透視·雞胚骨骼的炫彩世界

金諭青

探尋炫彩世界的神秘鑰匙

骨骼是身體的支撐系統，不僅為動物提供結構穩定性和運動功能，還保護著內部脆弱的臟器，如心臟、肺臟和大腦。通過胚胎骨骼透明染色實驗，我們可以賦予軟骨鮮艷的藍色，而讓硬骨呈現深邃的紅色。這種技術可以在不損毀肌肉組織的情況下清晰地呈現軟骨和硬骨的胚胎發育過程。那么，動物肌肉到底是如何變得透明的？骨骼又是如何“穿上”光鮮的衣裳公之于眾的？

動物肌肉的透明程度與折射率的匹配度息息相關。當肌肉組織的折射率與介質（如甘油）相近時，光線通過組織時的散射和折射程度會降低，更容易透過組織，使組織變得透明。氫氧化鉀作為一種堿性溶液，可以降解一些不利于光線穿透的生物成分，如蛋白質、脂質和血紅素，從而減少組織內的散射源，提高透明度。此外，氫氧化鉀還能與細胞膜中的磷脂發生反應，引發皂化作用。這個過程會破壞細胞膜結構，使細胞內的物質溶解到溶液中，進一步增加透明度。

軟骨和硬骨能夠呈現不同的顏色，歸根結底是與異性相吸有關。阿利新藍是一種陽離子染料，軟骨細胞內富含的糖胺聚糖，如硫酸軟骨素和透明質酸等這些帶負電的酸性物質成分正好與帶正電的阿利新藍染料結合，將軟骨染成藍色；而屬于陰離子染料的茜素紅在溶液pH值為12左右時，又可以與硬骨中大量存在的鈣離子“碰撞出”深紅色化合物，使得硬骨呈紅色。

用鑰匙開啟新世界的大門

為了運用染色技術觀察雞胚的骨骼發育，我們于2023年7月購買了紅瑤雞的種蛋，并進行了孵化。在實驗前，我們可以提前配制相關試劑，例如預透明液、脫色劑等。

實驗過程大致分為10個步驟：固定、去皮、軟骨染色、脫水、復水、預透明、硬骨染色、脫色、再透明、保存。首先將胚胎從蛋殼中剝離，清洗干凈后放入75%酒精溶液密封浸泡2～5天，保持組織完整，并脫去部分水分。在固定期間，我們需擇日對長有表皮和毛發的胚胎做去皮處理，以免影響染料的滲透。這里將一個去皮小技巧分享給大家：在腹部稍下的位置輕輕地提起表皮，用手術刀劃開一處小口，分別向前、向后撕去表皮，雙翼部分及爪部應小心處理。

固定期結束后，將標本放入阿利新藍染劑中浸泡。具體浸泡時間應根據標本的體形大小適當調整，當觀察到軟骨表層呈藍色就代表染色成功了。染色完畢后，脫水和復水處理緊隨其后?？赡苡腥嗽诖藭a生疑惑，為什么剛在無水酒精中脫完水的標本又要降梯度復水呢，豈不是多此一舉？其實，復水處理是為了讓標本處于一個中性的環境，并脫去標本表面殘余的酒精溶液，為后續進入堿性的預透明環節作鋪墊。千萬注意，不能為了省事就將標本直接從無水酒精轉入蒸餾水中，這樣會使原本緊致的肌肉遇水突然膨大而暴裂。

接下來的預透明環節極為重要，踏入透明世界的第一步就在這一環節，然而這也是極易“翻車”的步驟。只有利用預透明液將胚胎的肌肉組織透明化，骨骼才能嶄露頭角。在此環節中，我們需要對雞胚保持時刻關注，透明時間太長會出現標本“散架”的情況。我們應該至少每隔2小時觀察一下胚胎的透明情況，直至肌肉透明呈果膠狀。在移動標本的時候需格外小心，因為此時的標本已經變得非常柔軟脆弱。

預透明后的硬骨染色也是至關重要的一步，染色時間太短會導致染色不均的后果，而時間太長，又會造成不可逆的過度染色的情況。所以，染色過程也要隨時觀察，避免時間過長，影響肌肉脫色和整體透明效果。在染色時，肌肉等軟組織也會被染上顏色，這時候我們需略施小計，使用脫色劑將軟組織上的顏色脫掉，讓骨骼大放異彩。但是，在肌肉脫色的過程中，染色的骨骼也可能會被脫去顏色，所以我們仍需隨時觀察脫色情況，在骨骼未褪色之前結束此步驟。

實驗的最后就是使用甘油與低濃度氫氧化鉀的混合液進行升梯度再透明，待骨骼完全顯現，即可裝瓶欣賞和研究。

揭開炫彩世界的神秘面紗

通過觀察不同發育時期的胚胎染色標本，硬骨和軟骨能夠快速地被肉眼識別，其大小、形狀、發育規模和趨向統統一覽無余。如果有幸捕捉到骨骼發育的起點，我們還可以依據骨骼早期著染的顏色來判斷其骨骼的發育方式。

本實驗有幸“邀請”到了一位幸運觀眾——雞的趾骨。趾骨的發育方式是軟骨成骨。什么是軟骨成骨？顧名思義，就是在骨骼發育過程中，先形成軟骨，然后軟骨組織被硬骨取代，完成骨骼的發育。這些骨骼首先會被染成藍色，隨著胚胎發育的進展，可以清晰地看到紅色逐漸取代了藍色，這也就是軟骨骨化的過程。

在第六天的胚胎中，雞胚2～4趾露出雛形，而1趾還“躲”在皮膚里，尚未出現。在第八天的標本中，所有腳趾以通體藍色的形態出現并開始分節，這就印證了趾骨發育的軟骨成骨方式。在第十四天的標本中，我們可以觀察到近端的趾節開始率先變紅，這讓我們意外地發現趾骨的第一骨化中心在趾的近端（接近腳掌的一端），而非遠端。在第十八天的標本中，四趾基本骨化完全，只有骨節連接處保留藍色的軟骨。因為小雞還在逐漸長大，所以軟骨會一直在骨骼的兩端不斷生長。

與軟骨成骨相對的還有一種成骨方式——膜內成骨。通過這種方式發育的骨骼通常不經過軟骨階段，直接由結締組織發育成硬骨。雞的顱蓋骨、面顱骨和叉骨多以膜內成骨方式發育。

在觀察第十四天和第二十一天的雞胚時，我們的目光被牢牢地“吸附”于四片紅彤彤的區域，這是雞顱蓋骨中的額骨和頂骨部分。遺憾的是，我們未能捕捉到額骨和頂骨的發育起點，使得兩骨的發生方式無法被討論。幸運的是，我們能夠依據額骨、頂骨的長勢推斷其愈合方向。在出殼期之后的一段時間，四塊骨骼會逐漸向中間靠攏，形成一個完整的“紅帽子”扣在雞的頭頂。

大多數的骨塊在胚胎出殼前基本骨化完全，而額骨卻硬是拉長了發育這條“戰線”，這或與它的雙重發育起源及尺寸較大有關。

雞顱骨的各塊骨骼通常是由神經嵴和中胚層分別主導發育形成的，這兩者之間通常會發育一層界面，防止干擾彼此工作，而恰巧有一界面存在于眶上骨和額骨的交界處，這使得額骨下界的發育受到神經嵴細胞和中胚層細胞的雙重影響，變得遲緩。這也就能解釋為什么發育到孵化期三分之二的額骨仍然表現為一條細縫狀紅線。

繼續探索遼闊的透明世界

值得一提的是，在實驗過程中總會遇到復雜多變的狀況。其一，預透明的時間非常難掌握，唯一的解決辦法就是勤觀察、多試錯。其二，硬骨和軟骨染色不均勻是實驗中遇到的一個大問題。硬骨染色不均尚可以通過直接復染進行解決，而軟骨染色不均就沒有那么輕松了。

令人遺憾的是，因本次實驗取樣不全，未能記錄到胚胎中各個骨骼的確切骨化過程，但“不滿是向上的車輪，能夠載著不自滿的人前進”，這些遺憾是我們在這光彩奪目的透明世界繼續探索下去的動力。

作者單位|沈陽師范大學古生物學院