干旱脅迫對青稞幼苗小分子代謝成分的影響

雷東花 王楚軼 王紫陽 趙昊民 康志鈺

摘要： 為探究短期干旱脅迫下不同耐旱性青稞幼苗小分子代謝物的變化，以青稞品種（滇青1號和滇青2號）為材料，用20%聚乙二醇（PEG）模擬干旱脅迫，采用氣相質譜-色譜聯用儀（GC-MS）對處理組（24 h）和對照組（0 h）的代謝組學進行分析，研究干旱脅迫下青稞的代謝物質變化。結果表明，2個處理組（D1-0與D1-24、D2-0與D2-24）分別有24、10個差異代謝物，其中差異代謝物木糖醇、D-葡萄糖、1-單棕櫚素、甘油、乙?；?L-賴氨酸在2個處理組中共有。對2個處理組的差異代謝物進行分析，發現D1-0與D1-24在脅迫24 h的差異代謝物多于 D2-0 與D2-24，在D1-0與D1-24中，糖類及多元醇主要以上調為主，而有機酸和氨基酸主要以下調為主；在 D2-0 與D2-24中發現，糖類及多元醇以上調表達為主。還發現D-葡萄糖、木糖醇、甘油在2個處理組中都是上調表達，而乙?；?L-賴氨酸、尸胺都是下調表達。KEGG通路分析發現，氨基酸途徑在2個處理組中分別有5、1條通路，而碳水化合物途徑分別有3、2條通路，其中D1-0與D1-24主要在氨基酸途徑中富集，D2-0與D2-24在碳水化合物途徑中富集。由此可知在應對短期干旱脅迫時，青稞幼苗主要通過積累木糖醇、D-葡萄糖、甘油、乙?；?L-賴氨酸等差異代謝物抵御干旱，還發現通路分析中的氨基酸代謝通路和碳水化合物代謝通路與青稞抗旱性密切相關。

關鍵詞： 青稞；干旱脅迫；代謝組；差異代謝物；GC-MS技術；KEGG分析

中圖分類號：S512.301 ?文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）02-0051-06

干旱是影響農業生產的全球性問題，能使農作物減產達50%以上，由此帶來巨大的經濟損失［1-2］。青稞主要種植在氣溫低、海拔高、環境比較惡劣的地方，在這種環境長期的馴化下使得其逐漸適應并生活下來，也由此獲得了耐旱、耐寒等優異特性［3-4］。對青稞進行抗旱性研究有助于抗旱基因的發掘和應用，也有助于其他作物抗旱性的遺傳與育種研究。作物的幼苗在面對逆境時其抵抗能力減弱［5］，這是由于幼苗對逆境脅迫的忍受能力弱，使得作物在幼苗期就停止了生長，所以對作物幼苗期的研究是當下研究的重中之重［6-7］。對于青藏人民來說，由于青稞是他們的主食，所以必要的研究可以促進當地的經濟增長和社會穩定［8］。

代謝組學是分子生物學研究領域中廣泛使用的生物技術工具［9-10］，大多應用于植物對逆境脅迫的分子響應機制，用來評估某一特定代謝物質或代謝途徑中的代謝水平［11-12］，包括用氣相色譜-質譜、液相色譜-質譜（GC-MS）、核磁共振、高效液相色譜和毛細管電泳-質譜等多種方法鑒定植物、微生物等在各種逆境脅迫下的反應機制［13］。該技術已經用于冬小麥［14］、野生大豆［15］、藜麥［16］、紫花苜蓿［17］、長白落葉松［18］、高羊茅［19］、黃芪［20］等的抗旱性研究，從中可以看出脂類、糖類和氨基酸類代謝物是影響較大的幾類。代謝組學可以反映植物應對干旱的生理生化變化，從而揭示植物的抗旱機制。本研究用2個抗旱性不同的青稞品種（滇青1號抗旱性強于滇青2號）在20%PEG中處理24 h后，應用GC-MS技術分析小分子代謝物的變化，明確其抗旱機制，為青稞的抗旱性育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料與處理

試驗材料是由云南農業大學自主培育的2個青稞品種，分別為滇青1號和滇青2號，經研究發現其抗旱性不同［21］。將滇青1號和滇青2號種子用10%過氧化氫消毒40 min，之后用蒸餾水沖洗4～5次。將青稞種子放入有吸水紙的發芽盒中，用蒸餾水浸濕，每個發芽盒50粒種子，先放入25 ℃的黑暗培養箱中催芽，待第1張真葉可見時，轉入溫度為23～25 ℃培養箱（濕度75%～80%，光—暗周期為 12 h—12 h），期間加少量水保證種子正常生長。待2張真葉可見時，加入1/2的霍格蘭水培營養液，每 2 d 換1次。3葉期在營養液中加入20%的PEG模擬中度干旱。將滇青1號和滇青2號分別標記為D1和D2，并分別在干旱脅迫0、24 h時取樣，標記為D1-0、D1-24、D2-0、D2-24，葉片迅速用液氮冷凍，用于代謝組學測定。每個處理3個生物學重復。

1.2 代謝物提取和測定

代謝物的提取和測定參照Lisec等的方法［22-24］稍作修改進行。采用7890A/5975B GC-MS氣相色譜和質譜聯用儀（安捷倫公司）進行。

氣相參數設置：進樣口的溫度為280 ℃，柱流量2 mL/min；初始溫度為80 ℃，反應2 min，之后以 15 ℃/min 的速度增長到230 ℃，反應10 min。

質譜參數設置：電子轟擊離子源（EI），電子能量70 eV。傳輸線溫度：250 ℃，離子源的溫度為 230 ℃，四極桿的溫度為150 ℃。采用全掃描模式進行質譜檢測，掃描范圍為70～600質荷比，溶劑延遲時間3 min。

1.3 數據處理與分析

得到的GC-MS數據用Excel 2010進行整理，主成分分析（PCA）、差異代謝物篩選、KEGG富集分析用在線軟件MetaboAnalyst5.0（https：//www.Metaboanalyst.ca/）進行。Venn圖、熱圖用TBtools（https：//github.com/CJ-Chen/TBtools）軟件制作。

2 結果與分析

2.1 青稞葉片代謝物主成分分析

首先對數據進行歸一化處理，根據主成分分析可知（圖1），不同處理下的3個樣本相互聚集，說明試驗重復性好。第1主成分把D1-0、D2-0和 D1-24、D2-24分離， 解釋樣品總變化量的40.7%。 第2主成分把D1-0和D2-0、D2-24明顯分離，其中D1-24分離不明顯，解釋樣品總變化量的33.0%。第1主成分中D1-0和D2-24分離明顯，而D1-0和D2-0在第2主成分中分離明顯。

2.2 青稞葉片24 h干旱處理下的差異代謝物篩選

試驗數據采取t檢驗和正交偏最小二乘法得出的VIP值來篩選差異代謝物（VIP>1，P<0.05）。對干旱脅迫24 h的2個處理組作Venn圖分析（圖2），D1-0與D1-24、D2-0與D2-24分別有24、10個差異代謝物，2個處理組共有5個差異代謝物，分別是木糖醇、D-葡萄糖、1-單棕櫚素、甘油、乙?；?L-賴氨酸。說明青稞在干旱脅迫24 h時，糖類及多元醇、氨基酸和有機酸發揮了重要作用。

2.3 青稞葉片24 h干旱處理下差異代謝物聚類熱圖分析

對2個處理組（D1-0與D1-24、D2-0與D2-24）的差異代謝物的差異倍數作熱圖分析（圖3），發現D1-0與D1-24在脅迫24 h的差異代謝物多于D2-0與D2-24，D1-0與D1-24有9個上調，8個下調，而D2-0與D2-24有7個上調，3個下調。在D1-0與D1-24中，糖類及多元醇主要以上調為主，而氨基酸和有機酸主要以下調為主；在D2-0與D2-24中，糖類及多元醇以上調表達為主（表1）。塔羅糖（talose）、D-（+）-木糖［D-（+）-xylose］、阿拉伯糖醇（arabinitol）、蔗糖 （sucrose）、蜜二糖［melibiose，octakis（trimethylsilyl）-］ 、天冬酰胺（asparagine）、絲氨酸（serine）、L-谷氨酸（L-glutamic acid）、硬脂酸（stearic acid）、苯甲酸（benzoic acid）、腺嘌呤（adenine）只在D1-0與 D1-24 處理組中表達；而L-蘇氨酸（L-threonine）、4-氨基丁酸（4-aminobutanoic acid）、丙烯胺（propylamine）、腺苷醇（adonitol）只在D2-0與D2-24處理組中表達，由此可說明這些代謝物的表達影響了2個青稞品種耐旱性的差異。還發現D-葡萄糖（D-glucose）、木糖醇（xylitol）、甘油（glyceryl-glycoside TMS ether）在2個處理組中都是上調表達，而乙?；?L-賴氨酸（N-alpha-acetyl-L-lysine）、尸胺（cadaverine）都是下調 表達，乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷（ethyl-alpha-D- glucopyranoside）在D1-0與D1-24處理組中上調表達，在D2-0與D2-24處理組中下調表達，說明D-葡萄糖、木糖醇、甘油、乙?；?L-賴氨酸、尸胺、乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷代謝物對青稞的耐旱性發揮了積極的作用。

2.4 干旱處理24 h下青稞葉片差異代謝物KEGG富集分析和注釋

將得到的差異代謝物注釋到KEGG通路上并進行通路富集分類分析（圖4）。D1-0與D1-24、D2-0與D2-24分別注釋了11、4條代謝通路（P<0.05），抗旱性強的D1在干旱脅迫24 h下激活了更多的代謝通路，還發現新霉素、卡那霉素和慶 大霉素（neomycin，kanamycin and gentamicin?biosynthesis）的生物合成在2個處理組中富集率均最高。本研究發現，D1-0與D1-24注釋了5條氨基酸類代謝通路（表2），分別包括丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸的代謝（alanine，aspartate and glutamate metabolism）、精氨酸的生物合成（arginine biosynthesis）、氨基酸-tRNA的生物合成（aminoacyl-tRNA biosynthesis）、組氨酸代謝（histidine metabolism）、精氨酸和脯氨酸的代謝（arginine and proline metabolism）（圖4-A）；而 D2-0 與D2-24注釋了1條，為纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成（valine，leucine and isoleucine biosynthesis）（圖4-B）。D1-0與D1-24注釋了3條碳水化合物通路，包括半乳糖代謝（galactose metabolism）、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化（pentose and glucuronate interconversions）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）；而D2-0與D2-24注釋了2條碳水化合物通路（表2），包括戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化、淀粉和蔗糖代謝。D1-0 與D1-24注釋了1條脂質代謝通路，為不飽和脂肪酸的生物合成（biosynthesis of unsaturated fatty acids）。研究發現戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化、淀粉和蔗糖代謝同時在2個處理組中，說明碳水化合物通路在2個處理組中顯著富集，同時這些代謝物對青稞干旱脅迫的調控起到關鍵的作用。氨基酸代謝通路在D1-0與D1-24處理組中富集率較大，說明D1主要通過氨基酸代謝來抵御干旱脅迫；而碳水化合物代謝途徑在D2-0與D2-24處理組中富集率較大，說明D2主要通過碳水化合物代謝來抵御干旱脅迫，可知2個抗旱性不同的品種通過不同的途徑來抵御干旱脅迫。由此可說明，碳水化合物代謝和氨基酸代謝途徑參與了2個不同抗性青稞在干旱脅迫中的響應。

3 討論

植物對逆境脅迫的應答是一個復雜的過程，其中代謝的改變是極為重要的一步。在面對脅迫時，植物通過調節代謝網絡刺激產生特殊代謝物來抵御各種逆境脅迫，也可以通過監測代謝產物的變化來揭示逆境脅迫下植物的應答機制，因此，研究作物逆境下的代謝物表達水平是了解作物抗逆機制的良好途徑［25］。本研究應用GC-MS技術對2個耐旱性不同的青稞品種脅迫24 h，研究其代謝組學的變化，發現D1-0與D1-24在脅迫24 h的差異代謝物多于D2-0與D2-24，且D1-0與D1-24激活了更多的糖類及多元醇、有機酸、氨基酸，差異代謝物大多都以上調為主。有研究采用GC-MS技術探討冬麥1號在不同溫度下的代謝物質變化發現大部分氨基酸、糖類和有機酸代謝隨著溫度的降低顯著升高，可以知道本研究與冬小麥通過大部分氨基酸、有機酸和糖類代謝的顯著增加來抵御低溫脅迫的研究［26］一致。說明青稞通過增加氨基酸、糖類及多元醇和有機酸等代謝物來抵御干旱脅迫。從Venn圖中發現糖類及多元醇、氨基酸、有機酸在2個青稞品種中具有較高的表達水平，其中木糖醇、D-葡萄糖、1-單棕櫚素、甘油、乙?；?L-賴氨酸在干旱處理下的2個品種中都表達，與在拔節孕穗期小麥干旱脅迫下代謝物變化規律的研究中發現葡萄糖、木糖醇、海藻糖等含量顯著表達的結果［27］一致，說明青稞在面對短暫干旱脅迫時通過木糖醇、D-葡萄糖、1-單棕櫚素、甘油、乙?；?L-賴氨酸代謝物來維持細胞內滲透壓的穩定。有研究表明，在干旱脅迫下，耐旱小麥基因型的蔗糖含量較高［28］，本研究發現蔗糖在耐旱品種D1中表達的結果與之一致。

而本研究中的1-單棕櫚素、甘油等有機酸代謝物可以提供能量給各種分解和合成代謝途徑的前體，使作物面對逆境脅迫時，可以維持生物正常的運行［29］。對2個處理組進行差異代謝物分析發現，D-葡萄糖、木糖醇、甘油、乙?；?L-賴氨酸、尸胺、乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷代謝物在2個處理組中都有表達，說明這些代謝物參與了青稞干旱脅迫。而各種糖代謝物的表達使逆境脅迫下細胞內的滲透達到平衡，從而有利于植物抵抗逆境［30］。

D1-0與D1-24、D2-0與D2-24有28個和20個差異代謝物分別被注釋了11、4條代謝通路，D1中多條通路被激活來抵御干旱，其中D1-0與D1-24、D2-0與D2-24主要在氨基酸途徑分別有5、1條通路，碳水化合物途徑分別有3、2條通路富集。有研究表明植物對非生物脅迫的標志性反應是氨基酸代謝物的積累，因此氨基酸途徑在抵御逆境對植物的侵害中發揮著極其重要的作用［31］，這與本研究發現氨基酸代謝通路多于其他代謝通路的結果一致。而在D1-0與D1-24處理組中氨基酸代謝途徑主要富集，其中差異代謝物天冬酰胺、絲氨酸、L-谷氨酸等顯著表達，而絲氨酸作為光呼吸的產物，在一定程度上反映光呼吸的強弱，有研究發現在滲透脅迫下植物葉片中谷氨酸、絲氨酸等氨基酸會大量積累［32］，還發現D1-0與D1-24的絲氨酸和L-谷氨酸下調，說明D1在干旱脅迫下通過下調來維持滲透壓的穩定。而D2-0與D2-24處理組中碳水化合物代謝途徑顯著富集，其中D-葡萄糖、木糖醇、甘油等代謝物顯著表達，其中糖類代謝除了可以生成大量的可溶性糖等代謝物，還可以促進植物的呼吸作用，通過吸收礦物質并合成有機物為植物的生長發育提供能量，還可以調節細胞滲透勢，使植物在逆境環境下也可以正常生長［33-36］。通路富集分析還發現，戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化、淀粉和蔗糖代謝在2個處理組中顯著富集，說明糖類代謝在青稞干旱脅迫下發揮著顯著作用，糖類的分解和合成會影響細胞的滲透性，而滲透能力的變化可以影響機體的抗逆能力，因此細胞內糖類的積累對細胞具有一定的保護作用，可以增強植物抗逆能力［37］。

4 結論

本研究采用GC-MS技術對2個青稞品種在干旱24 h下的代謝物進行分析。經過分析發現2個處理組（D1-0與 D1-24 、D2-0與D2-24）分別有24和10個差異代謝物，可知抗旱性強的D1青稞品種的代謝物多于抗旱性弱的D2青稞品種，其中木糖醇、D-葡萄糖、1-單棕櫚素、甘油、乙?；?L-賴氨酸在2個處理組中都有，說明干旱脅迫下糖類及多元醇、氨基酸和有機酸發揮著重要的作用。代謝物D-葡萄糖、木糖醇、甘油、乙?；?L-賴氨酸、尸胺、乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷在2個處理組中都有表達，說明這些代謝物在青稞干旱過程中發揮著顯著的作用。在KEGG通路分析中發現，氨基酸途徑在2個處理組中分別有5、1條通路，而碳水化合物途徑分別有3、2條通路，其中D1-0與D1-24主要在氨基酸途徑中富集，D2-0與D2-24在碳水化合物途徑中富集，可知2個品種通過不同的代謝途徑來抵御干旱脅迫。因此在干旱脅迫中，青稞品種主要通過氨基酸途徑和碳水化合物途徑來應對干旱。

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收 稿日期：2023-03-09

基金項目： 云南省重大科技專項計劃子課題（編號：202102AE090014）。

作者簡介：雷東花（1996—），女，甘肅慶陽人，碩士研究生，主要從事麥類作物遺傳育種研究。E-mail：1914970517@qq.com。

通信作者：康志鈺，博士，教授，碩士生導師，主要從事作物遺傳育種以及種子科學與工程研究。E-mail：kangzhiyu@ynau.edu.cn。