激光誘導擊穿光譜技術結合化學計量學在中藥質量控制中的應用進展△

陶益，沈麗莎

浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310014

近年來，隨著中醫藥的快速發展，中藥質量安全控制引起了廣泛的關注，中藥質量評估體系對保證中藥安全性和有效性至關重要。品種、產地、種植環境、加工貯存方式等都會對中藥材的藥效產生極大的影響。目前，中藥材質量控制與檢測的常用方法有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質譜法（GC-MS）、高效液相色譜-質譜法（HPLC-MS）、超高效液相色譜串聯質譜法（UPLC-MS/MS）等[1]，雖然上述方法較薄層色譜法（TLC）等傳統質量檢測技術更為直觀、精確和方便，但操作仍比較復雜，因此需要能夠實現快速、實時質量控制的檢測技術。近年來，微型質譜儀、近紅外光譜、高光譜成像技術、激光誘導擊穿光譜法（LIBS）、拉曼光譜等已逐漸應用于中藥產品質量控制，實現了在線獲取并快速分析產品數據，對產品質量進行全面控制。本文討論LIBS在中藥質量控制中的應用，為推動中藥質量控制體系走向快速化和在線化提供參考。

1 LIBS檢測儀構造及檢測原理

LIBS 檢測儀主要由激光器電源、激光頭、耦合鏡、光纖、電動旋轉樣品臺、剪式升降臺和數據處理系統組成，見圖1。

圖1 LIBS檢測儀光譜裝置圖

LIBS 作為一種發射光譜法具有快速、在線分析、對樣品損害小、可同時測定多種元素、可實現原位或遠程在線操作等優點[2-3]。自1962 年Brench 首次提出等離子體可以作為一個光源以來，LIBS 光譜發展至今，從開始的材料元素分析，到現在已逐漸發展成為一種能夠實現多種材料在線檢測的技術[4]。LIBS 主要是通過高能脈沖激光燒灼樣品表面，當激光到達樣品表面的能量超過樣品的擊穿閾時，激光灼燒區的微粒會出現多光子電離現象，從而產生初始自由電子，這些電子不斷重復著初始自由電子的行為，使微粒、分子、原子等不斷被電離，從而產生激光誘導等離子體，等離子體在冷卻時會發出材料中存在的化學元素特定的輻射[5]，光收集器有效地收集等離子體光以后，進入檢測器，并產生對應的譜圖，最后經過數據處理，由發射位置和強度得到定性、定量的結果。其中，等離子體產生、演化和輻射需滿足以下3 個條件：激光化學計量燒灼的條件；等離子體達到局部熱平衡狀態，即因電子碰撞激發的原子數等于激發原子的碰撞消激發數、原子的碰撞電離數等于撞擊粒子間的復合數、輻射等于吸收；光譜線滿足光學薄條件，即無自吸收效應發生。

2 LIBS的操作流程

2.1 LIBS預處理

LIBS 檢測過程中會受到很多因素的干擾，如光線、樣品、檢測環境等，會出現檢測靈敏度低[6]、分辨率低、難以量化[7]、非線性現象[8]等問題。為了改善LIBS的靈敏度和分辨率，研究者指出可以采用一些輔助手段來改進LIBS，如放電輔助LIBS[9]、雙光束LIBS[10]、大氣壓輝光輔助LIBS[11]、雙脈沖LIBS[12]、電極富集LIBS[13]、微波輔助LIBS[14]等。李文平等[15]借助BaCl2溶液對單脈沖（SP）與正交雙脈沖（DP）LIBS 的靈敏度進行比較，結果發現，DPLIBS 的靈敏度遠高于SP-LIBS，同時檢測限下降到了1.78×10-6。另外，目前使用的各種機器學習方法LIBS 定量分析的準確性仍然不高，Song 等[16]將領域知識結合到機器學習中以實現光譜的量化，提出將發射光譜的領域知識與核極限學習機（K-ELM）結合，即主導因子的K-ELM（DF-K-ELM），提高了LIBS 量化模型的可解釋性和準確性。此外，研究者們還發現在數據量化的過程中回歸模型和提取類型的選擇是數據量化分析的關鍵方面，以最佳方式對數據進行量化處理，可以表現出色的分析性能[17]。在此之前，若光譜信息未經任何處理就對物質定性和定量分析，噪聲和基質效應會嚴重掩蓋有用信息。因此，在定性和定量測定之前，常需要對光譜進行去噪、基線校正和譜峰校正處理[18]。

2.1.1 去噪 原始信號相對來說是低頻、穩定的信號，噪聲更多的是高頻信號，因此原始信號常會被高頻信號所淹沒，通過信號去噪法對含噪聲信號進行分解轉化，得到去噪信號[19]。常用LIBS 信號去噪法包括傅里葉變換法、小波閾值變換去噪法、平滑去噪法等。

2.1.2 基線校正 LIBS 在某些情況下的檢測結果并不理想，主要原因是連續介質背景和光譜暗電流會影響光譜信號，發射譜線通常與光譜背景重疊?；€校正常用的方法有小波變換法、中值濾波法、多項式擬合法等。Liu 等[20]開發了一種LIBS 基線校正的新方法，即波長人工移減法，該方法在單個光譜上對波長進行偏移，將移位和未移位的頻譜進行減法處理以后，信號基線得到很好的校正。

2.1.3 譜峰識別 光譜上特定位置的信號常表示為某一對應化學物質或元素及其含量，因此信號的形狀、大小、出峰時間、高矮等對物質的定性定量會產生極大的影響，譜峰的準確識別是獲取物質關鍵信息的重要方法。但目前，針對LIBS還尚無公認的較好的算法，目前常用的算法包括三點尋峰算法、蒙特卡羅算法、七點比較法等。

2.2 特征數據提取

在LIBS 光譜圖中，每種元素都會有很多強度不同的譜線，這些譜線相互重疊構成了復雜的譜圖，且樣品中所含元素越多，結果越復雜[21]，因此從LIBS 數據中提取最有用的特征數據能夠提高模型預測的準確性。樣品的定性和定量分析大多都是通過LIBS 數據中某些元素的發射譜線或借助主成分分析和偏最小二乘法回歸（PLSR）等多元分析方法，使用LIBS的全譜圖數據建立分類或回歸模型，這就會導致非特征性數據降低模型的性能。Huang 等[22]提出了一種特征數據提取的新方法，即完整變量和特征變量之間的交叉計算（CCFCV），用于LIBS 數據的特征提取。該方法使用1889 個全變量和排放變量來選擇重要特征，快速篩選出30 個特征變量進行鉻（Cr）分析。其中，18 個特征變量與Cr 參考含量的相關值＞0.90，利用這30 個特征變量分別建立PLSR和最小二乘支持向量機（LS-SVMs）模型，CCFCVPLSR 和CCFCV-LS-SVM 模型的平均殘差預測偏差（RPD）為3.762，高于連續預測算法（SPA）和競爭性自適應重加權抽樣（CARS）模型。此外，使用線性和多項式2 個擬合函數，分別建立Cr 和銅（Cu）的特征變量預測模型，結果顯示：基于425.46 nm 處變量建立的Cr 多項式模型，其決定系數（R2）和均方根誤差（RMSE）分別為0.643 5 和211.462 3?；?24.77 nm 變量建立的Cu線性擬合模型R2和RMSE 分別為0.746 和714.284 4，單變量模型對Cr 和Cu 的準確率均低于相應的CCFCV 提取特征所建立的模型，結果表明CCFCV是一種有效的LIBS數據特征提取方法。

2.3 特征建模

基于特征數據提取獲得的一組光譜集可通過建模方法構建相關預測模型，由于激光與物質相互作用的復雜性和樣品本身的異質性，常需要建立各種預測模型，通過比較預測均方根誤差（RMSEP）和分類率的高低選擇最準確的預測模型[23]。LIBS 特征數據分析模型包括定性分類模型和定量分析模型。Palásti等[24]使用3 種特征模型方法（分類樹、線性判別分析和二次判別分析）對煤氣溶膠進行定性判別，經對比，具有歸一化和未歸一化的分類樹模型均較其他2 種分析模型的判別準確性高，分別為74.0%和74.2%。此外，使用未進行壓縮的數據可以使分類樹分析法達到最佳整體精度，類似的定性模型還包括三層堆疊算法[25]、卷積神經網絡（CNN）和偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）等。CNN 作為近年來使用最廣泛的深度學習模型之一，在LIBS定性分析中表現出優異的分類性能[26]。Xu 等[27]將CNN 應用于土壤的LIBS 數據分析，采用改進潛結構投影（MPLS）算法消除基線漂移，然后用歸一化方法對基線校正的光譜進行處理，使得每一個樣品生成代表性光譜，將算術平均光譜轉換成二維光譜矩陣，將光譜矩陣輸入CNN 模型進行預測，4 種CNN 模型分類精度均達到0.960 以上，土壤類型的過擬合指數分別為3.472%、4.167%、3.472% 和4.167%，這表明CNN 模型在LIBS 光譜數據建模方面具有很好的優勢。在定量分析模型中化學計量學方法是對各類數據進行分類和定量分析的重要工具，其主要是利用LIBS光譜作為輸入數據，譬如原始光譜及多個波長的發射譜線相對強度[28]，隨后對每個樣品的平均光譜數據集進行壓縮和降維處理[29]，優化機器學習分類器模型參數，以獲得較好的分類效果。常用的機器學習分類器包括距離算法、決策樹算法、貝葉斯算法等[30]。張冉冉等[31]建立主成分-相關向量機結合分析模型（PCA-RVM）對土壤中的Cr 元素含量進行定量分析，并與單純的RVM 模型進行對比，結果發現，PCA-RVM預測結果的精度和穩定性均明顯高于RVM 模型，說明PCA-RVM 能更好地應用于LIBS 的定量分析。LIBS 的某些數據模型也可同時發揮定性和定量的功能，如利用PLSR 對鋼合金元素進行定性和定量分析，以提高預測結果的穩定性和準確性[32]。

3 LIBS在中藥質量控制中的應用

3.1 產地溯源

不同產地的中藥材因其生長環境不同，藥材中活性成分含量不同，療效也不同，因此，中藥產地溯源尤為重要，不僅能夠獲知中藥道地產區，解決中藥同名異物的問題，更是中藥質量全鏈條控制中的重要一環。蔡羽等[33]采用LIBS 對山藥飲片產地進行溯源，通過光譜預處理、特征提取，將光譜信號以1∶2 劃分為測試集和訓練集，以5 次交叉驗證的K 最鄰近分類（KNN）模型測試集的準確率作為評價優化預處理參數的指標，結果發現不同產地山藥飲片平均光譜所含譜峰基本一致，但強度不同，道地產區對鉀（K）、鈉（Na）、鈣（Ca）、鎂（Mg）、鋁（Al）等金屬元素的富集能力較非道地產區的能力要強，由此可以區分不同產地山藥飲片的質量優劣。Li等[3]利用LIBS-CNN 實現對野生龍膽產地的快速鑒別，為了解決變量過多導致的分析時間延長和準確度下降的問題，提出減少變量及將光譜轉換為光譜矩陣2種方法，在對龍膽實際檢測的過程中2種方法的預測最佳準確率均能達到92%以上，結果表明，LIBS-CNN 可以有效地實現對野生龍膽產地的快速溯源。Liu 等[34]使用LIBS 快速鑒定了不同來源的葛粉，結果表明，采用特征波長代替LIBS全譜可快速鑒別不同產地的葛粉，減少輸入數據、簡化模型、提高速度、改善分類效果，不同產區葛粉判別模型的預測精度均達到98%。

董鵬凱等[35]采用LIBS 結合神經網絡和SVMs 對人參產地進行快速識別，分別采集了大興安嶺、集安、恒仁、石柱、撫松5 個產地657 組人參的LIBS數據，對碳（C）、Mg、Ca 等8 條特征光譜進行PCA，發現C、Mg、Ca 這3 個主成分貢獻率達92.50%，且表現出較好的聚集分類，將這3 個元素主成分進行降維后，以1∶2 隨機分為測試集和訓練集，結果表明，該方法的識別率達到了99.08%和99.5%，為快速識人參產地提供了有效的方法。羅雅文等[36]通過LIBS 結合化學計量學對淫羊藿產地進行快速識別，獲取6 個產地淫羊藿LIBS 數據，對光譜進行預處理，采用PCA 對數據進行降維處理，其中，PCA 結合SVMs 的分類效果最好，測試集分類準確率達99.17%，且采用隨機森林模型（RF）進行計算，表明硅（Si）元素的含量是區分不同產地淫羊藿的重要標志。利用LIBS結合圖像融合技術能夠精準識別白芍的地理起源，LIBS 消融圖像能夠反應白芍的表面和內部的物理信息，結合卷積神經網絡深度學習方法將數據融合后，一維深度殘差網絡（1D-ResNet）與2D-ResNet 模型提取的圖像在特征水平上融合在SVM 上識別準確率可達97.78%，在決策水平上融合準確率高達98.89%，這表明LIBS消融圖像結合數據融合及深度學習法可對白芍產地進行有效區分鑒別[37]。

3.2 真偽鑒別

傳統的中藥飲片真偽鑒別手段包括經驗鑒別、顯微鑒別和浸出物鑒別，但這些方法操作繁瑣，對操作人員的要求較高。目前，中藥質量控制技術的快速發展有利于傳統中藥質量等級分類更加完善，同時提高了中藥真偽鑒別的準確度，簡化操作步驟。Xia 等[38]采用LIBS 和近紅外光譜（NIR）結合PLSDA 檢測40 個東阿阿膠樣品和38 個來自不同廠家的阿膠樣品。對于LIBS，當潛變量（LV）數量設置為11 時PLS-DA 模型的分類精度最大，僅有2 個樣本分類錯誤，PLS-DA 模型對不同類樣品訓練集的準確率、靈敏度和特異性均為100%，而測試集分別為85.18%、95.67%和92.30%。將LIBS 和NIR 數據融合后，用多元散射校正法（MSC）和標準正態變量法（SNV）預處理可獲得完美的分類效果，可達100%，并且該數據模型顯示出良好的預測能力，實現對東阿阿膠準確鑒別。川貝母是潤肺止咳化痰良藥，浙貝母與其具有相似功效，但潤肺功能較弱，由于價格相差懸殊，常會將浙貝母的粉末摻入川貝母中以謀取利潤。為了快速鑒別川貝母中是否摻假，Wei等[39]利用LIBS，采用PLSR為定量分析模型，對21 種不同摻假水平的川貝母進行分析，最終確定基于LASSO-PLSR-SVR 的殘差校正模型分析準確性最高，測試集的平均絕對誤差（MAE）下降至5.039 6%，RMSEP下降至7.249 1%，擬合曲線線性系數上升至0.998 3，表明LIBS 能夠快速有效檢測川貝母粉末的摻假程度。目前，一些商家會在山藥粉末中摻入翅山藥或木薯粉等以謀取利潤，這會導致山藥粉本身生物活性和營養價值下降，甚至會導致中毒或過敏等危害人體健康的現象出現，Zhao 等[40]利用LIBS結合隨機森林-支持向量機（RF-SVM）模型對山藥摻假粉末進行分析，識別準確率可達100%，隨機森林高斯過程回歸模型（RF-GPR）在摻假預測中準確性最高，預測相關系數（R2p）為0.957 0，RMSEP為7.624 3%，說明LIBS 技術結合化學計量學方法能夠準確識別山藥粉末摻假。

3.3 含量測定

LIBS 光譜檢測快速，能實現在線分析，無需樣品預處理的檢測手段，目前已逐漸應用于中藥有效成分和元素的含量測定。Shen 等[41]采用LIBS 結合化學計量學法對來自8 個不同產區104 種三七藥材中20 種元素進行快速定量測定，采用Lasso 權選取的LS-SVM 模型K、Mg、Ca、鋅（Zn）、硼（B）的最佳預測R2p值均在0.91 以上，最高能達到0.966 5，預測均方根誤差最小可達0.008 mg·g-1，說明該預測模型能夠準確測定各批次三七中營養元素的含量，有利于中藥營養和藥用價值的快速評估。

3.4 重金屬檢測

中藥中重金屬的含量一直是備受關注的問題，為保證中藥質量的安全性及和效性，歷版《中華人民共和國藥典》都對中藥中重金屬檢測進行了規范，傳統重金屬檢測方法包括比色法、紫外分光光度法、原子吸收光譜法等，此外還有HPLC、電感等離子體耦合質譜法等，快速檢測方法包括電化學分析法、免疫分析法和生物傳感器法，但這些方法存在價格昂貴、難以實現在線分析、操作繁瑣、破壞樣品等問題[42]。LIBS 作為一種無接觸、破壞性小、同時能夠實現快速在線分析的新的光譜技術[43]，被逐漸應用于中藥質量控制中，特別是中藥生產過程中重金屬含量的測定。趙上勇等[44]利用LIBS 對人參中重金屬含量進行檢測，將6 種人參作為光譜數據采集對象，在相同條件下采集10 次光譜數據并進行歸一化處理，對人參中的鉛（Pb）和Cr 含量進行分析，分別選取405.79、427.40 nm 作為Pb 和Cr 的分析譜線波長，得到標準品R2分別為0.981和0.986，得到人參中Pb 和Cr 元素的檢測限（LOD）分別為9.55、10.86 mg·kg-1，留一交互均方根誤差分別為0.011%和0.023%，表明LIBS 能夠應用于人參中重金屬的檢測。Zhu 等[45]利用LIBS 檢測中成藥牛黃解毒片中砷的含量，在＜10.0 h 的檢測周期內，LIBS結果的相對標準偏差和相對誤差均小于3%，滿足快速、準確、方便的檢測要求。鄭培超等[46]采用再加熱雙脈沖LIBS 對黃連中的有毒重金屬物質Cu 和Pb進行含量測定，激光總能量為50 mJ，激光頻率4 Hz，對實驗參數進行優化，CuⅠ和PbⅠ的激光最佳能量組合為15 mJ：35 mJ，CuⅠ激光脈沖和增強電荷耦合器件（ICCD）相機延時間隔分別為1.4、1.5 μs；PbⅠ分別為1.6、1.7 μs。在上述實驗條件下，CuⅠ和PbⅠ雙脈沖LIBS 技術檢測限分別為1.91、3.03 mg·kg-1，均較單脈沖LIBS 有所下降，且線性擬合度提高，說明雙脈沖LIBS較單脈沖有更好的檢測性能。

4 LIBS面臨的問題與挑戰

在LIBS 光譜檢測過程中，由于儀器本身、樣品性質和數據處理方式的不同會導致LIBS系統監測到的信號靈敏度、可重復性、準確度較差等情況的出現。比如針對信號靈敏度較低可以通過光譜預處理的方法去除噪聲，又如，對于準確度較差的情況可以通過識別特征性譜峰的方法來解決。此外，LIBS已逐漸應用于液體中痕量元素的檢測，但仍存在很多挑戰，如液體飛濺、等離子體冷卻、檢測靈敏度低、測量超低濃度液體中的痕量元素等[47]，針對這些問題，可以從儀器設備本身和樣品2 個角度考慮，解決液體樣品檢測中的問題與挑戰。比如，可以通過增加激光脈沖數量提高等離子體信號強度，也可將液體轉化為固體，以減少樣品檢測發生飛濺的情況。對于氣體樣品[48]，被測元素易被氧化，發射線位于難以測定的范圍，如真空紫外范圍。采用LIBS系統與單顆粒氣溶膠質譜（SPAMS）系統相結合的實驗裝置可直接檢測氣體中的元素。

5 展望

LIBS 憑借其分析簡便、快速、無或少量樣品前處理、無損檢測、原位或在線監測等優點，已經逐漸應用于中藥質量控制。但是，在應用范圍逐漸拓展的過程中仍面臨著諸多挑戰和問題，需要通過樣品處理方式、數據處理手段、硬件設施改進等促進LIBS 進一步發展，通過結合人工智能算法、改進設備主體、加強聯用技術的開發，可以解決很多問題。LIBS 將會在中藥質量控制及其他研究領域有更廣泛的應用。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。