美拉德反應中間體2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4(H)吡喃-4-酮的研究進展

白冰,何靜,楊靜,趙明林,王清福,陳芝飛,王秋領

1(鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院,河南 鄭州,450000)2(河南中煙工業有限責任公司技術中心,河南 鄭州,450000)

還原糖與氨基酸參與的美拉德反應產生了包括香味成分在內的大量產物,根據反應條件的不同,美拉德反應產物風味也隨之改變,其中2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4(H)吡喃-4-酮(2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one,DDMP),是美拉德反應極其重要的中間體之一,對美拉德反應的調控起到關鍵作用。對DDMP的研究始于二十世紀60年代末。1967年,TATUM等[1]報道了橙汁粉中存在的一種呋喃烯醇酮化合物,同年,SHAW等[2]在己糖酸降解產物中也發現了這種化合物。但直到1970年,MILLS等[3]對該化合物進行核磁、質譜表征,才證實了TATUM和SHAW所報道的是同一種化合物,并將其結構更正為2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one(圖1)。隨后,在眾多的天然和加工食品中也不斷發現DDMP的存在。由于DDMP具有廣泛的生理活性,降解產物對食品風味及安全性有重要的影響,作為香料前體物和藥物具有良好的開發前景,近年來受到了極大的關注。

圖1 DDMP結構Fig.1 Structure of DDMP

1 DDMP的存在

DDMP廣泛存在于天然食品、加工食品和一些藥用植物及中藥材中。GURAV等[4]利用GC-MS對印度花椒果實的甲醇提取物進行鑒定,無論是成熟還是完熟的花椒果實中均含有一定量的DDMP,且完熟的花椒果實中DDMP含量更高。SIDDEEG等[5]通過GC-MS分析了椰棗的揮發性成分,其中DDMP含量接近10%,可能是椰棗中抗氧化的關鍵成分。ALI等[6]比較了5個品種芒果果皮提取物成分差異,以及抗氧化和抗增殖活性,發現DDMP是芒果皮中主要的活性成分,在治療人類宮頸癌以及作為抗氧化劑在食品和醫藥工業中有潛在的應用。PADMASHREE等[7]在旋花科植物海南薯中發現DDMP。研究者們從食用擔子菌日本白雪茸中分離得到了DDMP,通過HPLC法測得其含量為3.5 mg/g,活性測試結果表明,DDMP為白雪茸中主要的抗氧化活性物質之一[8-9]。陳凡等[10]對番石榴果進行提取得到了芳香浸膏,并采用GC-MS對芳香浸膏進行成分分析, 鑒定出了5-羥甲基糠醛(71.47%)、DDMP(6.44%)、糠醛(4.69%)、乙酸(2.54%)、庚酸(1.70%) 等為番石榴浸膏的主要成分。RODRIGUEZ等[11]利用超臨界CO2萃取對牛蒡根進行提取,并利用GC-MS對提取物進行分析,結果顯示牛蒡提取物中的主要成分為鄰苯二甲酸二異辛酯、DDMP、甘油和十五醛。

食品的熱加工過程也會大量積累DDMP。BIN等[12]對全麥面包中苦味成分進行了研究,鑒定出了包括DDMP在內的8種化合物,其中DDMP的含量與面包皮中的感知苦味呈極顯著相關(α=0.01),推測其為全麥面包苦味的主要呈味物質。PEREIRA等[13]發現咖啡濕加工過程會產生DDMP。SUN等[14]發現DDMP存在于經過熱加工的大蒜油中。QIN等[15]利用GC-MS對玫瑰茶的揮發性成分進行分析,發現DDMP 含量僅次于苯乙醇和丁香酚,是玫瑰茶中的主要成分之一。LASEKAN[16]對油莎草油進行GC-MS分析,共鑒定出包括DDMP在內的75種氣味活性揮發物,通過風味稀釋因子和氣味活性值對香氣貢獻進行量化,發現DDMP對油莎草油的香氣有重要貢獻。HWANG等[17]從加熱過的洋蔥中分離鑒定出了DDMP,并對其進行了抗氧化活性測試;HWANG等[18]又利用活性跟蹤的手段,從經過熱處理的沙梨果汁的乙酸乙酯提取部分分離鑒定出了DDMP。呂姍等[19]考察不同烘焙溫度對大棗品質的影響,發現隨著烘焙溫度的升高,DDMP含量也不斷提高,QIAO等[20]、SONG等[21]建立了頂空固相微萃取-氣相色譜-串聯質譜分析法,對烘焙紅棗中的DDMP含量進行了測定,該方法標準曲線在0.01～100 μg/mL呈線性,檢測限為0.1 ng/g,所測定的5種烘焙紅棗中DDMP含量在4.55～46.50 μg/g。

在藥用植物中也發現了DDMP的存在,一些中藥材在炮制過程也會產生DDMP。RAGUPATHI RAJA KANNAN等[22]利用GC-MS對幾種具有藥用價值的海草成分進行分析,鑒定出包括DDMP在內的24種化合物,這也是首次發現DDMP存在于海草中。印度葛根是傳統上被用作抗衰老保健食品,SHUKLA等[23]對其水提取物腎臟保護作用機制進行了研究,發現其作用是通過水提物中的抗氧化活性化合物抑制氧化應激和細胞凋亡來實現的,而DDMP是葛根水提物中含量最高的成分之一,對其活性起到關鍵作用。錢曉東等[24]研究加熱炮制對不同來源當歸藥材新產生成分的影響,結果顯示,當歸加熱炮制后,會生成5-羥甲基糠醛和DDMP 兩個新的化學成分。

近年報道的部分DDMP來源及潛在功能見表1。

表1 DDMP來源及潛在功能Table 1 Sources and potential functions of DDMP

2 DDMP的形成與降解

上述天然和加工食品中存在的DDMP,一般認為是通過美拉德反應及Amadori化合物降解產生,大多數研究認為來源于己糖降解,其中1-脫氧葡萄糖醛酮(1-deoxy-D-glucosone,1-DG)是形成DDMP的關鍵中間體。

ZHOU等[43]研究了固相美拉德反應體系中多種因素對DDMP形成的影響,比較了還原糖(葡萄糖或果糖)和幾種氨基酸(L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-酪氨酸和L-賴氨酸)作為原料形成DDMP的反應活性。研究發現,在脯氨酸與葡萄糖反應體系中,DDMP生成量較大,且在葡萄糖與脯氨酸的物質的量比為2∶1時達到最高水平;氧氣對DDMP的形成沒有明顯影響。DDMP形成的動力學研究表明,DDMP在形成的初始階段為一級反應,其活化能為68.8 kJ/mol。這說明在美拉德反應中,DDMP的形成極大依賴于底物種類(糖、氨基酸)及底物的比例。

1-DG在己糖參與的美拉德反應中作為高活性中間體,對美拉德產物的形成起著重要作用。VOIGT等[44]對1-DG的降解進行研究,發現1-DG在O2存在下,其主要的降解產物為乳酸和甘油酸(圖2)。而DDMP能夠通過水合作用形成少量的1-DG,且DDMP在O2催化下的降解產物與1-DG完全相同。由此推測在美拉德反應中,糖與氨基酸首先形高活性中間體1-DG,1-DG隨后降解形成DDMP。

圖2 1-DG的降解Fig.2 Degradation of 1-DG

學者們對基于葡萄糖-氨基酸模型的固相和液相美拉德反應進行了研究,以進一步明確1-DG 形成DDMP的條件(圖3)[45-47]。

結果顯示,賴氨酸和脯氨酸分別在液相和固相反應系統中促進了DDMP的產生,這表明反應強度和氨基酸性質是介導DDMP產生的主要因素。通過對DDMP形成的烯醇化前體物進行定量監測,表明其途徑為2,3-烯醇化產生1-DG,1-DG進一步轉化為DDMP,水分含量較低的條件下易于形成DDMP;相應的,在水分含量較高的體系中,由于2,3-烯醇化轉變為1,2-烯醇化,其中間體為3-脫氧葡萄糖醛酮,最終轉化為5-羥甲基糠醛。

KIM等[48]認為DDMP也只是美拉德反應的中間產物,為了證實這一點,他們對不同條件下的DDMP熱解反應進行了研究,模擬了烘焙和弱酸性水溶液加熱2種體系條件,通過同位素標記的方法,檢測了DDMP的降解產物。結果表明,DDMP在pH 5.8的水溶液中150 ℃加熱1 h,有30%發生降解,生成56種化合物,降解產物中2,3-戊二酮含量最高(19%),其次是2-甲基-3-呋喃酮(15.4%)、1-羥基丙酮(3.9%)等;當DDMP置于220 ℃下加熱30 min,鑒定出了13種化合物,主要以5-羥基麥芽酚、麥芽酚、二氫麥芽酚、呋喃酮、2,4-二羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮等吡喃或呋喃烯醇酮類焦甜香物質為主,結合13C標記位置,可推測其形成途徑如下(圖4)。

圖4 DDMP在220 ℃條件下的降解途徑及產物Fig.4 Degrade pathway and products of DDMP under 220 ℃

由此可見,DDMP在美拉德反應中扮演著中間體的角色,還原糖首先與氨基酸經Amadori重排,繼而通過1-DG生成DDMP,氨基酸和糖的種類,反應的濕度條件對DDMP的生成影響較大。而DDMP在氧化劑作用下降解生成小分子酸,在中性高溫條件及潮濕酸性條件下可降解生成不同的呋喃、吡喃類風味物質,賦予美拉德反應特有的焦甜香風格。

3 DDMP的生理活性

3.1 抗氧化活性

美拉德反應產物具有廣泛的抗氧化活性[49-50],但其中主要的活性化合物尚不完全清楚。YU等[51]對葡萄糖-組氨酸參與的美拉德反應產物的抗氧化物質基礎進行了研究。采用Bio-gel P-2聚丙烯酰胺凝膠色譜柱對反應產物進行了分段,并對各段的抗氧化活性進行了評價。結果表明H7組分具有最強的抗氧化活性,通過GC-MS分析和HPLC分析確定了H7中的主要化合物為DDMP。對DDMP清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基能力和還原能力進行了測定,表明DDMP具有強抗氧化活性,對美拉德反應產物的抗氧化活性的貢獻最大。

熱加工食品由于涉及美拉德反應,在加工過程產生的DDMP同樣會對食品的抗氧化能力產生影響。ECHOVSK等[32]研究了不同干燥溫度下處理的西梅的抗氧化能力。結果顯示低溫干制(60 ℃)對西梅的抗氧化能力影響不明顯,而高溫(>75 ℃)干制促進西梅抗氧化能力顯著提高。進一步研究表明,在高溫干制過程中,DDMP含量明顯增加,且其增加量和抗氧化能力呈正相關性。

有學者研究了DDMP結構與抗氧化能力之間的關系,發現當烯醇式羥基被鍵合后,DDMP失去了抗氧化活性,而當C-3位仲醇羥基被鍵合后,DDMP仍然保持抗氧化能力,說明DDMP的抗氧化能力與其烯醇酮結構密不可分[52-53]。通過核磁共振氫譜譜圖可以看出,DDMP淬滅DPPH自由基按照1∶2的物質的量之比進行,由此推測DDMP抗氧化過程涉及2步反應(圖5)。首先,DDMP被氧化為5-羥基-6-甲基-2H-吡喃-3,4-二酮,并迅速異構化為5-羥基麥芽酚,5-羥基麥芽酚繼續被氧化,最終降解生成開環產物。通過核磁共振碳譜譜圖δ206～197和δ174 ～168處的信號,可以看出開環產物主要是酮和酸。這與KANZLER等[54]的研究一致,即DDMP在起到抗氧化作用的同時,自身也被氧化降解為甘油酸和乳酸。

圖5 DDMP抗氧化機理Fig.5 Proposed antioxidant mechanism of DDMP

3.2 抗腫瘤活性

BAN等[55]研究了從洋蔥中分離的DDMP通過調節NF-κB活性,從而誘導結腸癌細胞凋亡死亡的作用。結果顯示,不同質量濃度的DDMP(0.5～1.5 mg/mL)作用不同時間(0～48 h)均能夠抑制結腸癌細胞(SW620和HCT116)的生長,并呈劑量依賴關系。DDMP對腫瘤壞死因子α(TNF-α)和醋酸佛波醇誘導的NF-κB轉錄和DNA結合活性有調節作用。此外,DDMP也可抑制NF-κB靶向抗凋亡基因,同時誘導凋亡基因的表達。這些結果表明,洋蔥中的DDMP通過抑制NF-κB而誘導細胞凋亡,從而起到抑制結腸癌細胞生長的作用。

3.3 神經活性

BEPPU等[56]報道了從戊糖乳桿菌菌株S-PT84培養上清液中分離到3個化合物,并對其對大鼠腎交感神經活性的影響進行了研究。其中DDMP增加大鼠的腎交感神經活性最高,增加量為408%。通過十二指腸注射DDMP可增加棕色脂肪組織交感神經活性[(118±15.3)%],而通過口腔內注射DDMP可使大鼠體溫高于肩胛間棕色脂肪組織的溫度[(0.72±0.13) ℃]。這些結果表明DDMP可以促進自主神經的活動。

3.4 抑菌活性

血紅密孔菌是一種常見于熱帶及亞熱帶低中海拔林區的木材腐生菌,其次生代謝產物有很強的抑菌作用,可作為生物活性化合物的潛在來源。TEOH等[57]研究了麥芽提取物、酵母提取物、葡萄糖和麥芽糖作為培養基對血紅密孔菌代謝產物抗菌活性的影響,并采用GC-MS分析了該菌提取物中的成分,結果表明DDMP是血紅密孔菌發酵液的主要成分,也是起到抑菌作用的主要活性成分。

3.5 心臟保護活性

CORDERO等[30]研究了酸角果實在阿霉素誘導的心臟毒性模型中的心臟保護作用。與陽性對照纈沙坦相比,酸角果實提取物顯著(P<0.05)降低了C反應蛋白、血清肌鈣蛋白I、天冬氨酸轉氨酶、乳酸脫氫酶和肌酐激酶MB、總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量,并能提高高密度脂蛋白含量。分子對接結果表明,酸角果實主要成分中的DDMP與人血管緊張素II 1型受體有很高的親和性,說明DDMP是酸角果實中起到心臟保護作用的關鍵化合物。

4 DDMP感官特性

由于DDMP在熱加工食品中廣泛存在,其對食品感官上的影響不容忽視,長期以來,對DDMP感官感受一直存在爭議。

DDMP屬于吡喃烯醇酮類化合物,在結構上與常用焦糖香物質麥芽酚、呋喃酮等類似,具有揮發性,同時兼具較高的脂溶性和水溶性。PITTET等[58]認為,這類具有平面狀烯醇-羰基結構的環狀二碳基化合物往往具有焦糖樣香味,因此DDMP在早期被描述為具有焦糖樣氣味,但SHAW等[59]通過反復重結晶得到的DDMP幾乎沒有氣味,KIM等[48]也發現DDMP盡管無氣味,但加熱后會產生焦糖樣以及融化的黃油氣味。也有研究認為DDMP具有烘焙香氣[60]。

隨后對DDMP感官特性的研究主要集中在味覺上。周志磊[61]報道了DDMP在水溶液中的甜味閾值為0.25 g/L,并且和卷煙主流煙氣的“甜感”呈顯著的正相關。而BIN等[12]則認為,DDMP的含量與全麥面包皮中的苦味呈極顯著相關,因此被認為是全麥面包皮中主要的苦味呈味物質。LI等[62-64]也認為,DDMP是焦糖化反應以及美拉德反應中的主要苦味物質,一些酚酸類物質如沒食子酸、咖啡酸等,可以通過抑制1-DG的氧化降解從而阻止DDMP的生成。

對上述爭議進行深入研究可以發現, DDMP感官評價的不確定性主要受所制備的DDMP對照樣品純度的影響。DDMP無商品化來源,其對照樣品的制備無論是以葡萄糖為原料合成,還是以食品為原料進行分離得到,均基于美拉德或焦糖化反應,期間有大量的物質包括苦味物質生成,由于DDMP產率極低,在純化時不可避免會引入苦味雜質。為此,CHEN等[65]以麥芽酚為原料合成了DDMP,避免了復雜的美拉德反應產物生成,感官評價表明,該方法合成的DDMP無任何味覺感受,而通過經典方法合成的DDMP確實有苦味。進一步分析發現,經典方法合成的DDMP通過LH-20凝膠純化后,苦味消失,說明其苦味主要受美拉德反應所帶來的副產物的影響,而純凈的DDMP為無味化合物。

5 DDMP的制備

作為美拉德反應中間體,DDMP的制備可通過美拉德反應實現。經典的合成方法以葡萄糖為原料,并通過二級胺和有機酸催化,使反應停留在DDMP生成階段;由于美拉德反應產物復雜,DDMP的純化同樣重要。VAN DEN OUWELAND等[66]以葡萄糖為原料,哌啶和乙酸為催化劑,通過連續萃取、柱層析、重結晶等純化步驟制得了DDMP,最終產率為5%;陳永寬等[67]參照上述合成條件,通過萃取、減壓蒸餾、重結晶等步驟得到的DDMP產率為3%。由此可見,DDMP產率不僅受合成條件影響,同時很大程度上受純化條件影響。

CHEN等[65]以麥芽酚為原料,通過酯化保護、氫化還原、乙酰氧化、酶水解和堿水解5步反應合成了DDMP(圖6)。該合成路線的關鍵在于二乙?；鵇DMP的水解,甲醇鈉、NaOH、K2CO3、1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯(1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene,DBU)等常見堿水解體系使得產物極其復雜難以分離。通過對脂肪酶的篩選,確定了利用假絲酵母菌來源的脂肪酶可高效水解3位乙?；?進而利用弱堿Na2CO3可水解掉5位乙?；?反應總產率30%左右,利用該方法可獲得高純度DDMP。

圖6 DDMP合成路線Fig.6 Synthesis of DDMP from maltol

6 展望

食品中的美拉德反應以及后續反應非常復雜,在產生風味物質和活性物質的同時,也會產生一些有害物質,因此,對美拉德反應產物進行控制一直是研究的熱點[68],但目前為止,尚沒有可靠的調控方法,而DDMP作為美拉德反應中的重要中間體,是許多風味物質的前體,或許是美拉德反應調控的關鍵。目前,盡管已在模型水平上對DDMP形成及降解的影響因素和途徑有了初步的研究,但在食品基質中研究尚未開展,因此,未來有必要進一步加強食品基質中DDMP的相關研究,從而更好的指導美拉德反應風味物質的靶向調控。

DDMP具有廣泛的抗氧化、心臟保護等作用,作為食品功能添加劑和藥物開發有著良好的前景;此外,DDMP受熱釋放呋喃酮、麥芽酚等香味物質,可作為特色焦甜香香料前體進行開發,應用于卷煙、食品等的緩釋加香。目前DDMP產品產率偏低,因此,有必要進一步加強DDMP制備技術研究,以滿足作為活性物質和香料開發的需求。