冬蟲夏草及其近緣品中鉛、鎘、砷污染評價及人體健康累積風險評估方法探索△

張眾謀，康帥，左甜甜，孔德娟，劉月帥，石佳，鄭玉光，金紅宇*，馬雙成*

1.中國藥科大學，江蘇 南京 211100；

2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；

3.河北中醫學院，河北 石家莊 050091；

4.通遼市市場檢驗檢測中心，內蒙古 通遼 028000

冬蟲夏草Cordyceps sinensis(Berk.) Sacc.為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的復合體，早在唐代藏族藥書籍《月王藥診》中便有記載[1-2]?，F代藥理研究表明，冬蟲夏草對免疫系統、呼吸系統、心血管系統等具有多種活性[3]。重金屬包括鉛（Pb）、鎘（Cd）、砷（As）等，難以被降解，卻可以在食物鏈的生物放大作用下富集進入人體，是國際公認的全球性環境污染物。中藥一旦被Pb、Cd、As 污染，會在體內產生嚴重的生理毒性[4-6]。同時，中藥中重金屬超標問題已成為中藥出口的重要障礙，因此對冬蟲夏草及其近緣品中重金屬的風險進行科學、合理的評估具有重要的意義。本研究采用電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）測定冬蟲夏草及其近緣品中不同部位（全草、中體、子座）Pb、Cd、As的含量，綜合運用單因子污染指數（Pi）法、尼梅羅綜合指數法、金屬污染指數（MPI）法對其污染進行評價，并嘗試采用靶器官毒性劑量法（TTD）對Pb、Cd、As 聯合暴露產生的人體健康風險進行評估，探索冬蟲夏草及其近緣品重金屬污染評價，以及人體健康風險評估方法，為中藥安全性評價及相關限量標準的制修訂提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7700X 型ICP-MS 儀（美國Agilent 公司）；Mars5 型微波消解儀（美國CEM 公司）；Mill-Q 型超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

Pb、Cd、As混合標準溶液質量濃度分別為1000、1、100 mg·L-1，調諧溶液為鋰（Li）、釔（Y）、鈰（Ce）、鉈（Tl）、鈷（Co）的混合標準溶液；內標溶液為100 μg·mL-1的Li、鈧（Sc）、鈧（Ge）、銠（Rh）、銦（In）、鋱（Tb）、镥（Lu）、鉍（Bi）的混合內標溶液（美國Agilent 公司），稀釋100 倍使用；硝酸為微電子級（美國默克Sigma公司）。

1.3 樣品

冬蟲夏草及其近緣品來源于四川、青海、湖北、山西、江西和江蘇，由中國食品藥品檢定研究院康帥副研究員鑒定，樣品信息見表1，冬蟲夏草及其近緣品性狀見圖1。

2 方法

2.1 ICP-MS工作條件

等離子氣流量：15.0 L·min-1；蠕動泵轉速：0.20 r·s-1；霧化室溫度：2 ℃；輔助氣流量：0.8 L·min-1；氦氣流量：5 mL·min-1；載氣流量：0.8 L·min-1；射頻功率：1550 W；數據采樣模式：跳峰采集模式；采樣深度：10 mm；重復次數：3次；掃描次數：100次。

2.2 供試品溶液和空白對照溶液的制備

精密稱取藥材粉末（過三號篩）0.25 g，置微波消解罐中，加硝酸8.0 mL，按《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版（四部）通則“2321 鉛、鎘、砷、汞、銅測定法”[7]消解樣品，制備供試品溶液。同法制備試劑空白溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 檢測限（LOD）和定量限（LOQ）采用11 個試劑空白的3 倍標準差（SD）計算LOD，并采用10×SD 計算LOQ。LOD 和LOQ 見表2。

表2 冬蟲夏草不同金屬元素的LOD和LOQ μg·L-1

2.3.2 精密度試驗 取Pb、Cd、As 混合標準溶液，質量濃度分別為20、1、10 μg·L-1，連續進樣6 次，結果Pb、Cd、As測定值的RSD 分別為2.3%、3.6%和3.9%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 加樣回收率試驗 取編號為10105070317 的冬蟲夏草（野生品）粉末約0.25 g，加入混合標準溶液適量，按2.1項下條件進行測定，計算回收率。結果顯示，Pb、Cd、As的回收率分別為94.3%、103.6%、112.3%，符合痕量檢測的回收率要求。

3 污染評價

3.1 Pi法

采用公式（1）計算全草中重金屬的Pi。

式中，Ci為全草中重金屬的實測值（mg·kg-1）；Si為重金屬的限量標準值（mg·kg-1），參照《中國藥典》2020 年版植物類中藥材一致性限量指導值[7]。其中，Pi≤0.7為優良，0.7＜Pi≤1.0為安全，1.0＜Pi≤2.0為輕污染，2.0＜Pi≤3.0為中污染，Pi＞3.0為重污染。Pi越大，說明污染越嚴重。

3.2 尼梅羅綜合指數法

采用公式（2）計算全草的綜合污染指數（P綜合）。

式中，P平均為Pi的平均值；Pmax為Pi的最大值。P綜合≤0.7為安全，0.7＜P綜合≤1.0為安全線，1.0＜P綜合≤2.0為輕污染，2.0＜P綜合≤3.0為中污染，P綜合＞3.0為重污染。

3.3 MPI法

采用公式（3）計算全草的MPI。

式中，C為重金屬的實測值（mg·kg-1）。通過MPI 比較不同樣品之間重金屬污染的差異，MPI 越高，說明污染程度越高。

4 健康風險評估

4.1 暴露量的計算

按公式（4）計算Pb、Cd、As 的每人每千克體質量單一重金屬的日暴露量（μg·kg-1）。

式中，EF為中藥材的服用頻率；Ed為服用中藥的年限。根據國家食品安全風險評估中心在我國11個省份20 917 名調查者的有效消費調查數據[8]，EF的P95 值為每年90 d，Ed為20 年；IR為處方中藥材的Exp，參考《中國藥典》2020 年版規定的冬蟲夏草最大日用量為9 g；t為經過煎煮等方式提取后重金屬的轉移率，綜合參考文獻[8]和本課題組的研究結果，在水煎煮條件下，Pb、Cd、As 的t值分別為14%、14%、35%；C為樣品中重金屬的殘留量（mg·kg-1）；W為人體體質量，以70 kg 計；AT為平均壽命天數（25 550 d）。

4.2 風險特征描述

單一重金屬風險的高低由危害商（HQ）來描述，分部位按公式（5）計算樣品中Pb、Cd、As 的HQ值。

式中，安全因子（SF）為10[9]。HBGV為重金屬的健康指導值，采用美國環保署（US EPA）所建議的Pb、Cd、As的口服參考劑量，分別為每日每千克體質量0.003 5、0.001 0、0.000 3 mg·kg-1[10-11]。若HQ≤1，那么單一重金屬暴露所產生的健康風險可以被接受；若HQ＞1，風險較高，健康風險不容忽視。

4.3 累積風險評估

采用分級別原則分部位對樣品中Pb、Cd、As累積暴露產生的風險進行評估。先用低級別累積風險評估方法即危害指數（HI）法進行評估，對于風險進行初步篩查；再采用更加精確的TTD 法，對Pb、Cd、As 的累積風險進行評估。

4.3.1 HI法 HI是各化學物HQ之和，按公式（6）計算。

式中，HQPb、HQCd、HQAs分別為Pb、Cd、As的HQ。若HI＜1，則認為Pb、Cd、As 聯合暴露所產生的風險可以被接受；若HI＞1，則認為風險較高，不容忽視。

4.3.2 TTD 法 TTD 法對于HI 法進行改進，是針對特定毒理作用終點風險特征描述的方法。TTD 法需考慮每一污染物質基于每一作用終點的毒理效應，計算基于每一特定作用終點效應的HQ和HI[12]。TTD 法中HI的計算公式同公式（6），所不同的是參比值HBGV 代入每一毒理效應終點的健康指導值。根據US EPA 發布的指南[13]，針對心血管、血液、神經系統、腎臟、睪丸5 種不同毒理終點的Pb 的每日允許暴露量（ADI）分別為每千克體質量0.001 3、0.004 2、0.004 2、0.000 6、0.016 7 mg·kg-1；針對心血管、血液、神經系統、腎臟、睪丸5 種不同毒理終點Cd 的ADI 分別為每千克體質量0.005 00、0.000 80、0.000 20、0.000 83、0.003 00 mg·kg-1。針對心血管、血液、神經系統、腎臟4種不同毒理終點As的ADI分別為每千克體質量0.000 3、0.000 6、0.000 3、0.090 0 mg·kg-1。若HI＜1，則認為風險可以被接受；若HI＞1，則認為風險較高，不容忽視。

5 結果

5.1 Pb、Cd、As含量分析

樣品的測定結果表明，亞香棒蟲草全草中Pb 的含量超標，香棒蟲草全草中Cd 的含量超標，3 批冬蟲夏草（野生品）及香棒蟲草、亞香棒蟲草、蛹蟲草中全草和蟲體中的As 含量超標（表3）。

表3 冬蟲夏草及其近緣品不同部位中Pb、Cd、As的質量分數 mg·kg-1

5.2 安全性評價結果

如圖2所示，Pb的Pi為0.05～2.36，除1 批亞香棒蟲草為中污染外，其余樣品均為優良；Cd 的Pi為0.01～1.85，除1 批香棒蟲草為輕污染外，其余樣品均為優良；As 的Pi為0.32～6.85。冬蟲夏草（繁育品）為優良，1批冬蟲夏草（野生品，編號為10105070060）和香棒蟲草為輕污染，1 批蛹蟲草為中污染，2批冬蟲夏草（野生品，編號為10105070317和10105070314）和亞香棒蟲草為重污染。

圖2 冬蟲夏草及其近緣品中Pb、Cd、As的Pi

如圖3 所示，冬蟲夏草及其近緣品尼梅羅P綜合為0.25～5.12。其中，冬蟲夏草（繁育品）為優良，1 批冬蟲夏草（野生品，編號為10105070060）和香棒蟲草為輕污染，1 批冬蟲夏草（野生品，編號為10105070317）和蛹蟲草為中污染，2 批冬蟲夏草（野生品，編號為10105070317 和10105070314）和亞香棒蟲草為重污染；MPI為0.24～3.43，污染程度為冬蟲夏草（繁育品）=蛹蟲草＜冬蟲夏草（野生品）＜香棒蟲草＜亞香棒蟲草。

圖3 Pb、Cd、As的尼梅羅P綜合和MPI

5.3 HI法初步評估結果

計算每千克體質量樣品中Pb、Cd、As 的Exp，結果見表4。針對Pb、Cd、As 的最敏感毒理作用終點，分別計算HQ，并計算其HI。HQ 結果說明，所有批次樣品中Pb 和Cd 的HQ 均低于1。然而，由于3批冬蟲夏草（野生品）蟲體及1批冬蟲夏草（野生品）全草中As 的HQ 高于1，導致相應的HI 高于1，風險需要被關注。

表4 冬蟲夏草及其近緣品不同部位中Pb、Cd、As的Exp、HQ和HI

5.4 TTD法修正的HI結果

Pb 和Cd 的非致癌作用終點主要為心血管系統、神經系統、腎臟、血液和睪丸，As 的非致癌作用終點主要為心血管系統、神經系統、腎臟、血液。針對每一種靶器官的毒性劑量，分別計算出Pb、Cd、As 相應的HQ，進一步計算出TTD 法修正的HI（表5）。如表5 所示，作用終點為心血管和神經系統的3 批冬蟲夏草（野生品）蟲體及1 批冬蟲夏草（野生品）全草的HI＞1，這是其As 的HQ 較高導致的，說明需要進一步關注Pb、Cd、As 聯合暴露對于心血管和神經系統產生的累積健康風險。

6 討論

本研究綜合運用Pi法、尼梅羅綜合指數法、MPI 法對冬蟲夏草及其近緣品進行重金屬污染評價。其中，Pi法可以快速篩選出主要污染因子，是評價樣品質量指數和其他綜合評價方法的基礎，但不能全面反映樣品的污染程度，需要其他方法作為補充。尼梅羅綜合指數法同時兼顧了Pi的平均值和最大值，避免由于平均作用削弱污染金屬的權值，突出了污染指數最大的重金屬（本研究為As）對樣品質量的影響，既能夠反映單因子重金屬污染狀況，又可以反映多因子重金屬污染的綜合狀況。MPI 法由英國科學家Tomlinson 等在1980 年提出，能直觀地反映各個重金屬對污染的貢獻程度，并可避免污染指數加和造成的評價結果誤差[14]。由評價結果可見，3 種方法得到的結果基本一致。

目前，對于重金屬的健康風險評估主要基于單一重金屬的單一途徑暴露[15-23]，而實際上人們每天都會通過多種途徑暴露于多種重金屬中。中藥中多種重金屬進入人體后，引起聯合毒性的潛在風險可能超過單一重金屬。如何科學評估多種重金屬殘留對人體的毒性已成為監管部門關注的問題。本研究探索性地采用分級原則，對Pb、Cd、As的聯合暴露開展累積風險評估。首先采用低級別的HI法對風險進行初步篩查；再針對Pb、Cd、As 不同毒理學作用靶器官，采用TTD 法對HI 法作出修正和改進。目前，國內、國際大多以簡單的“劑量相加”假設為前提，采用HI法進行污染物的累積風險評估。該方法相對保守，對于數據要求相對簡單，是較為務實的選擇[24]。TTD 法需考慮每一污染物質基于每一作用靶器官的毒理效應，計算基于每一特定作用靶器官效應的HQ和HI，對HI法進行校正。

需要說明的是，本研究除了冬蟲夏草（繁育品）外，其余樣品中總As的含量較高。然而，元素的形態、價態與其毒性密切相關，本研究無論是對樣品的污染評價還是對人體健康的風險評估均以風險最大化為原則，采用總As的含量進行評價和評估，得到的結果相對保守。后續研究應深入調查冬蟲夏草及相關產品中As 的形態和價態，進一步提高評價、評估的準確性，建議在制定相關限量過程中除了考慮反映中國人群中藥消費特點的暴露評估參數（包括中藥使用頻率、使用量、使用時間等）外，還應考慮累積暴露風險及元素的形態、價態，使所制定的限量更加科學。中藥材的污染評價和對于人體健康的風險評估剛剛起步，本研究以珍稀名貴藥材冬蟲夏草及其近緣品為研究對象，探索其污染評價及人體健康風險評估方法，并基于TTD 法探索對于冬蟲夏草及其近緣品中重金屬聯合暴露更加精確的累積健康風險評估方法，為中藥安全性評價方法提供了新思路，也為進一步完善中藥外源性有害殘留物限量標準提供科學依據。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。