毛蕊花糖苷對冠心病大鼠炎癥及脂代謝的影響

任引剛,祝松濤(空軍軍醫大學第二附屬醫院老年醫學科,西安 710038;通訊作者,E-mail:SONGTAO850126@163.com)

冠心病(coronary heart disease,CHD)是一種由于脂代謝異常導致脂類物質沉著在動脈內膜上從而引起血管腔狹窄或阻塞的缺血性心臟病,隨著飲食結構、生活方式、人口老齡化的改變,冠心病的患病率不斷升高,嚴重威脅人類生命安全。冠心病的發生與脂代謝異常、炎癥、血管內皮功能受損等多種因素有關。毛蕊花糖苷(verbascoside,Verb)是一種從許多雙子葉植物中分離出來的糖苷類物質,毛蕊花糖苷具有多種藥理活性,包括抗氧化、抗炎、抗癌、神經保護、心血管保護、抗糖尿病、軟骨保護、肝臟保護和抗微生物等[1]。AMP激活的蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)信號通路是能量代謝的調控中樞,在脂代謝調節中具有重要作用[2,3]。激活AMPK信號通路可糾正脂代謝異常[2,3],并且可改善血管內皮功能[4]。冠心病患者體內脂代謝異常與AMPK失調有關[5]。核因子-κB(nuclear factor- κB,NF-κB)是經典的炎癥調節蛋白,與冠心病相關炎癥密切相關[6]。據報道,毛蕊花糖苷是一種AMPK激動劑[7],并且對NF-κB具有抑制作用[8]。目前,有文獻報道毛蕊花糖苷能抑制動脈粥樣硬化的進展[9],但尚無學者研究其在冠心病治療中的作用和機制。因此,本研究從炎癥和脂代謝兩個角度探討了毛蕊花糖苷治療冠心病的效果及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 70只8周齡雄性SPF級SD大鼠(300～350 g)購自陜西醫藥控股集團生物制品有限公司,生產許可證號:SCXK(陜)2018-001,大鼠飼養條件如下:12 h/12 h光暗照明、(23±2)℃、55%±5%濕度。

1.1.2 實驗試劑 毛蕊花糖苷(HY-N0021,純度:99.83%)購自美國Med Chem Express公司;垂體后葉素注射液(國藥準字H31022751)購自上海禾豐制藥有限公司;高脂飼料(D12492)、正常飼料(D12450J)購自美國Research Diets公司;游離脂肪酸(free fatty acids,FFA)試劑盒(A042-1-1)購自南京建成生物工程研究所;大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)(SEKR-0009)、細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)(SEKR-0030)、單核細胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)(SEKR-0024)ELISA試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;蘇木素伊紅(HE)染液、Trizol試劑(R0016)、BeyoRTTMⅢ cDNA第一鏈合成試劑盒(D7178M)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA試劑盒(P0010S)購自碧云天生物技術研究所;SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(RR820A)購自日本TaKaRa公司;PVDF膜(YB101123-1)購自美國Millipore公司;p-NF-κB p65一抗(ab86299)、NF-κB p65一抗(ab288751)、p-AMPKα一抗(ab133448)、AMPKα一抗(ab32047)、β-actin一抗(ab213262)、IgG H&L(HRP)二抗(ab6721)購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 冠心病大鼠模型的建立 參考文獻[10]方法,通過高脂飲食聯合腹腔注射垂體后葉素建立冠心病大鼠模型。取55只大鼠進行建模,使用高脂飼料喂養大鼠8周,最后3 d對大鼠腹腔注射30 U/(kg·d)的垂體后葉素。建模后,隨機處死3只大鼠進行病理學檢查,觀察冠脈內膜損傷、管壁脂質沉積、心肌排列紊亂、細胞腫脹等病變,另外,檢測大鼠心電圖,觀察到T波高聳、心律不齊、ST段抬高超過0.1 mV表示造模成功[11]。剔除飼養過程中出現外傷的大鼠。

1.2.2 動物分組及處理 將48只建模成功的大鼠隨機分為模型組、毛蕊花糖苷低劑量組(低劑量組)、毛蕊花糖苷中劑量組(中劑量組)和毛蕊花糖苷高劑量組(高劑量組),每組12只。另取12只正常飼料喂養的大鼠作為對照組。對照組和模型組大鼠每天灌胃2 mL生理鹽水,低、中和高劑量組大鼠每日灌胃2 mL劑量為20,40,80 mg/kg的毛蕊花糖苷(溶于生理鹽水)[12,13]。共灌胃4周。

1.2.3 心功能參數EF和FS的測定 末次給藥24 h后,使用加拿大VisualSonics公司生產的VEVO 3100小動物超聲成像系統評估大鼠的心功能。大鼠用異氟醚麻醉(5%用于誘導,2%～2.5%用于維持麻醉),仰臥位固定。左胸區脫毛,涂上偶聯劑。測定射血分數(ejection fraction,EF)和短軸縮短率(fraction shortening,FS)。

1.2.4 血清心肌損傷標志物、脂代謝指標和炎癥指標的測定 末次給藥24 h后,大鼠腹主動脈采血,3 000 r/min 4 ℃離心15 min,取血清。采用日立7600-010型生化分析儀檢測心肌損傷標志物[肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase-MB,CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)]和脂代謝指標[總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)]水平。根據試劑盒說明檢測血清炎癥指標(FFA、TNF-α、ICAM-1和MCP-1)水平。

1.2.5 心肌組織HE染色 處死大鼠并分離心臟,4%多聚甲醛固定24 h,然后石蠟包埋,制作4 μm厚的切片。根據試劑盒說明書進行HE染色。在奧林巴斯CKX53倒置顯微鏡下拍攝圖像。

1.2.6 qRT-PCR檢測AMPKα、PPAR-α、PPAR-γ和PGC-1α的mRNA水平 qRT-PCR檢測心肌組織中AMPKα、過氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPAR-α)、PPAR-γ和PPAR-γ激活分子1α(PGC-1α)的mRNA水平。使用Trizol試劑提取心肌組織總RNA,使用Thermo Scientific NanoDrop 1000超微量分光光度計計算RNA純度和濃度。使用BeyoRTTMⅢ cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。然后使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒在Bio-Rad CFX384實時熒光定量PCR儀上進行PCR。PCR反應條件如下:95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s,61 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s,40個循環。引物序列見表1。β-actin作為內參基因。使用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.7 Western blot檢測p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-AMPKα和AMPKα蛋白水平 通過Western blot檢測心肌組織中NF-κB p65和AMPKα的磷酸化水平。使用RIPA緩沖液提取總蛋白,采用BCA法進行蛋白濃度定量。10% SDS-PAGE電泳分離蛋白,然后轉移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h后,將膜與p-NF-κB p65(1∶5 000)、NF-κB p65(1∶5 000)、p-AMPKα(1∶3 000)、AMPKα(1∶3 000)和β-actin(1∶2 000,內參)一抗4 ℃孵育過夜,然后與HRP結合的IgG二抗(1∶5 000)37 ℃孵育1 h。ECL顯影,ImageJ軟件分析條帶灰度值,并計算p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-AMPKα/AMPK比值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 毛蕊花糖苷對冠心病大鼠心功能的影響

與對照組比較,模型組大鼠的EF和FS降低(P<0.05);與模型組比較,低、中和高劑量組大鼠的EF和FS劑量依賴性升高(P<0.05,見表2)。

表2 毛蕊花糖苷對冠心病大鼠EF和FS的影響 (%)Table 2 Effect of verbascoside on EF and FS in rats with coronary heart disease (%)

2.2 毛蕊花糖苷對冠心病大鼠血清心肌損傷標志物的影響

與對照組比較,模型組大鼠血清CK-MB和LDH水平升高(P<0.05);與模型組比較,低、中和高劑量組大鼠血清CK-MB和LDH水平呈劑量依賴性降低(P<0.05,見表3)。

表3 毛蕊花糖苷對冠心病大鼠血清CK-MB和LDH水平的影響 (U/mL)Table 3 Effect of verbascoside on serum CK-MB and LDH levels in rats with coronary heart disease (U/mL)

2.3 毛蕊花糖苷對冠心病大鼠血清脂代謝指標的影響

與對照組比較,模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C和FFA水平升高,HDL-C水平降低(P<0.05,見表4)。與模型組比較,低、中和高劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-C和FFA水平呈劑量依賴性降低,HDL-C水平呈劑量依賴性升高(P<0.05,見表4)。

表4 毛蕊花糖苷對冠心病大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和FFA水平的影響Table 4 Effect of verbascoside on serum levels of TC, TG, LDL-C, HDL-C and FFA in rats with coronary heart disease

2.4 毛蕊花糖苷對冠心病大鼠血清炎癥指標的影響

與對照組比較,模型組大鼠血清TNF-α、ICAM-1和MCP-1水平升高(P<0.05,見表5)。與模型組比較,低、中和高劑量組大鼠血清TNF-α、ICAM-1和MCP-1水平呈劑量依賴性降低(P<0.05,見表5)。

表5 毛蕊花糖苷對冠心病大鼠血清TNF-α、ICAM-1和MCP-1水平的影響 (pg/mL)Table 5 Effect of verbascoside on serum levels of TNF-α, ICAM-1 and MCP-1 in rats with coronary heart disease (pg/mL)

2.5 毛蕊花糖苷對冠心病大鼠心肌組織病變的影響

HE染色顯示,對照組大鼠心肌纖維排列緊密有序,心肌細胞均勻細長,未見明顯炎性細胞浸潤或水腫;與對照組比較,模型組大鼠心肌纖維粗大無序,心肌細胞肥大、變性壞死,細胞核收縮、溶解,伴有大量炎性細胞浸潤;與模型組比較,低、中和高劑量組大鼠心肌纖維排列較整齊,細胞形態趨于正常,炎性細胞減少(見圖1)。

注:黑色箭頭所指為空泡化細胞;藍色箭頭所指為炎性細胞;黃色箭頭所指為腫脹、變形的細胞。圖1 毛蕊花糖苷對冠心病大鼠心肌組織病變的影響 (HE染色,×200)Figure 1 Effect of verbascoside on pathological changes of myocardial tissue of rats with coronary heart disease (HE staining,×200)

2.6 毛蕊花糖苷對冠心病大鼠心肌組織中NF-κB磷酸化的影響

與對照組比較,模型組心肌組織中NF-κB p65的磷酸化水平升高(P<0.05);與模型組比較,低、中和高劑量組心肌組織中NF-κB p65的磷酸化水平呈劑量依賴性降低(P<0.05,見圖2)。

注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與低劑量組比較,&P<0.05;與中劑量組比較,△P<0.05。圖2 毛蕊花糖苷對冠心病大鼠心肌組織中的NF-κB磷酸化水平的影響Figure 2 Effect of verbascoside on NF-κB phosphorylation in myocardial tissue of rats with coronary heart disease

2.7 毛蕊花糖苷對冠心病大鼠心肌組織中脂代謝基因轉錄和表達的影響

與對照組比較,模型組大鼠心肌組織中AMPKα、PPAR-α、PPAR-γ和PGC-1α mRNA水平降低(P<0.05);與模型組比較,低、中和高劑量組大鼠心肌組織中AMPKα、PPAR-α、PPAR-γ和PGC-1α mRNA水平呈劑量依賴性升高(P<0.05,見圖3)。

注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與低劑量組比較,&P<0.05;與中劑量組比較,△P<0.05。圖3 毛蕊花糖苷對冠心病大鼠心肌組織中的AMPKα、PPAR-α、PPAR-γ和PGC-1α mRNA水平的影響Figure 3 Effect of verbascoside on AMPKα, PPAR-α, PPAR-γ and PGC-1α mRNA levels in myocardial tissue of rats with coronary heart disease

與對照組比較,模型組大鼠心肌組織中AMPKα的磷酸化水平降低(P<0.05);與模型組比較,低、中和高劑量組大鼠心肌組織中AMPKα的磷酸化水平呈劑量依賴性升高(P<0.05,見圖4)。

注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與低劑量組比較,&P<0.05;與中劑量組比較,△P<0.05。圖4 毛蕊花糖苷對冠心病大鼠心肌組織中的AMPKα磷酸化水平的影響Figure 4 Effect of verbascoside on AMPKα phosphorylation in myocardial tissue of rats with coronary heart disease

3 討論

毛蕊花糖苷的心血管保護作用已經在其他研究中報道。例如,Campo等[14]報道,毛蕊花糖苷可顯著抑制二磷酸腺苷和花生四烯酸誘導的人血小板聚集。Zhu等[15]報道,毛蕊花糖苷能夠改善脂多糖誘導的敗血癥大鼠的心功能,抑制氧化應激、炎癥和心肌細胞凋亡,促進線粒體生物發生。一項隨機、單中心、雙盲臨床實驗考察了100名伴有心血管危險因素(年齡>65歲,糖尿病,高血壓病,吸煙,高血脂,男性腰圍>102 cm或女性腰圍>88 cm)的受試者在口服安慰劑或50 mg和100 mg毛蕊花糖苷后的血小板聚集值,研究顯示,2周攝入毛蕊糖苷100 mg可顯著降低伴有心血管危險因素受試者的血小板聚集值,并且在研究過程中沒有嚴重的不良事件報告[16]。這些文獻提示毛蕊花糖苷可能在治療冠心病方面具有潛力。本研究使用了20,40,80 mg/kg的毛蕊花糖苷治療高脂飲食聯合腹腔注射垂體后葉素誘導的冠心病大鼠模型4周,結果表明毛蕊花糖苷劑量依賴性地升高了冠心病大鼠的EF和FS,降低了血清CK-MB和LDH水平,改善了心肌形態,提示毛蕊花糖苷對冠心病大鼠具有治療作用。

炎癥與冠心病的發生機制有關,TNF-α、ICAM-1和MCP-1等炎癥介質在冠心病患者中高表達,可誘導冠心病病理條件下的血管內皮損傷[17]。TNF-α是一種典型的促炎細胞因子,與冠心病炎癥密切相關。冠心病中的內皮細胞、白細胞和血小板之間的相互黏附可加劇炎癥反應,促進斑塊形成。ICAM-1是介導細胞和基質之間相互作用的糖蛋白,可促進內皮細胞和中性粒細胞的黏附[18]。MCP-1可趨化和激活單核或巨噬細胞,誘導黏附分子表達[19]。據報道,冠心病患者經有效治療后,血清TNF-α水平明顯降低[20],降低ICAM-1和MCP-1的水平有利于提高冠心病患者的斑塊穩定性[17]。本研究顯示毛蕊花糖苷劑量依賴性地降低了冠心病大鼠血清TNF-α、ICAM-1和MCP-1水平,提示毛蕊花糖苷能抑制冠心病大鼠體內炎癥介質的分泌。

TNF-α、ICAM-1和MCP-1等炎癥介質均受到經典促炎信號通路NF-κB的調節,磷酸化的NF-κB p65轉位至細胞核并調控其下游炎癥介質的轉錄和表達,其在冠心病炎癥調節中非常重要[21,22]。有學者報道,毛蕊花糖苷通過抑制NF-κB的活化減輕阿爾茨海默病小鼠神經炎癥[23]。本研究也發現毛蕊花糖苷劑量依賴性地降低了冠心病大鼠心肌組織中NF-κB p65的磷酸化水平。提示毛蕊花糖苷對冠心病大鼠的治療作用可能與抑制NF-κB介導的炎癥反應有關。

脂代謝異常是冠心病的主要病理特征之一,與斑塊形成直接相關[17]。此外,脂肪堆積還會破壞DNA和細胞完整性,對器官和組織造成損傷[24,25]。其他學者已經證實氯吡格雷聯合依折麥布治療冠心病的機制與調節血脂紊亂有關,糾正脂代謝異常是治療冠心病的有效手段[26]。毛蕊花糖苷具有明顯的調脂作用。Sun等[27]通過高濃度油酸處理HepG2細胞建立脂質堆積模型,考察了毛蕊花糖苷對脂質代謝的影響,結果表明毛蕊花糖苷通過調控Scarb1、Scarb2、Srebf1、Dhcr7、Acat2、Hmgcr、Fdft1、Lss等多個基因的表達來改變脂質代謝和合成,這些基因涉及糖酵解、AMPK、脂肪酸降解等多種途徑。本研究結果顯示毛蕊花糖苷劑量依賴性地降低了冠心病大鼠血清TC、TG、LDL-C和FFA水平,升高了HDL-C水平,表明毛蕊花糖苷糾正了冠心病大鼠的血脂代謝異常。

AMPK在脂代謝調節中具有重要作用[28]。據報道,冠心病患者血漿AMPKα1水平明顯下降[29]。另外,冠心病大鼠血管內皮細胞中AMPKα的磷酸化水平顯著降低,注射AMPK激動劑后,冠心病大鼠AMPKα的磷酸化水平明顯升高,血管內皮功能顯著改善[4]。在其他文獻中,三七皂苷R1改善冠心病大鼠心肌損傷的機制與激活AMPK信號通路有關[30]。因此,激活AMPK是減輕冠心病的一種有效途徑。Olivares-Vicente等[31]開展的分子對接實驗表明,毛蕊花糖苷是AMPK的直接激動劑,可結合到γ亞基的AMP結合位點或γ和β亞基之間相互作用區的不同位點。其他學者報道,毛蕊花糖苷能顯著降低糖尿病KK-Ay小鼠血清和肝臟脂質含量,提高AMPK的磷酸化水平,并降低脂質合成標志物乙酰輔酶A羧化酶和脂肪酸合成酶的表達水平,此外,毛蕊花糖苷通過增加脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)和肉堿棕櫚酰轉移酶(CPT)-1的mRNA表達促進脂肪分解和脂肪酸氧化[32]。然而,目前尚不清楚毛蕊花糖苷對冠心病大鼠AMPKα活化的影響,因此本研究檢測了各組大鼠心肌組織中AMPKα的磷酸化情況,結果發現毛蕊花糖苷劑量依賴性地升高了冠心病大鼠心肌組織中AMPKα的磷酸化水平,推測AMPKα的激活可能是毛蕊花糖苷改善冠心病大鼠心功能和減輕心肌損傷的一種途徑。

PPAR-α和PPAR-γ在調節脂肪酸氧化、脂肪因子的合成和分泌、炎癥和血管反應中起著中樞協調作用[33-35]。有報道稱,在心肌缺血的情況下,PPAR-α和PPAR-γ的基因表達減少,加重了心肌缺血損傷[36,37]。另外,PGC-1α是一種在心肌、骨骼肌、腦組織中表達的控制能量穩態的轉錄共調節因子,參與調控脂肪酸氧化代謝[38]。AMPK通過激活PGC-1α及其下游PPAR-α、PPARγ來促進脂代謝[39]。此外,PPAR-α還通過抑制NF-κB介導的促炎因子的分泌而發揮抗炎作用[40,41]。Esposito等[42]研究表明在實驗性結腸炎小鼠中毛蕊花糖苷對PPAR-α具有激活作用,毛蕊花糖苷通過激活PPAR-α抑制了腸道炎癥。上述文獻說明毛蕊花糖苷對AMPKα下游的脂代謝基因具有調控作用,然而,目前尚不清楚在冠心病中毛蕊花糖苷是否也通過調控AMPKα下游的脂代謝基因來糾正脂代謝紊亂。為了進一步揭示毛蕊花糖苷激活AMPKα調節脂代謝的具體途徑,本研究檢測了AMPK下游轉錄因子PPAR-α、PPAR-γ和PGC-1α的表達情況,結果顯示毛蕊花糖苷劑量依賴性地升高了冠心病大鼠心肌組織中AMPKα、PPAR-α、PPAR-γ和PGC-1α的轉錄水平。因此,推測毛蕊花糖苷可能通過調節AMPK介導的脂代謝基因轉錄和表達糾正冠心病大鼠的脂代謝紊亂。

綜上所述,雖然其他學者已經報道了毛蕊花糖苷的心血管保護、抗炎和調脂作用,這些作用均與冠心病的發生發展有關,然而,尚無文獻報道毛蕊花糖苷治療冠心病的作用及機制,因此在冠心病動物模型中探討毛蕊花糖苷的藥效對于冠心病新藥研發具有重要意義。本研究首次發現毛蕊花糖苷能有效改善冠心病大鼠的心功能,減輕心肌損傷,其機制可能與抑制NF-κB介導的炎癥反應和激活AMPK介導的脂代謝基因轉錄和表達有關。因此,毛蕊花糖苷在治療冠心病方面具有較高的開發前景。本研究也存在局限性:首先,本研究證實了毛蕊花糖苷在治療冠心病方面具有潛力,然而,毛蕊花糖苷具有多種生物活性,其影響冠心病進展的機制可能不限于調節炎癥和脂代謝;其次,本研究雖然未發現毛蕊花糖苷引起的明顯毒副反應,然而,其使用劑量范圍及遠期毒性仍有待揭示;最后,本研究為一項動物模型實驗,毛蕊花糖苷在人體中的應用效果尚未可知。因此,本研究將在后續實驗中進一步揭示毛蕊花糖苷治療冠心病的其他機制,進一步擴大劑量范圍考察其長期毒性,從而為毛蕊花糖苷的臨床應用提供基礎支撐。