脾虛濕盛證動物模型構建方法探析

王若沖 吳鳳芝 戴 寧 江 洋 廖文勇 張煒悅 李 峰

(北京中醫藥大學,北京,102488)

脾虛濕盛證,又稱脾虛濕困證、脾虛濕滯證,因飲食不節、勞倦過度或思慮過度,或年老體弱,久病虛損導致脾胃虛弱,運化水濕功能失常;亦可由久居濕地、涉水淋雨等外濕因素引起,臨床以脘腹痞脹或痛,泛惡欲吐,食少、納呆,頭身困重,倦怠乏力,肢體浮腫,大便糖稀或泄瀉,小便短少,可伴見水腫,腹水等為癥狀[1-2]?，F代研究表明,脾虛濕盛證是肥胖癥[3]、支氣管擴張[4]、腹瀉型腸易激綜合征[5]、潰瘍性結腸炎[6]等多種疾病的主要證型,嚴重影響人們的生命質量;2020年頒布的《疲勞性亞健康的判定及中醫證候辨識》中指出脾虛濕困證是疲勞型亞健康中醫基本證型之一[7]。為了深入探討脾虛濕盛證的本質及探尋有效的治療與干預方法,諸多研究者從不同角度構建了脾虛濕盛證動物模型。但與脾虛不同,脾虛濕盛的病因、病機更復雜,導致動物模型的建立也更為復雜。20世紀末,開始出現相關動物模型的文獻報道[8-9],近十年來研究逐步深入、成果逐漸豐富,脾虛濕盛證動物模型的構建已成為現代中醫脾胃病研究與中醫證候研究的熱點,但目前來看仍不夠完善并存在一些不足。本文對脾虛濕盛證造模思路與方法、脾虛濕盛證動物模型評價指標進行梳理、總結與探討,并對現有問題進行剖析、對研究發展方向進行展望,以期推動其發展。

1 脾虛濕盛證造模思路與方法

《素問·至真要大論篇》曰:“諸濕腫滿,皆屬于脾?！毖悦髌⒅\化失司是“濕”產生的關鍵,但濕為陰邪,易損傷陽氣,濕邪困脾則又會影響脾胃的功能,二者可互為因果、相互作用導致脾虛濕盛證的形成。目前脾虛濕盛證的動物模型即以病因作為切入點與思路構建模型,主要以飲食失宜、勞逸失度、久居濕地等作為造模因素。

1.1 單因素法

1.1.1 飲食失宜法 中醫認為,過食肥甘厚味會導致中焦壅遏,脾運失常,濕濁內生[1],飲食失宜的單因素法中主要通過對嚙齒類動物進行高脂飼料喂養,常應用于脾虛濕盛肥胖癥的模型建立。如陳蘭玉等[10]對雄性小鼠連續10周高脂飼料喂養建立脾虛濕阻盛證肥胖小鼠模型,發現模型組小鼠體質量及糞便含水量明顯增高、轉棒儀實驗中表現出明顯疲勞癥狀。

1.1.2 久居濕地法 久居濕地法是通過將實驗動物長期放置于高濕度環境從而構建模型的一種方法,如王昕等[11]將大鼠放于相對濕度90%～100%的自制造模箱內,每天14 h共持續45 d,成功建立濕傷脾陽證大鼠模型。張六通等[12]延長了造模時間,將大鼠每天放置于底部有2 cm的厚濕鋸末的自制造模箱內12 h(相對達濕度(90±5)%),造模持續108 d。實驗結束后發現,模型組大鼠胃泌素含量下降,胃動素增加,免疫力下降,腸道菌群失衡,且大鼠宏觀體征符合脾虛濕盛證的表現。李蓉[13]將小鼠放置于4 ℃低溫高濕度的環境下連續7 d,每天4 h,發現小鼠不僅出現脾虛癥狀,如毛發暗淡無光澤且稀疏、體質量減少等;還出現濕盛的癥狀,如足背皮膚浮腫,大便糖稀等,并認為此方法很好地模擬了外感寒濕損傷脾陽的過程與表現。

1.2 復合雙因素法

1.2.1 飲食失宜法聯合久居濕地法 郭金龍和顏正華[9]于1988年首先采用肥甘厚味飲食法聯合久居濕地法構建大鼠脾虛濕盛證模型,將大鼠連續5 d飼養于相對濕度(95±3)%的環境中,并每天給予大鼠含有20%的蜂蜜飲品50 mL,在造模開始及結束后的第48、96 h給予大鼠豬油灌胃20 g/只,造模結束后,造模動物出現了不欲飲水,食欲不振,倦怠便溏、體質量降低,體溫升高等表現。王劍和趙若龍[14]每天8:00-12:00時及14:00-18:00時將小鼠置于濕度(90±5)%的人工箱內,并且每天給予小鼠灌胃熟地黃混合液(熟地黃、牡蠣、啤酒、花生油制備)0.5 mL/只,造模共持續6 d,發現小鼠出現濕困脾胃證的表現,經藿香正氣液治療后基本恢復正常水平。朱夢夢等[15]首先采用高脂飼料喂養小鼠3周,于第4周將墊料加水營造外濕環境(50 g/100 mL),累計造模10周,將脾虛濕阻證的一般狀態總結為模型篩選表,并配合糞便含水量以及疲勞轉棒儀實驗對造模小鼠進行篩選,最終發現脾虛濕阻型單純性肥胖小鼠造模成功率高于80%。

1.2.2 飲食失宜法聯合勞倦過度法 高潔等[16]為探討脾虛水濕不化大鼠模型的胃腸功能,在每天高脂低蛋白飼料喂養的基礎上,以負重力竭游泳作為過勞因素,連續造模60 d,建立大鼠脾虛水濕不化模型。模型組大鼠血清淀粉酶含量、胃泌素含量及尿中D-木糖的排泄率均顯著降低,表明脾虛水濕不化狀態下大鼠胃腸功能會出現下降。趙文曉等[17]及楊彬彬等[18]也以高脂低蛋白飼養聯合負重力竭游泳的方法,分別對大鼠進行連續48 d及56 d的實驗后成功構建了大鼠脾虛濕困證模型。

此外也有學者在肥甘厚味的基礎上增加了饑飽無度及過食寒涼的造模因素構建動物模型。如劉金蓮等[19]單日以高脂飼料喂養大鼠,雙日對大鼠禁食,并且每天對大鼠進行力竭游泳訓練,共持續28 d。發現大鼠具備脾虛濕盛證的一般表現與宏觀體征,并以胃泌素、胃動素等作為脾虛相關指標,白蛋白、醛固酮等作為濕盛指標,對模型進行了系統評價。陳浩等[20]首先在高脂飼料喂養的基礎上,對大鼠進行2次/d,2 mL/(次·只)的冰糖水灌胃,同時每天對大鼠進行力竭游泳訓練。造模后檢測大鼠脾虛濕盛相關指標,并以肝腎功能的多項指標作為排除肝郁氣滯、脾腎兩虛等證型的依據,確定此方法建立了脾虛濕阻證肥胖動物模型。

1.3 復合多因素法 復合多因素法常選用飲食失宜法、勞倦過度法及久居濕地法等中的3～4個造模因素進行模型構建,如劉瑤等[21]建立濕困脾胃證亞健康大鼠模型,將模型組大鼠飼養于濕度(90±5)%的實驗室內,并且每天將大鼠放置于4 cm深的水籠中8 h,飲食為單日禁食,雙日喂養高脂飼料;并于造模的第1天、第4天、第7天強迫大鼠高強度游泳,當大鼠頭沉入水面后短暫拿出休息,然后再次放入水中,連續5次后結束游泳,共計造模10 d。發現模型組大鼠與健康大鼠相比出現飲水量下降,大便糖稀,皮毛渾濁,活動能力下降,精神萎靡,體質量減輕等癥狀,通過生化指標檢測發現模型組大鼠的免疫及代謝功能下降,并采用藿香正氣散進行藥物反證。孫冬月和高慧[22]使用中間帶有隔板的水籠,使大鼠站立于隔板之上,隔板下水深3 cm,模擬外濕環境;同時每天強迫大鼠進行20 min的游泳;飲食方面單日正常飲食豬油灌胃,雙日禁食冰水灌胃。通過宏觀體征觀察、胃腸功能檢測及能量代謝等指標檢驗模型。

此外,在脾虛濕盛證動物模型構建中,改良多平臺水環境法與水籠法,可作為一種復合因素進行造模。改良多平臺水環境法是將嚙齒類動物放入一個特制水箱的小平臺上,平臺下1 cm由水注滿,強迫實驗動物在平臺上站立[23]。水籠法是將大鼠放置于2～4 cm水深的籠內飼養[24],此2種方法利用嚙齒類動物天生畏水習性,當其休息或入睡時即會落入水中驚醒,從而一直保持站立狀態。改良多平臺水環境法及水籠法不僅可以模擬外濕侵襲的因素,還可模擬久立勞倦的因素。2008年張豐華等[25]首次應用此方法將大鼠放置于4 cm深的水籠中,每天強迫其站立8 h,配合饑飽無度法(單日禁食灌胃4 ℃冰水,雙日大鼠正常飲食灌胃豬油),連續造模20 d,建立濕困脾胃證大鼠模型,此外張豐華根據文獻調研與大鼠生物學特征,制定了脾虛濕困證模型宏觀癥狀診斷標準,此后研究者多以此為標準評價動物模型。熊艷玲等[26]復制此方法進行模型構建,將原本的20 d實驗時長延長到了48 d,并通過改進的脾虛濕困證宏觀標準、脾虛濕困證動物模型癥狀積分評分標準評價模型建立。此外,亦有研究調整飲食失宜因素,如單日豬油灌胃[27],雙日禁食(但不灌冰水)與水籠法相配合,但方法大同小異此處不再贅述。

改良多平臺水環境法多應用于脾氣虛證的模型構建,近年來也有部分研究從理論方面討論了改良多平臺水環境法聯合飲食失宜等因素建立脾虛濕盛證動物模型的可能性[28-29]。孟高達[30]建立脾虛濕阻型功能性腹瀉大鼠模型,給予大鼠高乳糖飼料喂養,并采用改良多平臺水環境法對大鼠進行每天進行10 h的強迫站立,造模時間為兩周,發現模型組大鼠出現明顯消瘦、便溏、自主活動減少等脾虛濕阻證癥狀,血清中D-木糖含量遠低于空白組,小腸吸收率下降,并以參苓白術散作為藥物反證取得良好療效,認為采用高乳糖喂養聯合改良多平臺水環境法可建立功能性腹瀉脾虛濕證的大鼠模型。

2 脾虛濕盛證動物模型評價指標

模型的評價標準是模型構建中至關重要的一部分,動物模型是否可以良好地模擬出臨床疾病及相關證型,需要客觀、準確及科學的評價標準。目前,脾虛濕盛證動物模型主要從動物模型似人的癥狀表現;借助先進技術檢驗的客觀指標2個方面進行模型評價。

2.1 動物模型癥狀及表征評價 臨床中辨證是證型診斷的基礎,動物模型中“辨證”則需要將人體癥候表現與模型動物的生物學特性相聯系,制定診斷標準。張豐華等[25]根據《中醫證候規范》《中醫證候病理學》《中醫濕病學》等書籍并結合大鼠生物學特征,從模型形成的時間及自然恢復速度、生活狀態、食量等8個方面制定了濕困脾胃證大鼠模型的宏觀癥狀診斷標準。此后李姿慧等[31]、熊艷玲等[26]也分別根據文獻及大鼠生物學特性制定了脾虛濕困證大鼠模型宏觀體征診斷標準。目前研究者評價脾虛濕盛證模型大鼠的宏觀體征多選用以上3種評價標準。見表1。此外,熊艷玲等[26]還根據大便、飲食、體質量增長率、倦怠表現及皮毛狀態分為5個評分模塊,每個模塊根據動物的相應狀態以0～4分進行量化評價,建立了大鼠脾虛濕困模型癥狀量化積分表。當總積分≥4分,可視為模型建立成功;當4≤總積分≤5視為輕度,6≤總積分≤10分為中度,>10分為重度。見表2。

表1 大鼠脾虛濕困證模型宏觀癥狀常用評價標準

表2 脾虛濕困大鼠模型癥狀量化積分

2.2 客觀評價指標

2.2.1 疲勞相關指標 脾虛會表現出神疲乏力、少氣懶言、肢體倦怠等癥狀;濕邪重濁黏滯,可阻礙氣機運行,留滯肢體經絡,導致肢體沉重、倦怠乏力等疲勞表現。因此脾虛濕盛證中疲勞是一個重要的評價因素。行為學實驗中可通過轉棒儀疲勞實驗、負重力竭游泳實驗及抓握力實驗等進行評價,生化指標中ATP、乳酸、乳酸脫氫酶、尿素氮及磷酸肌酸激酶等均是判斷脾虛濕盛證模型疲勞狀態的重要指標。研究表明,脾虛濕困證模型組大鼠血清乳酸、乳酸脫氫酶、尿素氮下降,負重力竭游泳時間減少[32-33]。此外有研究者從能量代謝方面進行研究,發現脾虛濕盛證大鼠血糖與鈉鉀泵(Na+-K+-ATP酶)、鈣泵(Ca2+-ATP酶)會出現下降[30,34]。

2.2.2 胃腸功能指標 脾虛濕盛可導致脾胃運化失司,消化系統功能下降,因此胃腸功能衰退和(或)損傷是脾虛濕盛證評價的重要指標之一,多體現于胃腸動力功能下降與胃腸黏膜損傷。胃排空率、小腸推進率,胃動素是判斷胃腸道運動功能的重要指標[35],如劉瑤和劉偉[36]通過水籠法聯合勞倦過度法、飲食失宜法建立亞健康脾虛濕困模型,發現大鼠胃殘留率升高,小腸推進率減少,經灌服藿香正氣散干預后明顯改善。孫冬月等[22]建立濕困脾胃證大鼠模型后發現與空白組相比,大鼠胃排空率,腸推進率減少;并通過病理切片,發現模型組胃黏膜充血嚴重,出現腫脹及脫落,胃底腺腫脹,黏膜肌增生,形態與結構上均有改變。王劍和趙若龍[14]對濕困脾胃證小鼠進行胃腸組織病理觀察,發現胃脹氣明顯,胃黏膜表面液體明顯增多,經染色后在顯微鏡下觀察,發現腸道組織黏液分泌增多,黏膜層存在充血水腫。

此外,血清胃泌素與D-木糖的濃度是判斷脾虛證或脾虛濕盛證胃腸道功能的“金標準”[37-38],胃泌素可作用于消化系統平滑肌上的受體,產生三磷酸肌醇,從而激發胃平滑肌收縮行為,另外胃泌素是主要調劑胃酸分泌的激素。D-木糖是一種在血液中不含有的五碳糖,口服D-木糖后血液和尿液中的濃度可反應小腸吸收功能,同時胃泌素的分泌可促進D-木糖吸收。因此,胃泌素及D-木糖濃度是評價脾氣虛或脾虛濕盛證的嚴重程度及干預后療效的重要指標。楊彬彬等[19]通過飲食失宜法聯合勞倦過度法建立脾虛濕困證大鼠模型,檢測后發現血清中胃泌素、D-木糖、胃動素濃度下降明顯,經過黃芪多糖干預后可明顯改善。

2.2.3 水液代謝異常相關指標 脾虛濕盛證的另一大表現是水液代謝失常,這是脾虛濕盛證與單純脾虛證相鑒別的重要指標。研究者可通過糞便含水量及腸管含水量的測定進行鑒別,亦可通過水通道蛋白中白蛋白、醛固酮、血管活性腸肽等含量進行評判。白蛋白是血漿中含量最多的蛋白質,具有維持血液膠體滲透壓的功效,是判斷水液代謝及水腫狀態的一個重要的指標[39]。此外醛固酮、血管活性腸肽是參與水液代謝的重要激素,也與人體水液代謝相關,血管活性腸肽與其受體結合后,可刺激結腸黏膜,增加水和電解質的分泌而導致腹瀉。因此,有學者認為該指標可在一定程度上反映脾虛濕盛證大便溏稀的微觀變化[40]。如,王彥芳等[41]檢測脾虛水濕不化模型發現血清中的白蛋白、血管活性腸肽含量明顯升高,提示機體出現水液代謝紊亂,濕邪偏盛。

3 研究的不足

近年來對于脾虛濕盛證動物模型構建方面的研究取得了一定進展,但是仍存在一些問題與不足之處。

3.1 動物模型證型命名 以脾為病位濕為病性的證型文獻中記載較多,命名又較為相近,十分繁瑣,給研究者帶來了諸多不便。1)根據國家技術監督局頒布的國家標準GB/T 16751.2-2021《中醫臨床診療術語·證候部分》[1]將脾為病位、濕為病性的證候分為6種證型(不以寒熱病性為主),可見表3,部分證候如脾虛濕盛證又有多種同義命名,而這6類證型臨床表現又較為相同。在臨床中此6類證型的病機及表現即有較高的重合,辨證存在難度,故在動物模型中的辨證則更加困難,這就導致動物模型構建中此6類證型的造模思路相同,方法相近,評判標準較為一致,但其動物模型證型命名卻十分混亂,如參與措施運用水籠法聯合飲食不節法(干預方法與持續天數均相同),但模型卻有濕困脾胃證、脾虛濕盛證、脾虛濕阻證等多種證候命名。2)此外,研究者在動物模型命名時未以標準化證型命名,如脾虛水濕不化模型、濕傷脾陽證及濕滯脾胃模型等。這些命名較為口語化,未使用證候標準化用語,使原本就多樣的證候命名更加繁雜,也給研究者帶來很多困難。

表3 脾為病位濕為病性之證型標準

3.2 模型證候評價標準 合理的證候模型需要科學的評價體系,但現階段脾虛濕盛證動物模型的評價體系仍然存在一些問題:1)雖然脾虛濕盛證動物模型癥狀及表征的評價經總結與量化,已形成較好的評判體系及量化標準,但如倦怠、懶動、蜷縮聚堆,毛色枯槁等的評價仍較為主觀。2)脾虛濕盛證的客觀指標主要集中在疲勞狀態、胃腸功能、代謝功能等方面,這些指標與脾虛證的指標重合度較高。雖然目前已經發展出了一些濕盛相關的指標,但仍有不足,缺乏與“濕”相關的“金標準”。3)以方驗證是證候模型評價的一個重要方法,以方藥治療效果為依據具有良好的客觀性。但動物模型證型命名的混亂,造成方藥選擇的困難,上述研究選用方藥既有單味藥又有復方,各方思路互不一致,標準不統一。

3.3 構建模型的方法 近年來,脾虛濕盛證模型構建已從單因素法造模逐步轉變為以飲食失宜法為核心的復合型造模法。這從病因角度更貼合當代人產生脾虛濕盛證的過程,但在具體的方法上仍存在一些不足:1)現在較主流的飲食失宜法是對嚙齒類動物進行單日禁食冰水灌胃、雙日正常飲食豬油灌胃的饑飽無度法[42-43],但再加上每天藥物灌胃治療,這就會導致實驗動物一日之內被多次灌胃,造成食管及咽喉部的損傷,這些與實驗無關的因素則會或多或少地影響實驗結果。2)造模因素的表述錯誤,這主要出現在水籠法及改良多平臺水環境法中的造模。因在此類方法中實驗動物需保持站立,而無法休息或者入睡,因此部分研究者將此因素定義為睡眠剝奪。但嚙齒類動物每天的睡眠時間為12～13 h[44-45],脾虛濕盛證造模中的水籠法和改良多平臺水環境法站立的時間通?？刂圃?～10 h,遠遠無法達到睡眠剝奪的要求。因此,這種復合造模方法主要是通過外濕侵襲、久立勞倦的因素進行模型構建而并非睡眠剝奪。3)脾虛濕盛證模型的形成應該是一個長時間、慢性的過程,因此造模時間不應太短,實驗時間在2周以上才可較好地模擬臨床上發病的過程。但部分實驗造模周期較短,這則與臨床病史不太相符合[46]。

4 未來的展望

上述問題是研究的難點,更應是解決與發展的重點,今后可從以下幾方面進行改進及發展:1)將傳統較為復雜的證型,根據實驗動物的生物學特性進行標準化、規范化的簡化,并減少一些非標準化的證型命名使用,如可在動物模型建立中將脾虛濕盛證、脾虛水泛證等相近病因、病機及癥狀的證型規范為一種具有概括性的證型。2)完善證候評價體現,將主觀的證候表現客觀化,如便溏的程度,就可以通過糞便含水量來評判;神疲乏力的程度也可通過動物行為學中疲勞的實驗或自主活動的指標進行客觀評價;皮毛色澤,舌象等也可與現代科技結合,運用比色及圖像分析等技術進行分析。3)完善模型構建方法,如單日禁食冰水灌胃,雙日正常飲食豬油灌胃會導致無關因素影響實驗,研究人員可以改為單日禁食不禁水提供冰水飲用,雙日高脂飼料飼養,這樣就會減少對實驗動物的非必要損傷。

利益沖突聲明:無。