動脈粥樣硬化斑塊內新生血管與斑塊穩定性的相關性*

張一帆，李芳，李啟玉，邵醒

1 貴州中醫藥大學 貴州貴陽 550022

2 貴州中醫藥大學第二附屬醫院 貴州貴陽 550002

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）是一種慢性炎性疾病，在多種因素的作用下，導致血管內膜通透性發生改變，且巨噬細胞源性和平滑肌細胞源性泡沫細胞形成和細胞外基質合成增加，經過演變后最終形成凸向管腔的占位性病變，即AS斑塊[1]。目前研究已表明，斑塊的穩定性與斑塊內新生血管的形成密切相關[2]，AS新生血管促進粥樣硬化的發生發展，誘發斑塊內出血、斑塊破裂及其并發癥的形成，是促進穩定型斑塊向不穩定型斑塊發展的重要機制。在AS的早期既有新生血管存在，生理狀態下新生血管一般存在于管壁的外膜和中膜之間，不會向內膜延伸[3]，但炎性反應、低氧環境、脂質水平及氧化應激等因素會刺激新生血管向內膜生長，從而影響新生血管的數量及斑塊的穩定性[4]。本研究意在通過動物實驗探討AS斑塊內新生血管和斑塊穩定性的相關性。

實驗材料與方法

1 實驗動物

雄性新西蘭白兔51只，體質量（1.952±0.033）kg，飼養于貴州中醫藥大學實驗動物研究所。

2 材料

藥品：膽固醇、豬膽鹽、牛血清白蛋白（上海源葉生物，S11040，S30895，S90486），包括主要相關測定試劑盒、染色液、藍化液等。主要儀器：-80℃冰箱（BDF-86V348，BIOBASE，上海漢諾儀器有限公司），微型離心機（德國eppendorf），低溫高速冷凍離心機（德國eppendorf），電熱恒溫培養箱（DHP-9054，山東博科生物產業有限公司），電熱鼓風干燥箱（DHG-9070A，恒科學儀器有限公司），熱恒溫培養箱（DHP-9054，山東博科生物），AL104電子天平（上海旦鼎國際貿易有限公司），其他：不同規格移液器、不同規格離心管等。

3 實驗方法

3.1 實驗動物分組、飼養及造模方法

3.1.1 實驗分組 將50只雄性白兔安置入實驗室后，逐一稱重并記錄，適應性喂養3d，隨機選取12只白兔，作為空白對照組（n=12），并予普通飼料喂養；將剩余38只白兔予高脂飼料喂養，在喂養實驗過程中，高脂飼料喂養的兔子因灌胃、腹瀉等相關原因死亡10只，在第八周末，隨機選取1只高脂飼料喂養的實驗兔解剖為模型組，證明AS造模成功。遂將剩余27只高脂飼料喂養的AS實驗兔隨機分為：高脂飲食組（n=9）、中藥復方組（n=9）、阿托伐他汀組（n=9）?？瞻讓φ战M不予特殊干預，自由飲水、普通飼料喂養。

3.1.2 造模方法 AS造模采用高脂飲食聯合免疫損傷的方法。實驗兔子適應性喂養3d后，逐步添加高脂飼料（普通飼料 78.9%、膽固醇 1%、豬膽鹽 0.1%、蛋黃 10%、豬油 10%）（在添加高脂飼料的過程中實驗兔因腹瀉死亡10只），耳緣靜脈注射牛血清白蛋白，濃度 20%（10g/50mL），以 250mg/kg 的量注射，每周一次，連續三周。AS模型建立成功后，隨機選取一只解剖為模型組，余兔子隨機分為高脂飲食組（n=9）、中藥復方組（n=9）、阿托伐他汀組（n=9）。

3.2 血液、動脈標本采集及保存方法

取血液標本：予10%水合氯醛（4mL/kg）經腹腔注射麻醉，通過角膜反射測試實驗兔完全麻醉成功后，四肢、牙齒固定于解剖板上，將頸部、胸部、腹部剪刀備皮。從腹正中線，由淺入深后依次切開皮膚、肌肉，使腹腔及腹主動脈完全暴露（注意腹腔壓力較大），取血5mL，立即分離血清，后存放于貴州中醫藥大學中心實驗室-80℃冰箱中冷藏備用。

取動脈標本：同前麻醉成功且固定后，由胸骨柄由下往上，依次切開皮膚、肌肉等，沿著腋前線剪開充分暴露胸腔（操作要迅速），立即予分離出胸主動脈并用血管鉗夾閉遠端，找到斑塊最明顯處，用組織剪取下，將其放入 PBS 溶液，洗凈殘留血液，后用玻璃分針分離血管壁上的脂肪等多余組織，后放入4%多聚甲醛溶液、2.5%的戊二醛溶液固定，存放于 4℃的冰箱備用。取完標本后，將實驗兔安樂死。

3.3 指標檢測 檢測所取腹主動脈血清標本中的TG、T-CHO、LDL-C、HDL-C的值。用PCR法檢測組織標本中CD34的mRNA表達量。胸主動脈HE染色結果及CD34免疫組化結果。

4 統計學方法

采用SPSS 26.0統計軟件分析數據，所有數據先進行正態性檢驗，符合正態分布，多組間比較采用單因素方差分析進行數據分析，以均數±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異具有統計學意義。

實驗結果

1 空白組與高脂飲食組血脂比較情況

與空白組相比，高脂飲食組總膽固醇（T-CHO）、甘油三酯、（TG）高密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）在4周、8周、12周時均升高明顯，HDL-C降低明顯（P＜0.05）。見表1、表2、表3。

表1 第4周時高脂組與空白組生化指標比較（±s）

表1 第4周時高脂組與空白組生化指標比較（±s）

組別例數TG/mmol·L-1T-CHO/mmol·L-1LDL-C/mmol·L-1HDL-C/mmol·L-1空白對照組40.742±0.0205.316±0.5830.720±0.0321.176±0.075高脂飲食組31.430±0.03811）31.69±1.2681）4.193±0.2021）0.327±0.0321）

表2 第8周時高脂組與空白組生化指標比較（±s）

表2 第8周時高脂組與空白組生化指標比較（±s）

組別例數TG/mmol·L-1T-CHO/mmol·L-1LDL-C/mmol·L-1HDL-C/mmol·L-1空白對照組41.107±0.1036.514±0.3650.863±0.0930.946±0.084高脂飲食組31.426±0.1191）47.38±0.8511）4.645±0.2901）0.208±0.0241）

表3 第12周時高脂組與空白組生化指標比較（±s）

表3 第12周時高脂組與空白組生化指標比較（±s）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05

組別例數TG/mmol·L-1T-CHO/mmol·L-1LDL-C/mmol·L-1HDL-C/mmol·L-1空白對照組41.281±0.1636.923±0.001.047±0.1170.563±0.096高脂飲食組34.120±0.1851）6.923±0.001）7.719±0.6351）0.125±0.0241）

2 模型組與高脂飲食組CD34的mRNA定量表達結果

與模型組相比，高脂飲食組CD34在4周、8周、12周時的表達量均＞1，增長明顯（P＜0.05）。見表4。

表4 模型組與高脂飲食組4周、8周、12周時CD34相對表達量的比較（±s）

表4 模型組與高脂飲食組4周、8周、12周時CD34相對表達量的比較（±s）

注：相對表達量：CD34的表達量用采用相對表達量計算，以模型組表達量為1，各組的表達量為相對于在模型組中表達的倍數。在P＜0.05 的情況下，相對表達量＜1，說明目的基因在實驗組中表達下調；＞1 說明表達上調；模型組CD34表達量數據不符合正態分布，其與空白組比較屬于組間比較，采用秩和檢驗。

組別例數4周8周12周模型組4 1.000±0.0001.000±0.0001.000±0.000高脂飲食組3 1.392±0.298 1.172±0.141 4.225±0.536

3 胸主動脈HE染色結果

4周、8周、12周空白對照組均未見AS病灶，為正常主動脈壁，內膜、中膜、外膜結構完整，動脈內壁光滑，無細胞增生，肌層厚度均勻，內膜下無泡沫細胞聚集，彈力纖維排列整齊，無斷裂現象。高脂飲食組：4周時，動脈內膜改變，內膜下可見泡沫細胞聚集，內膜增厚，中膜和外膜結構完整，彈力纖維排列整齊，無斷裂現象，為AS的脂紋期的病理改變；8周和12周時，動脈結構改變，內膜下可見大量泡沫細胞形成纖維斑塊病變，大量泡沫細胞及膽固醇結晶形成AS期病灶。泡沫細胞極度膨大，呈圓形或者橢圓形，發生氣球樣改變，彈力纖維部分斷裂，溶解，為AS的纖維斑塊期。見圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6。

圖1 空白對照組4周

圖2 空白對照組8周

圖3 空白對照組12周

圖4 高脂飲食組4周

圖5 高脂飲食組8周

圖6 高脂飲食組12周

4 胸主動脈CD34免疫組化結果

4周、8周、12周時空白對照組主動脈均為內膜光滑，未見新生血管標記，也未見斑塊形成。4周、8周、12周時高脂飲食組均有內膜改變，CD34染色均呈陽性表達，且隨時間的推移，陽性表達逐漸增強，內膜下可見大量藍紫色細胞核聚集，為CD34標記的新生血管，證明高脂飲食造模成功的實驗兔斑塊內新生血管在不斷生長。見圖7、圖8、圖9、圖10、圖11、圖12。

圖7 空白對照組4周

圖8 空白對照組8周

圖9 空白對照組12周

圖10 高脂飲食組4周

圖11 高脂飲食組8周

圖12 高脂飲食組12周

討 論

AS斑塊內新生血管是指原有的毛細血管通過血管內皮細胞的增殖與遷移，從已存在的血管中以芽生或非芽生的形式生成新的毛細血管的過程[5]，在AS的早期既有新生血管存在，斑塊內新生血管管腔結構尚不成熟，發育不完善，僅由內皮細胞組成，無結締組織支撐，多數新生血管管腔明顯擴張，脆性大，容易發生破裂出血，使斑塊體積增大，加重血管腔的狹窄程度[6-7]。滋養血管繼續延伸擴大使斑塊內出血的可能性增加。另一方面，AS斑塊內新生血管的形成為炎性細胞進入斑塊的提供通道，炎性細胞激活斑塊肩部的巨噬細胞，促使它們分泌MMP或膠原酶，消化對斑塊穩定性有保護作用的纖維帽，纖維帽更加薄弱。從而導致斑塊出現裂隙、破裂隨之血小板黏附、聚集、血栓形成引起急性冠脈綜合征[8]。同時炎性細胞及其炎性產物使AS斑塊脂質中心的擴大，纖維組織完整性被破壞，胞外基質降解，這些都增加了斑塊破裂的可能。也有研究證實：斑塊內新生血管的檢出率隨著AS病變的進展而逐漸增加[9]。并且病理分析顯示這類新生血管周圍常伴有新鮮出血或含鐵血黃素沉積，表面病灶局部常有出血吸收的發生[10]。因此新生血管和AS斑塊穩定密切相關，斑塊內血管新生是粥樣斑塊發展進程中的重要伴隨現象，斑塊不穩定與斑塊內新生血管破裂出血有關，抑制斑塊內血管新生可以增強斑塊的穩定性[11]。斑塊內新生血管和低氧環境、炎性反應、血管生長因子、脂質代謝、吸煙等因素相關[12]。研究表明，脂質代謝中HDL-C及LDL-C異常會影響斑塊內血管的生成[13]，低氧環境下，HDL-C誘導斑塊內新生血管生成；在正常氧濃度時，LDL-C促進斑塊內新生血管生成。低氧環境時，HDL-C可增強缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）、血管內皮生長因子（VEGF）通路，維持了HIF-1α的穩定性，HIF-1α通過VEGF、一氧化氮和活性氧3種途徑引起內皮細胞發生改變，誘導新生血管生成，促進了AS 的發展[14-15]；正常氧濃度時，氧化型低密度脂蛋白在巨噬細胞中增加 HIF-1 和 VEGF 的表達，誘導血管內皮細胞增值，促進新生血管形成[16]。目前在研究新生血管時，常用的血管內皮標志物有CD34、CD31、CD105、CD146和vWF等。與其他血管內皮標志物比較，CD34的特異性及敏感性更高，便于觀察。新生血管內皮細胞標志物CD34是一種高度糖基化I型跨膜蛋白，分子量為105-120KD，由階段特異性白細胞分化，選擇性地在人類造血干細胞、祖細胞和血管內皮細胞表面表達。研究表明[17]，CD34為細胞間黏附及信號傳導提供了條件，促使內皮細胞分裂。新生的細胞在CD34的參與下向血管外遷移黏附，構建成新生血管的骨架。CD34在新生血管內皮中的表達量遠遠大于非新生血管內皮中的表達量，利用CD34抗體進行免疫組化染色可以測量微血管密度，因此本實驗將CD34作為AS斑塊內新生血管的標志物標記新生血管的表達量。

本實驗結果表明，在4周、8周、12周時，血脂檢測結果顯示，高脂飲食組與空白組相比，T-CHO、TG、LDL-C升高明顯，HDL-C降低明顯（P＜0.05）；與模型組對比，CD34的mRNA定量表達結果，高脂飲食組CD34的表達量＞1，且增長明顯（P＜0.05）；胸主動脈HE染色結果顯示，空白對照組均未見AS病灶，為正常主動脈壁，內膜、中膜、外膜結構完整，動脈內壁光滑，無細胞增生，肌層厚度均勻，內膜下無泡沫細胞聚集，彈力纖維排列整齊，無斷裂現象。高脂飲食組在4周時，動脈內膜改變，內膜下可見泡沫細胞聚集，內膜增厚，中膜和外膜結構完整，彈力纖維排列整齊，無斷裂現象，為AS的脂紋期的病理改變。8周和12周時，動脈結構改變，內膜下可見大量泡沫細胞形成纖維斑塊病變，大量泡沫細胞及膽固醇結晶形成AS期病灶，泡沫細胞極度膨大，呈圓形或者橢圓形，發生氣球樣改變，彈力纖維部分斷裂，溶解，為AS的纖維斑塊期，也說明AS家兔模型基本復制成功；免疫組化結果顯示，在4周、8周、12周時，空白組主動脈均內膜光滑，無斑塊形成，未見新生血管標記。高脂飲食組4周、8周、12周時均有內膜改變，CD34染色呈陽性表達，且隨時間的推移，陽性表達逐漸增強，內膜下可見大量藍紫色細胞核聚集，為CD34標記的新生血管，高脂飲食組的實驗兔斑塊內新生血管在不斷生長。

綜上所述，本實驗成功地復制了AS家兔模型，空白對照組動脈結構完整，未檢測出AS病灶，免疫組化未見標記新生血管的CD34染色表達；高脂飲食組隨著AS病理病程的進展，所檢出新生血管的量在逐步增加，新生血管內皮細胞標志物CD34陽性表達逐漸增強，證實了脂質代謝紊亂，LDL-C、HDL-C水平與斑塊內新生血管相關，新生血管為AS進展過程中重要的伴隨現象，AS斑塊不穩定性與斑塊內新生血管密切相關，且呈正相關性。