三次發酵技術提升工業化四川泡青菜風味的研究

張杰　徐飛　賴興悅　李博　胡剛　趙志峰　董世容　賈銀花　潘攀

摘要：目前工業化四川泡青菜大多采用兩次發酵工藝結合脫鹽、巴氏殺菌生產商品化酸菜的技術，以解決芥菜季節性收獲和酸菜常年銷售的問題。文章立足于工業化四川泡青菜的加工過程，研究了兩次發酵后的半成品泡青菜經過脫鹽后的風味損失，并設計了三次發酵進行風味優化。GC-MS與HPLC測定結果表明，脫鹽后的泡青菜特征香味物質種類減少，相對含量降低，有機酸含量顯著降低。經第3次發酵后，新增了酸類物質，賦予其草本香及酸香，并產生具有發酵果香和花香的己酸乙酯、辛酸乙酯，同時異硫氰酸酯類物質的相對含量降低，泡青菜的特征香味得到提升，自然發酵香味突出；有機酸總量提高12.69%，酸味更加柔和與醇厚；乳酸菌含量從234×102 CFU/g提高到298×103 CFU/g。該研究為工業化泡青菜自然發酵風味的提升提供了數據與工藝參考。

關鍵詞：工業化泡青菜；風味損失；脫鹽；增香；有機酸

中圖分類號：TS255.54文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2024）01-0053-06

Study on Improving Flavor of Industrialized Sichuan Pickled Green Vegetables by Triple Fermentation Technology

ZHANG JieXU FeiLAI Xing-yueLI BoHU GangZHAO Zhi-fengDONG Shi-rongJIA Yin-huaPAN Pan4

Abstract： At present， double fermentation process combined with desalting and pasteurization to produce commercial sauerkraut is mostly adopted in industrialized Sichuan pickled green vegetables in order to solve the problem of seasonal harvest of mustard and perennial sales of sauerkraut. In this paper， based on the processing process of industrialized Sichuan pickled green vegetables， the flavor loss of semi-finished pickled green vegetables by double fermentation after desalting is studied， and triple fermentation is designed to optimize the flavor. The determination results of GC-MS and HPLC show that after desalting， the types and relative content of characteristic aroma substances in pickled green vegetables decrease， and the content of organic acids decreases significantly. After the third fermentation， acids appear， giving them aroma herbaceous and sour aroma， and ethyl caproate and ethyl caprylicate with fermented fruit and flower aroma are produced. At the same time， the relative content of isothiocyanate substances decreases， and the characteristic aroma of pickled green vegetables is enhanced， highlighting the natural fermentation aroma. The total amount of organic acids increases by 12.69%， and the sourness is softer and mellow. The Lactobacillus content increases from 234×102 CFU/g to 298×103 CFU/g. This study has provided data and process references for the enhancement of natural fermentation flavor of industrialized pickled green vegetables.

Key words： industrialized pickled green vegetables; flavor loss; desalination; aroma enhancement; organic acid

泡青菜是四川泡菜中的一種，其獨特的酸爽風味來源于芥菜原料、發酵過程微生物的作用以及后期的調味。目前工業化生產的四川泡青菜大多采用兩次發酵工藝結合脫鹽、巴氏殺菌生產商品化酸菜的技術，兩次發酵工藝期間產品的鹽含量需達到12%以上[1]，以解決芥菜季節性收獲和酸菜常年銷售的問題。因此，后續需要通過脫鹽處理，降低鹽分至6%左右才能繼續加工；這些處理在脫去鹽分的同時也會使發酵產生的香味、滋味發生改變。加工企業通常采用人工加酸的方式補充泡青菜的酸味，然而此種方式難以補充泡青菜的發酵酸香。為了提升泡青菜的發酵風味，可通過直投式菌種發酵，但是菌種發酵以及低的鹽含量會導致發酵進程加快，不能達到與原工藝相同的貯藏期，發酵風味單一，且提升了生產加工的成本。因此，綜合考慮以上因素以及泡青菜的加工特點，在特定加工階段引入三次發酵技術，在不改變原有泡青菜生產工藝的基礎上對泡青菜的生產加工過程進行微創新。

成品泡青菜的制備包括前期的腌漬發酵、后期的生產加工過程，目前對泡青菜發酵過程中風味的研究較多[2-3]，而對加工過程導致的風味衰減鮮有報道，且幾乎沒有對加工過程導致泡青菜風味損失后針對性的調控措施。本文以工業化四川泡青菜為研究對象，采用三次發酵工藝，通過測定香味物質和有機酸指標評價三次發酵后產品的風味屬性，并通過乳酸菌數的變化，證明了發酵的進行，驗證了工業化的可行性，為高品質泡青菜的生產奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

工業化泡青菜加工過程：原料采收→一次鹽漬發酵→翻池二次鹽漬發酵→撈出暫存（樣品1）→清洗去污→精選整形→清洗脫鹽→泡青菜半成品（樣品2）。

泡青菜加工過程采樣情況：分別采集撈出暫存和泡青菜半成品樣品，分別標記為樣品1和樣品2。

泡青菜三次發酵過程：待加工泡青菜（樣品2，即第0天樣品）→三次發酵7 d→自然發酵泡青菜。

三次發酵過程采樣情況：乳酸菌數和香味物質測定分別采集三次發酵第0天和第7天樣品，有機酸測定分別采集三次發酵第0天、第3天、第5天和第7天樣品，樣品分別標記為0 d、3 d、5 d和7 d。

以上樣品均由四川李記醬菜調味品有限公司提供。

1.2 試劑

甲醇（色譜純）、NaCl、MRS培養基：成都市科龍化工試劑廠；磷酸（色譜純）：成都市諾爾施科技有限責任公司；草酸SO8180、檸檬酸SC9350、琥珀酸SS9520、DL-蘋果酸SM8480、乳酸SL8750（均為標準品）：北京索萊寶科技有限公司；乙酸LCEM501480-FA（標準品）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 主要儀器與設備

BMS-220 分析天平 上海卓精電子科技有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司；GCMS-QP2010 SE氣相色譜-質譜聯用儀 日本Shimadzu公司；DB-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀、TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm） 美國Agilent公司；SPME手動進樣裝置（包括SPME手動進樣手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（24 Ga，3 pk）） 美國Supelco公司；XK96-A快速混勻器 江蘇新康醫療器械有限公司；KH2200B超聲波清洗機 昆山禾創超聲儀器有限公司；TD25-WS離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 三次發酵風味調控工藝流程

泡青菜半成品→裝壇→密封→三次發酵7 d→自然發酵泡青菜。

將水、鹽漬老母水、食鹽等按一定比例配制成發酵液，調整最終含鹽量為6%。將泡青菜半成品裝入洗凈的泡菜壇中，加入配制好的發酵液，使泡青菜完全浸沒在發酵液中，用篾片壓緊，加蓋，壇口用水密封，冬日10 ℃左右環境下發酵7 d。

1.4.2 香味物質的測定

樣品處理：準確稱取5.00 g泡青菜樣品，切碎后加入樣品瓶中，蓋好蓋后于40 ℃恒溫水浴30 min，將已活化好的萃取頭插入瓶中，推出纖維頭，使之與樣品保持1.5 cm的距離，萃取溫度40 ℃，萃取時間15 min。待萃取結束后抽回纖維頭，拔出萃取頭，再將萃取頭插入GC進樣口，推出纖維頭，于250 ℃條件下解吸5 min，抽回纖維頭后拔出萃取頭，同時啟動儀器并采集實驗數據。

檢測條件：氣相色譜（gas chromatography，GC）條件：HP-5MS彈性毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣；不分流進樣模式；流速為1 mL/min；進樣口溫度為240 ℃；升溫程序：40 ℃（保持3 min），以5 ℃/min升到130 ℃（保持5 min），以25 ℃/min升到155 ℃（保持0 min），以5 ℃/min升到220 ℃（保持5 min）。質譜（mass spectrometry，MS）條件：離子源溫度220 ℃；電子能量70 eV；傳輸線溫度220 ℃；接口溫度280 ℃；采集方式：Scan，掃描范圍（m/z）：50～550 amu。

定性分析：將所測化合物的質譜信息與數據庫中已知化合物的質譜信息進行比對，選擇相似度＞85的化合物進行定性分析。

定量分析：根據被測化合物占所有化合物總色譜峰面積的比例，來計算被測組分的相對含量。

1.4.3 有機酸含量的測定

樣品處理：稱取10 g（精確至0.000 1 g）樣品，放入50 mL塑料離心管中，向其中加入20 mL超純水后在漩渦混合器中混合2 min，經超聲10 min后于5 000 r/min離心10 min，取上層清液至50 mL容量瓶中，殘留物再加10 mL水重復提取2次，合并上清液于同一容量瓶中，并用0.1%磷酸溶液定容至刻度，混勻，經0.22 μm水相濾膜過濾待測。

檢測條件：Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測器為可變波長掃描紫外檢測器（VWD）；流動相A為甲醇；流動相B為0.1%磷酸溶液；檢測波長為210 nm；進樣量為20 μL；流速為0.6 mL/min；柱溫為33 ℃。

定性方法：分別為DL-蘋果酸、琥珀酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、草酸6種有機酸標準待測溶液進行分析，以保留時間確定不同的有機酸。分別取泡青菜樣品有機酸提取液注入高效液相色譜儀得到相應的高效液相色譜圖，與標準品有機酸保留時間進行對比確定樣品中所含的有機酸種類。

定量方法：根據有機酸標準曲線對泡青菜樣品中所測的有機酸進行定量計算。

1.4.4 乳酸菌數的測定

乳酸菌數的測定參考GB 4789.35—2016。

1.4.5 數據分析

采用Microsoft Excel 2010軟件進行數據處理；采用Origin 2018軟件進行圖片處理。

2 結果與分析

2.1 加工過程對泡青菜風味的影響

2.1.1 加工過程對泡青菜主體香味物質的影響

經加工后泡青菜香味物質變化的總離子流圖見圖1。相對含量≥1%的主體香味物質的種數、相對含量的變化見表1。樣品1、樣品2的主體香味物質種數分別為15種和13種，相對含量分別為94.93%和90.86%。

從主體香味物質組成上分析，樣品1、樣品2共有的香味物質種類為烴類、醇類、醚類和酯類。烴類物質中共有的主體香味物質為1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）苯、β-倍半水芹烯、（－）-異丁香烯、間異丙基甲苯、α-姜黃烯、姜烯和（+）-2-蒈烯，其中，α-姜黃烯、姜烯和β-倍半水芹烯是姜黃揮發油的主要香味物質，是不飽和烯烴，閾值較低[4—5]，隨著加工過程的進行，大體呈現降低趨勢。古巴烯為樣品2特有的主體香味物質；2-莰烯為樣品1特有的主體香味物質。樣品1和樣品2共有的主體醇類物質為異戊醇，是高級醇類物質，具有酒精味和溶劑味[6]；乙醇為樣品1特有的主體香味物質，具有醇香。醚類物質桉葉油醇具有樟腦氣息和清涼草藥的味道[7]，為共有的主體香味物質。酮類物質姜黃酮和芳姜黃酮為樣品2特有的主體香味物質。樣品1酯類物質的種類和相對含量最多，分別為異硫氰酸烯丙酯、異硫氰酸丁酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯，除了異硫氰酸烯丙酯為二者共有的主體香味物質外，其他均為樣品1特有；異硫氰酸酯類物質是芥菜中硫代葡萄糖苷經代謝轉化的風味物質，具有辛辣、刺激和辣根氣味[8]；乙酸乙酯具有水果香，乳酸乙酯具有果香、花香[9]。

綜上，隨著加工的進行，泡青菜的特征發酵風味逐漸減弱，表現為醇類和醚類物質含量減少，β-倍半水芹烯、α-姜黃烯和姜烯含量呈現下降趨勢，具有辛辣味的異硫氰酸烯丙酯和異硫氰酸丁酯含量下降，具有發酵特征香氣的乙酸乙酯和乳酸乙酯含量也不斷下降，而僅有酮類物質種數和相對含量變得豐富。

2.1.2 加工過程對泡青菜有機酸含量的影響

不同加工過程中泡青菜的HPLC圖譜見圖2。

由表2可知，泡青菜加工過程中樣品中共檢測出6種有機酸，分別是草酸、DL-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸。其中，樣品1中各有機酸的含量分別為草酸9.63 g/kg、DL-蘋果酸5.67 g/kg、乳酸9.90 g/kg、乙酸1.26 g/kg、檸檬酸3.57 g/kg、琥珀酸12.83 g/kg，有機酸的總含量為42.86 g/kg；樣品2中各有機酸的含量分別為草酸2.29 g/kg、DL-蘋果酸0.51 g/kg、乳酸5.96 g/kg、乙酸1.11 g/kg、檸檬酸0.99 g/kg、琥珀酸0.88 g/kg，有機酸的總含量為11.74 g/kg。樣品1的有機酸以琥珀酸、乳酸、草酸為主，樣品2以草酸、乳酸為主。

整個生產加工過程中，有機酸種類雖然不變，但隨著加工過程的進行含量均降低，加工前、后有機酸的總體損失量為72.61%。

2.2 三次發酵對提升泡青菜品質的影響

2.2.1 三次發酵對泡青菜主體香味物質的影響

三次發酵后泡青菜的GC-MS圖譜見圖3，相對含量≥1%的主體香味物質的種數、相對含量的變化見表3。0 d與7 d泡青菜的主體香味物質種數分別為13種和21種，相對含量分別為90.86%和95.28%。

從主體香味物質組成上分析，0 d樣與7 d樣共有的香味物質為烴類、醇類、醚類、酮類和酯類。烴類物質中共有的主體香味物質為1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）苯、姜烯、古巴稀、（－）-異丁香烯、（+）-2-蒈烯、α-姜黃烯、β-倍半水芹烯；其中姜烯、α-姜黃烯、β-倍半水芹烯等屬于萜烯類化合物，普遍易揮發，閾值低，為姜黃精油常見的香味物質[4-5]，其相對含量均高于0 d樣；（－）-異丁香烯具有丁香氣味；間異丙基甲苯是0 d樣特有的烴類物質；β-紅沒藥烯是7 d樣特有的烴類物質。0 d樣特有的醇類主體香味物質為異戊醇；7 d樣特有的醇類主體香味物質為戊醇、芳樟醇，戊醇屬于高級醇，是發酵過程中酵母代謝副產物的主要成分之一，呈水果香，芳樟醇屬于不飽和醇，具有花香味。桉葉油醇是0 d樣和7 d樣共有的醚類主體香味物質；4-烯丙基苯甲醚是7 d樣特有的醚類主體香味物質，呈茴香、草香香氣[10]。酮類物質包括蒿酮、芳姜黃酮、β-姜黃酮和姜黃酮，其中芳姜黃酮和姜黃酮為0 d樣和7 d樣共有的主體香味物質，其余為7 d樣特有的主體香味物質；蒿酮具有特殊草本氣味，芳姜黃酮、β-姜黃酮、姜黃酮是姜黃精油的重要香味物質[11]。酸類物質是7 d樣特有的主體香味物質，酸類物質包括乙酸和3-甲基戊酸，乙酸具有酸味[12]。酯類物質中共有的主體香味物質為異硫氰酸酯類物質，其中0 d樣的異硫氰酸酯類物質相對含量遠高于7 d樣；己酸乙酯、辛酸乙酯是7 d樣特有的酯類物質，己酸乙酯呈水果香、花香，辛酸乙酯具有水果香[13]。

綜上，經三次發酵后，泡青菜的主體香味物質種數和種類增加，新增了酸類物質，0 d樣呈現濃郁的辛辣味、姜黃味及淡淡的醇香和花果香，7 d樣呈現濃郁的姜黃香、果香及淡淡的草本香、酸香、辛辣味和花香。經三次發酵后，泡青菜的風味更加柔和、豐富。

2.2.2 三次發酵對泡青菜有機酸含量的影響

泡青菜的酸味是反映泡青菜發酵程度的重要指標，其含量的多少與泡青菜的品質密切相關，并非越多越好，需要各種有機酸平衡到一定比例，才可產生柔和的發酵酸香味?，F有對泡青菜酸味的評價可以通過感官分析、pH和總酸的測定，以及進一步通過高效液相色譜法鑒定有機酸的種類例如乳酸、乙酸、蘋果酸等。前3種方法雖然比較簡單，但是較粗略，難以分析酸味物質組成變化。在本次實驗中通過對自然發酵7 d的泡青菜總酸和pH值進行測定，發現隨著發酵時間的延長，總酸含量在0.88%～0.91%、pH在3.08～3.24之間波動，無明顯變化，分析原因可能是總酸和pH值的結果難以反映短時間內三次發酵過程中泡青菜酸類物質變化的真實情況，因此還需通過測定有機酸的種類及含量進行進一步對比。

由圖4和表4可知，在整個三次發酵周期內均檢測出草酸、DL-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸，并且乳酸是三次發酵泡青菜的主要有機酸種類，其相對含量占到有機酸總量的40%以上。隨著發酵時間的延長，有機酸總量增加，發酵7 d后總有機酸含量為13.24 g/kg，相比于三次發酵前增加了12.69%。三次發酵過程中有機酸總量的增加主要源于草酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸含量的增加，其中草酸、檸檬酸、琥珀酸含量的增加幅度較大；草酸具有酸澀味，主要來自泡青菜發酵原料；乳酸本身就是一種很好的調味劑，其酸味柔和濃厚，能夠增強人們的食欲；檸檬酸有溫和而爽快的酸味；琥珀酸具有類似于貝殼的鮮味，它對鹽漬品有助鮮作用[14]。三次發酵過程中有機酸含量的增加與微生物的發酵有關，乳酸菌發酵會產生乳酸和乙酸，同時醋酸菌作用也會產生乙酸，琥珀酸、草酸、檸檬酸和蘋果酸的產生與乳桿菌屬和片球菌屬有關[15]。因此，通過三次發酵后，泡青菜的酸味更加柔和，后味綿長。

2.2.3 三次發酵對泡青菜中乳酸菌數的影響

乳酸菌是泡菜中的主要菌群，泡菜的風味主要來自乳酸菌的發酵，菌種的發酵會產生特定的代謝產物，進而影響終產品的風味。有研究表明，乳酸菌的發酵可以賦予泡菜令人愉悅的風味，例如果味和花香等[15]。由圖5可知，經過三次發酵后，泡青菜中乳酸菌數增加，第0天時泡青菜中的乳酸菌數為234×102 CFU/g，第7天時泡青菜中的乳酸菌數為298×103 CFU/g，乳酸菌量提高了一個數量級，這一結果表明是乳酸菌主導了第3次發酵過程中有機酸和香味物質的產生，進一步佐證了第3次發酵過程中產生了自然發酵的愉悅風味。

3 結論

隨著泡青菜加工的進行，β-倍半水芹烯、α-姜黃烯、姜烯、異硫氰酸烯丙酯、異硫氰酸丁酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯含量不斷下降，泡青菜的特征發酵風味逐漸減弱；此外，泡青菜加工過程中均檢測出草酸、DL-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸6種有機酸，但隨著加工過程的進行其含量均呈現不斷降低的趨勢?；诖?，引入三次發酵技術，隨著發酵的進行，泡青菜主體香味物質表現為種數和種類的增加，整體呈現出濃郁的姜黃香、果香及淡淡的草本香、花香、酸香和辛辣味，風味更加柔和馥郁；有機酸中草酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸含量均增加，酸味更加柔和、醇厚。乳酸菌數明顯提升。因此，三次發酵能夠有效提升泡青菜的香味和滋味，是風味調控的有效措施。本文為工業化泡青菜自然發酵風味的提升提供了數據與工藝參考。

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收稿日期：2023-08-03

基金項目：四川省科技成果轉移轉化示范項目（2022ZHCG0066）；綿陽市2022年中央引導地方科技發展資金項目（220038）

作者簡介：張杰（1994—），女，碩士，研究方向：食品加工與安全。

*通信作者：趙志峰（1980—），男，副教授，博士，研究方向：農產品及食品深加工。