一株副干酪乳桿菌發酵生產香菇酸奶工藝研究及揮發性成分分析

羅小葉　田春燕　劉婉琳　邱樹毅

摘要：為將酸奶與香菇的營養集于一體，提高酸奶的營養價值，增加香菇深加工產品的種類及酸奶的口味，該研究以香菇汁與牛奶為主要原料，接種分離篩選出的專利微生物副干酪乳桿菌進行發酵，對原料配比、加糖量、接種量、發酵溫度進行單因素實驗，在單因素實驗結果的基礎上進行響應面優化實驗，確定副干酪乳桿菌發酵香菇酸奶的最佳工藝。結果表明，牛奶與香菇汁的最佳配比為2∶1，加糖量為7%，發酵劑接種量為4%，發酵溫度為28 ℃，在此工藝條件下發酵制得的香菇酸奶色澤呈均勻的乳白色，具有自然的香菇和酸奶發酵風味，感官評分達81分。對其理化及微生物指標進行檢測，結果表明利用該微生物及發酵工藝制得的產品符合發酵乳國家標準，同時采用頂空固相微萃取法結合氣相色譜-質譜聯用技術（HP-SPME/GC-MS）對其揮發性成分進行測定分析，共檢測出酮類、酸類、醇類、烯烴類、烷烴類等26種揮發性風味成分，其中酮類物質相對含量最高，占57.18%，酸類物質相對含量占13.69%，同時檢測到香菇主要揮發性化合物1-辛烯-3-醇（蘑菇醇）、1，2，3，5，6-五硫雜環庚烷（蘑菇精），相對含量分別為9.17%、1.96%，與感官評定香菇酸奶具有濃郁香菇風味相符合。

關鍵詞：副干酪乳桿菌；香菇酸奶；工藝研究；響應面分析；揮發性成分

中圖分類號：TS252.54文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2024）01-0040-08

Study on Fermentation Process of Mushroom Yogurt by a Strain of Lactobacillus paracasei and Analysis of Volatile Components

LUO Xiao-ye1，2，3， TIAN Chun-yan 1，2， LIU Wan-lin1，2， QIU Shu-yi1，2*

Abstract： In order to integrate the nutrition of yogurt with that of mushrooms， improve the nutritional value of yogurt， and increase the types of deeply processed products of mushrooms and the taste of yogurt， in this study， with mushroom juice and milk as the main raw materials， the patented microorganism Lactobacillus paracasei separated and screened is inoculated for fermentation. Single factor experiment is conducted on the ratio of raw materials， sugar addition amount， inoculation amount and fermentation temperature. Based on the results of single factor experiment， response surface optimization experiment? is used to determine the optimal process for the fermentation of mushroom yogurt by Lactobacillus paracasei. The ?results show that the optimal ratio of milk to mushroom juice is 2∶1， the addition amount of sugar is 7%， the starter inoculation amount is 4% and the fermentation temperature is 28 ℃. Under these conditions，the? obtained mushroom yogurt has uniform milky white color， with the flavor of natural mushrooms and yogurt fermentation.? The sensory score reaches 81 points. The physical， chemical and microbiological indexes are detected， and the results show that the products produced using this microorganism and fermentation process meet the national standards for fermented milk.At the same time， the volatile components are determined and analyzed using headspace solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry （HP-SPME/GC-MS）. A total of 26 volatile flavor components， including ketones， acids， alcohols， olefins and alkanes are detected， among which， the relative content of ketones is the highest， accounting for 57.18%， and the relative content of acids accounts for 13.69%. Meanwhile， the main volatile compounds of mushrooms， such as 1-octen-3-ol （mushroom alcohol） and 1，2，3，5，6-pentathiepane （mushroom essence） are detected， and the relative content accounts for 9.17% and 1.96% respectively， which is consistent with the sensory evaluation that mushroom yogurt has a strong mushroom flavor.

Key words： Lactobacillus paracasei; mushroom yogurt; process research; response surface analysis; volatile components

隨著人們對飲食健康越來越重視，香菇所具有的各種營養和保健功能無疑是香菇作為保健食品的基礎[1]。香菇不僅有獨特的香氣，而且味道鮮美，蛋白含量高，脂肪含量低，所以廣受消費者喜愛[2]。香菇除了含有蛋白、脂肪，還含有香菇多糖、嘌呤、酪氨酸等，研究表明香菇多糖可以促進T淋巴細胞的產生并提高其殺傷活力，從而具有提高人體免疫力的功能[3]。香菇酸奶的研發不僅可以集合香菇與酸奶的營養價值，提高產品價值，而且為香菇深加工提供了有效的方法。副干酪乳桿菌是干酪乳桿菌的一個亞種，為革蘭氏陽性菌，無孢子，同型發酵，常見于健康人體腸道[4]、自然發酵乳制品及其他發酵產品中，具有很強的耐鹽、耐酸性，其菌落呈灰白色的不透明圓形，菌落較小，表面及邊緣整齊光滑，其在發酵過程中，微生物產生的部分代謝產物對人體有益，如乙酸等有機酸類物質具有降低胃腸道酸度的作用，細菌素等肽類物質具有抑制腸道致病菌活性等作用[5]。目前香菇酸奶的制作大多以發酵效能較成熟的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為發酵劑進行酸奶發酵[6]，且發酵溫度較高，而對用副干酪乳桿菌單菌種常溫發酵香菇酸奶的方法研究較少。本實驗用的植物乳桿菌是從貴州傳統發酵食品酸湯中分離篩選的，食用安全性有保障，其發酵性能較好，產酸能力較強，能耐受pH 4.0的環境。本研究在挖掘傳統發酵食品功能微生物資源的同時，將功能微生物應用于其他發酵食品領域，通過研究香菇酸奶將香菇和酸奶的營養集于一體[7]，在提高產品營養價值的同時也為我國香菇深加工產品和乳制品新產品的開發提供了新途徑。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和儀器

1.1.1 供試原料

香菇：由貴州安慶菌農業科技有限公司提供；副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）：由貴州白酸湯分離篩選得到，該微生物在實驗室編號為FBKL1.3028，且在中國典型培養物保藏中心保藏，編號為CCTCC NO：M2020156。

1.1.2 實驗儀器

立式壓力蒸汽滅菌鍋、生化培養箱、PHS-3C酸度計、全自動凱氏定氮儀、脂肪測定儀、HP6890/5975C GC/MS聯用儀；其他常用儀器由重點實驗室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝路線

香菇酸奶制備工藝路線及流程：鮮香菇洗凈→切碎→榨汁→煮沸→過濾→香菇汁→加入純牛奶調配均勻→巴氏滅菌→冷卻→接種發酵劑→發酵→冷藏后熟→成品檢測。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 感官評價

參照GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》及RHB 104-2020《發酵乳感官評鑒細則》對產品進行量化感官評價，評價標準見表1。

1.2.2.2 理化指標的測定

脂肪的測定：參考GB 5009.6—2016中脂肪的測定方法；蛋白質的測定：參考GB 5009.5—2016中蛋白質的測定方法；酸度的測定：參考GB 5009.239—2016中酸度的測定方法；pH的測定：用PHS-3C酸度計進行測定。

1.2.2.3 微生物指標的檢測

乳酸菌數：參考GB 4789.35—2016中乳酸菌的檢測方法；大腸菌群：參考GB 4789.3—2016中大腸菌群的計數方法；沙門氏菌：參考GB 4789.4—2016中沙門氏菌的檢測方法；金黃色葡萄球菌：參考GB 4789.10—2010中金黃色葡萄球菌的檢測方法；霉菌、酵母菌：參考GB 4789.15—2016中霉菌和酵母菌的檢測方法。

1.2.3 單因素實驗

香菇酸奶是將香菇汁、牛奶、葡萄糖混合，經微生物發酵而成，牛奶與香菇汁的配比、加糖量、發酵劑接種量及發酵溫度對香菇酸奶的品質都有影響。通過單因素實驗確定牛奶與香菇汁的配比、加糖量、發酵劑接種量及發酵溫度的最佳條件。

1.2.4 響應面實驗

通過單因素實驗，以3個影響較大的因素（加糖量、發酵劑接種量和發酵溫度）作為考察因素，采用Box-Behnken響應面優化模型，優化香菇酸奶的制作工藝[8]，響應面實驗因素與水平見表2。

1.2.5 揮發性成分的測定

1.2.5.1 檢測方法

樣品處理方法：將發酵結束經冷藏后熟的香菇酸奶樣品混勻后稱取10 g，置于25 mL頂空瓶中，在60 ℃磁力攪拌加熱頂空萃取60 min后熱解吸5 min。

色譜條件：色譜柱為Agilent HP-5MS彈性石英毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），初始溫度40 ℃，保持2 min后以3.5 ℃/min升溫至180 ℃，再以10 ℃/min升溫至310 ℃，保持60 min；載氣為高純He（99.999%），汽化室溫度250 ℃，柱前壓15.79 psi，載氣流速1.0 mL/min，分流比10∶1，溶劑延遲時間3 min。

質譜條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1 776 Ｖ；接口溫度280 ℃；質量掃描范圍（m/z）29～500 amu[9]。

1.2.5.2 數據處理

所有數據均進行3次重復實驗。采用Excel 2010對實驗數據進行統計，Origin 2018和TBtools用于對特征風味成分進行主成分分析和聚類分析及圖形的繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 牛奶與香菇汁的配比對產品質量的影響

在發酵劑接種量4%、葡萄糖添加量7%及發酵溫度28 ℃的條件下，研究以牛奶∶香菇汁為1∶1、1∶2、2∶1、3∶1以及空白對照（不添加香菇汁）為單因素進行發酵實驗，根據表1規定的有關標準對產品進行感官評分，確定最佳配比，實驗結果見表3。

由表3可知，牛奶與香菇汁的配比為2∶1時，總體風味及組織狀態最佳，在色澤、氣味及滋味方面都優于其他配比，總體可接受度最高。焦鐳等[10]對香菇酸奶工藝研究中適宜的牛奶與香菇汁配比為2∶1，本實驗結果與其研究結果相近。

2.1.2 加糖量對產品質量的影響

在牛奶與香菇汁的配比為2∶1、發酵劑接種量為4%、發酵溫度為28 ℃的條件下，以加糖量5%、6%、7%、8%、9%為單因素進行發酵實驗，根據表1規定的有關標準對產品進行感官評分，確定最佳加糖量，實驗結果見表4。

由表4可知，在加糖量為7%時滋味較好，酸甜比例適中，口感細膩，總體可接受度最佳，與焦鐳等[10]、黃聰亮等[11]、李飛等[12]、孫立梅等[13]對香菇酸奶研究中加糖量一致，且添加的均為蔗糖。此外，馬儷珍等[14]、賀曉龍等[15]、鄭堅強等[7]對香菇酸奶研究中加糖量為8%，糖添加量不同與在發酵過程中使用不同產地原料香菇的營養成分有關。

2.1.3 發酵劑接種量對產品質量的影響

在牛奶與香菇汁配比為2∶1、加糖量為7%、發酵溫度為28 ℃的條件下，以發酵劑接種量2%、3%、4%、5%、6%為單因素進行發酵實驗，根據表1規定的有關標準對產品進行感官評分，確定最佳發酵劑接種量，實驗結果見表5[16]。

由表5可知，當發酵劑接種量為4%時，香菇酸奶具有發酵乳的獨特氣味，且無其他異味，在允許范圍內有少量水分析出，組織狀態爽滑細膩，酸甜度適中，總體更易讓人接受。該實驗結果與焦鐳等[10]的研究結果一致，在本研究中使用的發酵劑為副干酪乳桿菌，目前酸奶發酵劑主要是嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌等組成的復合發酵劑，使用副干酪乳桿菌作為單一發酵劑發酵香菇酸奶屬于首次研究。

2.1.4 發酵溫度對產品質量的影響

在牛奶與香菇汁的配比為2∶1、加糖量為7%、發酵劑接種量為4%的條件下，以發酵溫度24，26，28，30，32 ℃為單因素進行發酵實驗，根據表1規定的有關標準對產品進行感官評分，實驗結果見表6。

由表6可知，當發酵溫度為28 ℃時，在氣味、滋味、組織狀態方面都較協調，總體可接受度最佳。由于大部分酸奶發酵均使用嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌等組成的復合發酵劑[17-18]，該類菌株適宜生長溫度約在40～45 ℃，而本實驗從傳統酸湯中分離篩選得到的功能性菌株副干酪乳桿菌生長溫度范圍為24～35 ℃，由于微生物特性不同，利用其發酵香菇酸奶的發酵溫度與前人的研究結果也有所差異。

2.2 Box-Behnken 響應面法優化

2.2.1 響應面實驗結果分析

以3個影響因素（加糖量、發酵劑接種量和發酵溫度）作為考察因素，采用Box-Behnken模型，優化香菇酸奶的制作工藝。根據表1規定的有關標準對各實驗號進行打分，結果見表7。

通過Design Expert 8.0.6軟件進行回歸擬合，以感官評分作為響應值[19]，結果見表8。

得到3個自變量的二次多元實驗模型，其多元回歸方程式為Y=25.28－0.850A－0.431B－1.603C+0.028AB+0.018AC－0.006BC+0.019A2+0.051B2+0.027C2。由表8方差分析數據可知，二次多元模型的P<0.01，說明該實驗擬合的模型具有顯著性。失擬項的P=0.076 5＞0.05，即失擬項不顯著，其他因素對實驗結果的干擾較小，殘差由隨機誤差引起，說明Box-Behnken模型能夠相對充分地反映各因素與感官評分之間的關系[20]。另外，綜合評分回歸方程的相關系數R2=0.920 1>0.9，說明該模型能夠分析和預測香菇酸奶的發酵工藝。通過方程的一次項系數可以得出，因素C有極顯著影響（P<0.01），因素A有顯著影響（P<0.05）；影響香菇酸奶綜合評分的因素順序為發酵溫度（C）＞加糖量（A）＞發酵劑接種量（B）[21]。

根據 Box-Behnken 實驗結果繪制香菇酸奶發酵因素等高線圖及響應曲面，見圖1。對回歸模型進行預測分析，得出香菇酸奶的發酵工藝為發酵溫度27.849 ℃、加糖量6.757%、發酵劑接種量4.106%。

2.2.2 驗證實驗

考慮到實際實驗和生產的可行性，將各因素參數調整為發酵溫度28 ℃、加糖量7%、發酵劑接種量4%。依據確定的最佳提取工藝進行驗證（實驗號n=3），實際測得香菇酸奶的最終感官評分為81分，與理論值80.432分相比無顯著性差異，說明優選的香菇酸奶發酵工藝合理可行。

2.3 感官指標分析

對以實驗條件牛奶與香菇汁的配比2∶1、發酵溫度28 ℃、加糖量7%、發酵劑接種量4%所制得的香菇酸奶的感官指標進行檢測。色澤、滋味和組織狀態均符合GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》中有關規定，最終根據表1所規定的標準進行感官評價，結果見圖2。

由圖2可知，經過響應面優化得出的香菇酸奶發酵工藝制得的香菇酸奶總體可接受度高，其在氣味上有香菇味、奶香味，酸味柔和均勻；外觀上其色澤均勻一致，呈均勻乳白色，且表面光滑，無裂紋，只有較少量乳清析出；口感細膩，酸甜適中，具有香菇酸奶的滋味，酸甜味和奶香味比例適當[22]；組織狀態細膩柔軟。

2.4 理化指標分析

經上述方法測定較優工藝條件下發酵產品理化指標，結果見表9。經對比，脂肪、蛋白質及酸度均高于國家標準，符合國標GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》中有關規定。

2.5 微生物安全指標分析

與GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》相比，在香菇酸奶的微生物檢測中，大腸菌群的測定結果顯示其大腸菌群數量低于最高安全限量值，香菇酸奶中未檢出大腸桿菌；要求不得檢出沙門氏菌，香菇酸奶中未檢出沙門氏菌；要求不得檢出金黃色葡萄球菌，香菇酸奶中未檢出金黃色葡萄球菌；要求霉菌和酵母菌的含量少甚至不含有霉菌和酵母菌，香菇酸奶中未檢出霉菌和酵母菌；乳酸菌數量為8×107 CFU/g，大于國家規定標準[23]。綜上，利用該株副干酪乳桿菌生產出的香菇酸奶產品微生物限量及乳酸菌數量符合發酵乳規定，產品的安全性得到保障。對發酵產品微生物指標進行檢測，結果見表10。

2.6 揮發性成分分析

由表11可知，第7組香菇酸奶為較優的發酵組，本實驗采用HP-SPME/GC-MS技術對較優工藝生產的香菇酸奶進行揮發性成分測定及分析。

不同發酵參數條件下揮發性成分見圖3。

由圖3可知，發酵后的香菇酸奶的揮發性成分主要有酮類、酸類、醇類、烷烴類、烯烴類等，1～7組香菇酸奶分別檢測出27，23，24，27，22，23，23種揮發性成分，發酵劑接種量、加糖量、發酵溫度不同，導致揮發性成分及其含量出現差異，主要發生變化的是酸類、烷烴類和酮類物質，酮類物質在7個發酵組中含量均超過50%。第1組主要的揮發性成分是酮類（60.947%）、醇類（10.598%）、酸類（10.167%），第2組主要的揮發性成分是酮類（66.177%）、酸類（15.167%）、醇類（11.344%），第3組主要的揮發性成分是酮類（63.867%）、醇類（11.322%），第4組主要的揮發性成分是酮類（57.900%）、酸類（13.690%）、醇類（11.980%），第5組主要的揮發性成分是酮類（62.759%）、醇類（10.222%），第6組主要的揮發性成分是酮類（65.736%）、醇類（11.043%），第7組主要的揮發性成分是酮類（66.783%）、醇類（12.430%）。

采用峰面積歸一化法計算各揮發性成分的相對質量分數，得出29種揮發性成分的相對含量，用TBtools軟件對不同參數下香菇酸奶揮發性成分進行熱圖聚類分析，可直接反映不同發酵組間的物質差異[24]，見圖4。

由圖4可知，不同參數的發酵組可聚為3類，1組和4組為一類，2組、5組和6組為一類，3組和7組為一類，1組和4組的發酵溫度都為28 ℃，2組、5組和6組的加糖量都為7%，3組和7組的發酵劑接種量都為4%；1組和4組的乙偶姻、2-十一酮、苯甲酸、3-亞甲基庚烷-2-乙基-1-己烯含量較高，2組、5組和6組的甲苯、2，3-丁二酮含量較高，乙醇、十六烷含量較低，3組和7組的丙酮、2-戊酮含量較高，乙酸、鄰傘花烴含量較低；說明不同的因素參數比例對不同組香菇酸奶的風味具有一定的影響。

由圖3和圖4可知，酮類物質在香菇酸奶中占比最大，在香菇酸奶中檢出8種酮類物質，分別為丙酮、2-丁酮、2，3-丁二酮、2-戊酮、3-辛酮、2-壬酮、2-十一酮、2-庚酮，其中2-庚酮的相對含量最高，第2組的2-庚酮相對含量最高，達43.738%，其次是2-壬酮，第1組和第2組的2-壬酮相對含量最高，分別為16.220%和14.344%[25]。酮類物質主要由不飽和脂肪酸的熱降解以及氧化或微生物代謝產生，賦予了酸奶獨特的風味[26]，2-庚酮呈香蕉味、桃子味，2-壬酮呈奶油味、水果味[27]，對酸奶的風味起重要作用，對酸奶的奶香味和果香味具有較大貢獻。醇類化合物比較柔和，使酸奶的口感更加清爽[28]，醇類物質中1-辛烯-3-醇的相對含量最高，第2組中醇類物質相對含量為11.344%，其中1-辛烯-3-醇的相對含量為9.769%，在7組中的相對含量最高，1-辛烯-3-醇又稱蘑菇醇，有強烈、別致的青香、甜的藥草味，常作為香料用于飲料、糖果、冰制食品、烘烤食品、調味品中[29]，1-辛烯-3-醇是香菇酸奶特有的風味物質。酸類化合物主要是微生物分解代謝糖類以及氨基酸的產物，是酸奶的主要風味物質之一，主要體現在口感上[30]，在香菇酸奶中檢出的3種酸分別為乙酸、辛酸和苯甲酸，第2組的酸類物質相對含量較其他組高，為15.167%，且乙酸、辛酸和苯甲酸的相對含量分別為4.986%、5.481%、4.700%。鮮香菇的揮發性物質主要是含硫化合物和八碳化合物，1-辛烯-3-醇是香菇最具代表性的八碳化合物，又稱蘑菇醇；1，2，3，5，6-五硫雜環庚烷又稱香菇精，是一種揮發性環狀含硫化合物，是香菇香味的主要呈味成分之一，香味強烈并且特征性強[31]。利用副干酪乳桿菌在優選發酵工藝條件下生產的香菇酸奶中檢測到蘑菇醇和香菇精，發酵的香菇酸奶香菇風味濃郁，與感官評定結果相符合。

2.7 香菇酸奶揮發性主成分分析

對不同發酵參數的香菇酸奶的揮發性物質進行主成分分析，結果見圖5。每個點代表一個樣品組，點與點的距離表示樣品組之間特征值差異的大小，同一象限的點越接近表示揮發性成分組成及含量越相似[32-33]。

由圖5可知，PC1（41.1%）和PC2（25.0%）累計方差貢獻率為66.1%，能夠反映不同發酵參數的香菇酸奶揮發性成分的大部分信息，在不同參數條件下香菇酸奶樣品組分布在4個象限內，說明樣品差異顯著，第3組、第6組、第7組分布在二維坐標圖中第一象限內，決定這一結果的主要揮發性物質是酮類和烯烴類；第2組分布在二維坐標圖中第二象限內，決定這一結果的主要揮發性物質是醇類、酮類、酸類；第4組分布在二維坐標圖中第三象限內，決定這一結果的主要揮發性物質是酸類；第5組和第1組分布在二維坐標圖中第四象限內，決定這一結果的主要揮發性物質是烷烴類以及其他類物質。

3 結論與展望

利用從傳統發酵食品酸湯中分離出來的一株專利微生物副干酪乳桿菌發酵生產香菇酸奶產品的生產工藝是可行的，通過單因素實驗結合響應面優化實驗，最終確定香菇酸奶的最佳發酵工藝為牛奶與香菇汁配比2∶1、加糖量7%、副干酪乳桿菌接種量4%、發酵溫度28 ℃。在此工藝條件下發酵制得的香菇酸奶色澤呈均勻乳白色，具有自然的發酵風味和氣味；對其理化及微生物安全指標的檢測表明利用該微生物發酵的香菇酸奶產品符合有關國家標準；采用HP-SPME/GC-MS技術對香菇酸奶揮發性成分進行測定分析，共檢測出酮類、酸類、醇類、烯烴類、烷烴類等26種揮發性風味成分，其中酮類物質相對含量最高，占57.18%，酸類物質相對含量占13.69%，同時檢測到香菇主要揮發性化合物1-辛烯-3-醇（蘑菇醇）、1，2，3，5，6-五硫雜環庚烷（蘑菇精），相對含量分別占9.17%、1.96%，與感官評定香菇酸奶具有濃郁香菇風味相符合。該研究對傳統發酵食品中微生物資源挖掘與利用有一定理論意義，此外，在后期研究中在產品穩定性、副干酪乳桿菌發酵代謝產生的風味成分、功能性因子及利用該微生物制成成熟直投式發酵菌劑等方面可進一步研究探討，以期提高復合功能性酸奶食品的應用價值。

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收稿日期：2023-07-02

基金項目：黔教合KY字[2022]147號；黔科合成果[2020]2Y043；黔科合支撐[2021]一般106；黔科合支撐[2021]一般133；國家自然科學基金（32060518）；黔人領發[2018]3 號

作者簡介：羅小葉（1991—），女，實驗師，博士研究生，研究方向：發酵食品及微生物應用。

*通信作者：邱樹毅（1963—），男，教授，博士，研究方向：發酵工程、食品生物技術。