基于TLR4/NF-κB信號通路探討金雀異黃酮對膜性腎病大鼠腎損傷的影響

楊林燕,陳 潔,侯世杰,何 琦,苗盈盈,孫 楠

(邯鄲市中心醫院,河北 邯鄲 056000)

膜性腎病是一種發病率較高的自身免疫性疾病,發病率約1/10萬,其中30%～40%的患者將發展成為終末期腎病而威脅患者生命[1-2]。膜性腎病病理特征以蛋白尿、上皮下免疫復合物和電子致密物沉積、基底膜增厚等為主,炎癥反應和組織纖維化在其進行性加重過程中發揮著關鍵作用[3-4]。由Toll樣受體4(TLR4)及核因子-κB(NF-κB)組成的信號通路在炎癥和組織纖維化的調控機制中扮演著重要角色,有研究發現通過抑制TLR4/NF-κB信號通路可減輕膜性腎病大鼠腎組織炎癥和纖維化[5-6]。近年來,中藥及中藥提取物防治膜性腎病成為醫藥研究者關注的熱點。中醫沒有膜性腎病病名,據其癥狀可歸屬“水腫”“尿濁”“虛勞”等范疇,脾腎虧虛、氣滯血瘀、水濕痰濁、腎絡瘀阻為膜性腎病主要病機,治宜健脾補腎、活血益氣、逐瘀通絡。金雀異黃酮(又名染料木素)廣泛存在于金雀花、大豆、皂莢、槐角等豆科植物中,化學名4’,5,7-三羥基異黃酮,具有抗炎、抗纖維化等作用[7-8],可通過調控TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達減輕小膠質細胞炎癥損傷和小鼠肝纖維化[9-10]。本實驗通過制備膜性腎病大鼠模型,探討了金雀異黃酮對膜性腎病大鼠腎損傷及TLR4/NF-κB信號通路的影響,以為金雀異黃酮用于膜性腎病的治療提供實驗依據。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 45只SPF級雄性SD品系大鼠,7周齡,體重180 ～210 g,購于河北伊維沃生物科技有限公司,生產許可證號：SCXK(冀)2020-002,在室溫23～25 ℃、相對濕度45%～65%、12 h/12 h光暗交替的控制環境中分籠飼養。研究中所有動物操作遵循減少、替代、優化原則。本實驗經邯鄲市中心醫院倫理委員會審批通過[倫理號：HDZXLL(K) 2021-019]。

1.2藥物與試劑 金雀異黃酮(純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司,批號：Y21D5C10382);陽離子化牛血清白蛋白(C-BSA)和弗氏不完全佐劑(美國Sigma公司,批號分別為101951884、F5506);瑞沙托維(TLR4抑制劑)和尿蛋白、尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)、血漿白蛋白、蘇木精-伊紅(HE)、馬森(Masson)試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司,貨號分別為IR0580、BC5650、BC1530、BC4910、BC5820、G1120、G1340);鋨酸、醋酸鈾、檸檬酸鉛(美國Ted Pella公司,貨號分別為19271、21035、20084);白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號分別為H002、H007-1-2、H052-1);RIPA裂解液、Trizol總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒、羊抗兔IgG二抗、ECL發光劑(北京索萊寶生物科技有限公司,貨號分別為R0010、R1100、RP1200、PC0020、SE134、SW2030);兔源TLR4、NF-κB p65、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)、Ⅲ型膠原(Col-Ⅲ)、p-Smad2/3、Smad7、β-actin抗體和異硫氰酸熒光素(FITC)標記免疫球蛋白G(IgG)抗體(北京博奧森生物技術有限公司,貨號分別為bs-20594R、bs-23217R、bs-0086R、bs-10423R、bs-0948R、bs-8853R、bs-0566R、bs-0061R、bs-0293R-FITC)。

1.3主要儀器 HEMIX-180型全自動生化分析儀(日本Sysmex公司);DS-11型紫外-可見分光光度計(美國Nanodrop公司);5810型高速低溫離心機(德國Eppendorf公司);BX43型熒光顯微鏡(日本Olympus公司);MK3型酶標儀(芬蘭雷勃公司);HI 1220型烤片機、RM 2264型石蠟切片機、EMUC7型超薄切片機(德國Leica公司);JEM-1400型透射電子顯微鏡(日本電子株式會社);CFX96型RT-PCR儀、Powerpac U型垂直電泳系統、Trans-blot型蛋白轉膜儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4實驗方法 按照隨機數字表法,隨機取45只大鼠中的8只作為正常組,剩余37只參照Border 等[11]報道的方法構建膜性腎病模型：分別于雙腋下、雙腹股溝皮下注射1 mL C-BSA乳化溶液(60 mg C-BSA溶解于30 mL生理鹽水中,再加入30 mL弗氏不完全佐劑充分乳化)進行預免疫,隔日注射1次,共注射3次;然后尾靜脈注射16 mg/kg C-BSA乳化溶液進行正式免疫,隔日注射1次,共注射4周;檢測24 h尿蛋白量≥20 mg/L則認定膜性腎病模型制備成功。按隨機數字表法將32只成模大鼠分為模型組、金雀異黃酮組、瑞沙托維組和金雀異黃酮+瑞沙托維組,每組8只。金雀異黃酮組腹腔注射金雀異黃酮30 mg/kg(參考文獻[12]確定給藥劑量),瑞沙托維組腹腔注射瑞沙托維10 mg/kg(參考文獻[13]確定給藥劑量),金雀異黃酮+瑞沙托維組腹腔注射金雀異黃酮30mg/kg和瑞沙托維10 mg/kg,正常組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水,均1次/d,連續注射4周。

1.5檢測指標及方法

1.5.1腎功能指標 干預結束后,收集24 h尿液并1 500 r/min離心(離心半徑10 cm)5 min,取上清液,-20 ℃保存。腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后,經腹主動脈采血并1 500 r/min離心(離心半徑10 cm)5 min,取血清,-20 ℃保存。然后按照試劑盒說明,通過分光光度法檢測24 h 尿蛋白及血BUN、SCr、血漿白蛋白水平。

1.5.2腎組織病理學形態及膠原沉積情況 取部分右側腎組織,于10%福爾馬林溶液中固定72 h,經脫水、石蠟包埋、4 μm切片、展片、55 ℃烤片、脫蠟水化等處理后,分別按照試劑盒操作說明行HE染色和Masson染色,光學顯微鏡下觀察腎組織病理形態及膠原沉積情況,計算膠原沉積分數。

1.5.3腎細胞超微結構 取部分左側腎組織,剪切修飾成1 mm 3小塊后,4 ℃依次4%戊二醛、2%鋨酸固定2 h,梯度丙酮脫水處理后,Epon812包埋樹脂進行包埋,70 nm超薄切片,醋酸鈾和檸檬酸鉛電子雙染色,通過透射電子顯微鏡觀察腎細胞超微結構。

1.5.4腎組織IgG沉積情況 取制備好的石蠟切片,經脫蠟水化處理后,FITC標記的IgG避光孵育2 h,PBS溶液沖洗3×5 min后,通過免疫熒光顯微鏡觀察腎組織IgG沉積情況。

1.5.5腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平 取部分右側腎組織,冰上剪碎后加入9倍量4 ℃生理鹽水,冰上研磨勻漿,3500r/min離心(離心半徑10cm)5 min,取上清液,然后按照試劑盒操作說明,通過ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.5.6腎組織中TLR4、NF-κB p65、TGF-β1mRNA表達情況 采用RT-PCR法檢測：取100 mg左側腎組織,Trizol法提取總RNA,按照試劑盒操作說明將RNA反轉錄成cDNA,然后進行PCR擴增(擴增條件：95 ℃ 5 min預變性;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,共循環40次),以β-actin作為內參基因,應用2-ΔΔCT計算mRNA相對表達量。PCR引物由北京Servicebio公司設計與合成,見表1。

表1 引物序列

1.5.7腎組織中TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達情況 采用Western blot法檢測：取100 mg左側腎組織,加入1 mL RIPA裂解液后冰上研磨勻漿,通過2次離心提取總蛋白[先3 500 r/min離心(離心半徑10 cm) 5 min取上清液,然后12 000 r/min離心(離心半徑10 cm)30 min取沉淀],BCA法進行蛋白含量測定,30 μg/孔上樣,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后轉至PVDF膜,5%脫脂奶粉溶液封閉PVDF膜2 h,一抗稀釋液TLR4(1∶1000)、NF-κB p65(1∶1000)、TGF-β1(1∶800)、Col-Ⅰ(1∶800)、Col-Ⅲ(1∶800)、p-Smad2/3(1∶1000)、Smad7(1∶1000)、β-actin(1∶2 000)4 ℃避光孵育12 h,二抗IgG(1∶2 000)室溫孵育1.5 h,洗膜后ECL顯色,通過Image J圖像分析軟件檢測各蛋白條帶灰度值。

2 結 果

2.1各組大鼠腎功能指標比較 與正常組比較,模型組大鼠24 h 尿蛋白及血BUN、SCr水平均明顯升高(P均<0.05),血漿白蛋白水平明顯降低(P<0.05);與模型組比較,各藥物組大鼠24 h 尿蛋白及血BUN、SCr水平均明顯降低(P均<0.05),血漿白蛋白水平均明顯升高(P均<0.05);金雀異黃酮+瑞沙托維組大鼠24 h 尿蛋白及血BUN、SCr水平均明顯低于金雀異黃酮組和瑞沙托維組(P均<0.05),血漿白蛋白水平均明顯高于金雀異黃酮組和瑞沙托維組(P均<0.05);金雀異黃酮組和瑞沙托維組各指標水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 正常組和膜性腎病各組大鼠腎功能指標比較

2.2各組大鼠腎組織病理學形態比較 HE染色顯示：正常組大鼠腎組織形態結構未見異常;模型組腎小球系膜增生、體積增大,腎小管細胞空泡樣變,間質區炎性細胞浸潤;與模型組比較,各藥物組大鼠腎組織病理學改變不同程度減輕,其中金雀異黃酮+瑞沙托維組減輕更明顯。Masson染色顯示：正常組大鼠腎間質區可見微量散在分布的膠原沉積,膠原容積分數為(3.74±0.41)%;模型組大鼠腎間質區和腎小球可見大量膠原沉積,膠原容積分數為(36.05±4.79)%,明顯高于正常組(P<0.05);與模型組比較,金雀異黃酮組、瑞沙托維組和金雀異黃酮+瑞沙托維組大鼠腎間質區、腎小球膠原沉積均明顯減少,膠原容積分數分別為(18.77±2.30)%、(23.15±2.64)%、(8.63±1.05)%,均明顯低于模型組(P均<0.05),且金雀異黃酮+瑞沙托維組明顯低于金雀異黃酮組和瑞沙托維組(P均<0.05),金雀異黃酮組和瑞沙托維組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1及圖2。

圖1 正常組和膜性腎病各組大鼠腎組織HE染色形態(×400)

圖2 正常組和膜性腎病各組大鼠腎組織Masson染色表現(×400)

2.3各組大鼠腎細胞超微結構比較 正常組大鼠腎細胞超微結構形態未見異常;模型組大鼠腎小球細胞腫脹,足突融合或消失,基底膜不規則增厚,上皮細胞下可見大量電子致密物沉積;與模型組比較,各藥物組大鼠腎細胞超微結構病變不同程度減輕,其中金雀異黃酮+瑞沙托維組改善更明顯。見圖3。

圖3 正常組和膜性腎病各組大鼠透射電子顯微鏡下腎細胞超微結構(×5 000)

2.4各組大鼠腎組織IgG沉積情況比較 正常組大鼠腎組織中未見IgG沉積;模型組大鼠腎小球中見大量IgG彌漫性沉積;與模型組比較,各藥物組IgG沉積量明顯減少,金雀異黃酮+瑞沙托維組IgG沉積量明顯少于金雀異黃酮組和瑞沙托維組。見圖4。

圖4 正常組和膜性腎病各組大鼠腎組織IgG沉積情況(免疫熒光染色,×400)

2.5各組大鼠腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 模型組大鼠腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯高于正常組(P均<0.05);各藥物組大鼠腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯低于模型組(P均<0.05),且金雀異黃酮+瑞沙托維組各指標水平均明顯低于金雀異黃酮組和瑞沙托維組(P均<0.05),金雀異黃酮組和瑞沙托維組各指標水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 正常組和膜性腎病各組大鼠腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.6各組大鼠腎組織中TLR4、NF-κB p65、TGF-β1mRNA表達情況比較 模型組大鼠腎組織中TLR4、NF-κB p65、TGF-β1mRNA相對表達量均明顯高于正常組(P均<0.05);各藥物組大鼠腎組織中TLR4、NF-κB p65、TGF-β1mRNA相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05),金雀異黃酮+瑞沙托維組各指標 mRNA相對表達量均明顯低于金雀異黃酮組和瑞沙托維組(P均<0.05),金雀異黃酮組和瑞沙托維組各指標mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖5。

圖5 正常組和膜性腎病各組大鼠腎組織中TLR4、NF-κB p65、TGF-β1 mRNA相對表達量

2.7各組大鼠腎組織中TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達情況比較 與正常組比較,模型組大鼠腎組織中TLR4、NF-κB p65、TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、p-Smad2/3蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05),Smad7蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,各藥物組大鼠腎組織中 TLR4、NF-κB p65、TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、p-Smad2/3蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05),Smad7蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05);金雀異黃酮+瑞沙托維組大鼠腎組織中 TLR4、NF-κB p65、TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、p-Smad2/3蛋白相對表達量均明顯低于金雀異黃酮組和瑞沙托維組(P均<0.05),Smad7蛋白相對表達量明顯高于金雀異黃酮組和瑞沙托維組(P均<0.05);金雀異黃酮組和瑞沙托維組各蛋白相對表達量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖6。

圖6 正常組和膜性腎病各組大鼠腎組織TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達情況

3 討 論

膜性腎病是中老年腎病綜合征的主要病因之一,目前主要采取激素或免疫抑制劑類藥物治療,但這些藥物往往具有較廣泛的不良反應而不適宜長期應用[14]。因此,探索安全有效的新型治療藥物對改善膜性腎病患者預后具有重要意義。

本實驗采用尾靜脈注射C-BSA的方法構建膜性腎病模型,該方法具有操作簡單、成功率高、穩定性好等優點。本實驗結果顯示,膜性腎病模型大鼠腎功能明顯降低,腎組織呈現腎小球體積增大、腎小管細胞空泡樣變、間質區炎性細胞浸潤、間質區和腎小球大量膠原沉積等病理學改變,透射電子顯微鏡觀察發現腎小球細胞腫脹,基底膜不規則增厚,上皮細胞下大量電子致密物沉積等超微結構改變,腎小球IgG大量彌漫性沉積,與Liu等[15]和王婷等[16]報道一致。但樊紅衛等[17]研究發現膜性腎病大鼠腎小球萎縮,這可能與膜性腎病嚴重程度不同有關。經金雀異黃酮干預4周后,膜性腎病大鼠腎功能指標、腎組織病變明顯改善,腎小球IgG沉積明顯減少,說明金雀異黃酮能夠改善膜性腎病大鼠腎功能,減輕腎損傷。

炎癥反應和組織纖維化是膜性腎病發生進展的重要因素。IgG免疫復合物沉積將刺激白細胞、巨噬細胞等聚集并釋放炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α等而引發炎癥反應,促進腎系膜區、間質區等部位炎性細胞浸潤而擴大炎癥損傷,破壞足細胞結構,損傷腎小球濾過屏障,加重病情[18]。腎纖維化是膜性腎病向終末期腎病發展的重要病理通路,TGF-β1作為強致纖維化因子,可促使腎成纖維細胞增殖與分化[19]。Liu等[20]發現,TGF-β1可誘導其跨膜受體(TβR)磷酸化,p-TβR誘導Smad2/3磷酸化而促進Col-Ⅰ、Col-Ⅲ轉錄表達,促使細胞外基質過度生成與沉積,進而導致腎組織纖維化。Smad7能夠與Smad2/3競爭性結合p-TβR而抑制細胞外基質生成與沉積,對組織纖維化具有負性調控作用[21]。本研究發現,金雀異黃酮干預能夠明顯降低膜性腎病大鼠腎組織中膠原容積分數和IL-1β、IL-6、TNF-α水平,下調腎組織中TGF-β1mRNA和TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、p-Smad2/3蛋白表達,上調Smad7蛋白表達,提示金雀異黃酮能夠通過抑制炎癥反應和腎纖維化減輕膜性腎病大鼠腎損傷。

TLR4/NF-κB信號通路是調節炎癥反應和組織纖維化的重要途徑,膜性腎病可刺激TLR4表達上調,進而促進NF-κB表達與核轉位,入核后NF-κB p65與DNA特定位點結合而誘導IL-6、TNF-α等表達,從而加重炎癥損傷[22]。此外,NF-κB核轉位后NF-κB p65可促進TGF-β1表達上調,從而加重組織纖維化[23]。本研究發現,金雀異黃酮能夠明顯下調膜性腎病大鼠腎組織中TLR4、NF-κB p65 mRNA和蛋白表達,提示金雀異黃酮對膜性腎病大鼠炎癥反應和腎纖維化抑制作用可能與其抑制TLR4/NF-κB信號通路有關。為了驗證上述推論,本實驗設置了瑞沙托維(TLR4抑制劑)組和金雀異黃酮+瑞沙托維組,結果顯示瑞沙托維組各檢測指標變化趨勢與金雀異黃酮組相同,瑞沙托維可明顯增強金雀異黃酮對膜性腎病大鼠上述指標的調控作用,從而進一步證實了金雀異黃酮減輕膜性腎病大鼠炎癥反應和腎纖維化與其抑制TLR4/NF-κB信號通路有關。

綜上所述,金雀異黃酮可明顯改善膜性腎病大鼠腎功能,減輕腎損傷,其機制可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路,減輕炎癥反應和腎纖維化有關。本實驗結果為金雀異黃酮用于膜性腎病的治療提供了理論依據,但是作用機制有待進一步明確。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。