離)的組合,其分離原理如圖4所示。

圖4 雙向電泳法的分離原理Fig.4 Separation principle of bidirectional electrophoresis

雙向電泳法具有樣品不易擴散、用量少、靈敏度高等優點,可以得到更清晰的蛋白質分布圖。郭錦等[30]利用SDS-PAGE電泳和雙向電泳評價了三氯乙酸-丙酮沉淀法、裂解液法和酚抽提法對蚯蚓總蛋白的提取效果,確定改良后的三氯乙酸-丙酮沉淀法為蚯蚓總蛋白的最佳提取方法。

2.3 膜分離法

膜分離法是指在分子水平上不同粒徑分子的混合物通過半透膜實現選擇性分離的技術,其分離原理如圖5所示。

圖5 膜分離法的分離原理Fig.5 Separation principle of membrane separation

對于蚯蚓多肽等熱敏性物質,膜分離法能有效減少成分損失,且不改變蚯蚓多肽的物理性質。Fu 等[31]通過中空纖維膜分離-體積排阻色譜法從蚯蚓粗提物中分離純化出3種高純度的活性多肽,純化效率較高。

表2總結了實驗室采用的蚯蚓多肽純化方法的優缺點及主要適用范圍,工業上采用的蚯蚓多肽的純化工藝還需進一步研究。

表2 蚯蚓多肽純化方法的優缺點及主要適用范圍

3 蚯蚓多肽的藥理作用

蚯蚓多肽中的多種活性成分具有不同的藥理作用,目前具有抗氧化和抗凝血作用的蚯蚓小分子活性肽在神經系統和免疫系統中的應用較為成熟。

3.1 對神經系統的作用

蚯蚓中的有效成分抗凝肽、溶栓肽和纖維酶[15]等可通過抗凝、溶栓、調節纖溶系統平衡等機制,抑制血栓形成,改善腦循環[32]。蚯蚓中的蚓激酶(LK)具有類似纖溶酶原激活物的作用,聯合氯吡格雷可治療短暫性腦缺血發作,并對糖尿病有明顯療效[33]。癲癇作為一種神經系統綜合征,其發作主要與中樞神經系統內的興奮性氨基酸和抑制性氨基酸之間的平衡失調有關,蚯蚓不僅可以降低興奮性谷氨酸的含量,同時可以提高抑制性氨基丁酸的水平,改善興奮性與抑制性氨基酸神經遞質的平衡失調,從而延長癲癇發作的潛伏時間[34]。蚯蚓中的蚓激酶、不飽和脂肪酸等成分對血管性癡呆、阿爾茲海默癥等神經系統疾病均可以起到不錯的治療效果[35]。

3.2 對呼吸系統的作用

張勝碧等[36]研究發現,高劑量蚯蚓提取液與地塞米松結合使用能顯著降低基質金屬蛋白酶(MMP)2/基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1值(P<0.05),通過調節MMPs/TIMP-1平衡,對哮喘小鼠氣道重塑具有一定的改善作用;蚯蚓提取液通過改善氣道炎癥、抗阻胺、舒張支氣管等作用,以緩解支氣管痙攣,從而發揮平喘的作用。汪磊等[37]將蚯蚓與其它中藥搭配使用,對不同程度的哮喘都有一定的緩解作用。

3.3 對心血管系統的作用

趙信科等[38]研究發現,地龍降壓膠囊通過抑制RAAS系統過度激活及TGF-1、VEGF等蛋白的表達從而發揮明顯的降壓作用,從蚯蚓中提取的次黃嘌呤已在臨床上用作降壓藥的有效成分。蚯蚓中提取的抗菌活性肽能有效抑制牙齦卟啉單胞菌的生長,預防牙周炎的發生[39]。此外,蚯蚓多肽與疏血通結合,通過激活MYPT1/LIMK1/Cofilin通路以促進缺血后血管的生成,有效改善缺血問題[40]。

3.4 對免疫系統的作用

蚯蚓提取液通過抑制JAK-STAT3通路,從而抑制結腸癌移植瘤的生長及血管新生[41];蚯蚓提取液通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化,預防結腸炎后結腸癌的發生與發展[42];蚯蚓提取液中還含有抑制肺腺癌細胞的活性成分[12];蚯蚓組織中存在既可抑制腫瘤細胞生長,又可促進骨髓原始細胞增殖造血的活性物質,能夠改善血液流變,從而改善全身各組織器官代謝[43];蚯蚓中提取的抗氧化酶可有效清除氧自由基,阻斷過氧化反應,從而修復受損部位,加速創面愈合[44];此外,蚯蚓多肽還可調控炎癥因子表達,抑制炎癥反應,從而改善炎癥損傷[45]。

3.5 對運動系統的作用

G-90是一種從蚯蚓中提取的蛋白肽[46],含有多種生長因子,可以促進成骨細胞的分化和增殖,增強基質鈣沉積能力,提高堿性磷酸酶、骨橋蛋白和骨鈣素的表達水平。Hussain等[47]從分子量大小和氨基酸組成等方面對從蚯蚓中提取的6種抗菌肽進行了評價,發現其中1種抗菌肽可以提高神經元增殖能力,改善運動功能障礙和多巴胺神經退行性病變[44]。

3.6 止痛類作用

古籍中早有記載,VQ-5和AQ-5是從蚯蚓中提取的2種具有鎮痛和抗炎作用的多肽[48],通過抑制具有鎮痛和抗炎功能的絲裂原激活蛋白激酶信號通路,表現出良好的鎮痛作用,是一種新型鎮痛藥物成分。徐杰等[49]研究發現,抗炎消腫藥頸腰康膠囊的有效成分來源于蚯蚓提取液中的多肽類活性物質。包銀萍等[50]通過動物實驗及人體安全性評價證明,蚯蚓多肽對皮膚無刺激,具有良好的抗炎、抗敏、修復等功效,可作為安全無刺激的化妝品原料。

3.7 其它作用

由于蚯蚓多肽的成分復雜,許多學者對蚯蚓多肽的成分及藥理功效進行了大量研究[51-55]。除了上述作用外,蚯蚓多肽提取液也可作為一種全方位的特效藥應用于臨床試驗,在胃潰瘍、抗疲勞、預防高脂、降脂、解熱、抗驚厥等方面都有一定的功效。

4 結語

我國蚯蚓資源豐富,利用牛糞、秸稈、污泥等農業廢棄物養殖蚯蚓,具有顯著的經濟效益和環保效益。酶解法由于條件溫和且不會破壞蛋白質中的活性多肽和氨基酸結構,更有利于蚯蚓活性多肽的提取。針對不同種類酶,蚯蚓蛋白的最佳酶解工藝還需進行具體探索。蚯蚓多肽作為一種新的生物制劑,在神經系統、心血管系統等方面疾病的治療中發揮重要作用,地龍注射液、多肽地龍蛋白等多肽類產品已應用于臨床。由于蚯蚓多肽的成分較為復雜,目前針對不同活性蚯蚓多肽的提取和純化還處在發展階段,廣泛使用的多肽純化方法主要有層析法、電泳法和膜分離法等,但上述方法僅限于實驗室研究階段,未有成熟的工業化應用。對于蚯蚓多肽中的活性成分的應用也還處于探索階段,多數活性成分尚未在臨床上驗證,因此,蚯蚓多肽具有十分廣闊的開發應用前景。