金線蓮提取物對脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷的保護作用及機制研究

朱亮 包曉君 王群星 徐菲拉

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是指除心源性外的各種直接或間接因素所致的肺組織結構特征性病理改變而出現的臨床綜合征，年死亡率達30%～40%，是臨床常見危重癥[1]。目前ALI 尚無有效的治療方法，患者預后并不理想。ALI發病機制仍未確切闡明，失控性炎癥反應或是ALI病情進展中的關鍵環節[2]。細胞因子和炎癥趨化因子因肺內炎癥細胞過度活化、募集，在短時間內形成級聯反應，產生“細胞因子風暴”，導致廣泛肺上皮細胞和肺血管內皮細胞的損傷，最終造成ALI的發病及發展[3]。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是革蘭陰性菌細胞壁主要毒性成分，可誘導免疫細胞介導的炎癥反應網絡，引起一系列的前炎因子釋放，進而誘發ALI，其誘導的體內實驗模型與臨床ALI 高度相似[4]。相較于腹腔注射LPS 的動物模型，鼻腔滴入LPS 誘導ALI 體內模型可更好地模擬ALI 的發病過程與機制[5]。金錢蓮為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，是民間珍貴的中藥材，具有較明顯的抗炎、鎮痛、抗腫瘤、護肝、免疫調節、降血糖、降血壓等藥理作用，并已廣泛應用于臨床[6-10]。但金線蓮對ALI的藥理作用尚未見報道。本研究采用LPS 鼻腔滴注構建小鼠ALI 模型，觀察金線蓮對該模型的保護作用，并初步探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 60 只SPF 級雄性ICR 小鼠，體質量25～30 g，購于北京斯貝福生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010。

1.2 藥物與試劑 金線蓮由浙江金華天寧堂生物科技公司提供，經金華市中心醫院徐菲拉主任醫師鑒定為Anoectochilus formosanus Hayata。金線蓮提取物的配置：取金線蓮生藥64 g，加水1 000 mL 浸泡2 h，煎煮4 h，藥液經旋轉蒸發儀濃縮至160 mL 作為高劑量組（生藥濃度0.4 g/mL），梯度稀釋成中（0.2 g/mL）、低劑量（0.1 g/mL），備用；按70 kg 成人體重計算，成人給藥劑量為0.285 g/kg，根據人與動物間體表面積折算的等效劑量比值[11]，換算為本實驗小鼠給藥劑量：高劑量為5.200 g/kg，中劑量2.600 g/kg，低劑量為1.300 g/kg。LPS購于美國Sigma公司，批號為153963，使用時稱取0.8 mg，用0.9%氯化鈉溶液溶解定容至2 mL，4 ℃冰箱保存。

地塞米松粉劑購于上海源葉生物科技有限公司，批號：H07N9Z74419，使用時稱取2.5 mg，用0.9%氯化鈉溶液溶解定容至4 mL，4 ℃冰箱保存。人核因子κB抑制蛋白α（I-kappa-B-alpha，IκBα）抗體、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）抗體均購于美國Proteintech公司，批號為00056584 和00045155；磷酸化細胞外信號調節蛋白激酶（phosphorylated extracellular signalregulated kinase，p-ERK）抗體、β 肌動蛋白（β-actin）和磷酸化IκBα（phosphorylated IκBα，p-IκBα）購于美國Affinity 公司，批號為56o9874、12w2944 和68m1458；小鼠IL-6 ELISA 試劑盒、小鼠單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）ELISA 試劑盒、小鼠IL-12/p70 ELISA 試劑盒、小鼠IFN-γ ELISA試劑盒、小鼠TNF-α ELISA 試劑盒、小鼠IL-10 ELISA試劑盒均購于江蘇酶免實業有限公司，批號分別為MM-46428M1、MM-0082M1、MM-0174M1、MM-0182 M1、MM-46435 M1、MM-46420M1；細胞外信號調節蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）抗體、p-ERK 抗體、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）抗體、磷酸化JNK（phosphrylated JNK，p-JNK）抗體、p38抗體、磷酸化p38（phosphorylated p38，p-p38）抗體、腺苷單磷酸活化蛋白激酶α（adenosine monophosphate activated protein kinase α，AMPKα）抗體、磷 酸 化AMPKα（phosphorylated adenosine monophosphate activated protein kinase α，p-AMPKα）抗體、MPO抗體、山羊抗兔IgG 預吸附二抗均購買于美國Abcam公司，批號分別為GR3305911-2、GR1489866-8、GR70875 11-65、GR5455638-19、GR5455638-19、GR337 6466-11、GR0837100-56、GR40 28577-36、GR9346133-12、GR 3214733-25。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，批號為20220218。

1.3 ALI 模型的建立及分組處理 小鼠適應性飼養1周后，隨機分為模型組、對照組、地塞米松組、金線蓮高、中、低劑量組，每組10 只。模型組、對照組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，地塞米松組給予地塞米松5.0 mg/kg 溶液腹腔注射，金線蓮高、中、低劑量組分別給予不同劑量（1.3、2.6、5.2 mg/kg）的金線蓮提取物灌胃，均為0.33 mL/只；連續給藥2 d[12]。48 h后用4%水合氯醛溶液按0.01 mL/g 腹腔注射麻醉小鼠，對照組給予0.9%氯化鈉注射液滴鼻，其余各組給予LPS 滴鼻，50 μL/只。4 h后，重復給藥1次。24 h后造模完成[13]。取LPS 處理過的小鼠頸椎脫臼處死，剝離肺組織制備石蠟切片，采用常規HE 染色法進行組織病理學觀察，以肺組織肺泡壁增厚，炎性細胞浸潤等病理變化判斷ALI 模型制備成功。隨后每組取5 只小鼠，頸椎脫臼處死；解剖并暴露支氣管及肺組織，使用0.9%氯化鈉溶液從支氣管內注入肺部后吸出，沖洗3 次，獲得肺泡灌洗液；4 ℃3 000 r/min 離心10 min，收集上清液并分裝后置于-80 ℃冰箱保存，備用。解剖取肺組織，濾紙吸水后稱濕質量并記錄；取部分左肺臟以10%甲醛固定，剩余左肺稱質量。新鮮右肺置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.4 指標檢測

1.4.1 6 組小鼠肺組織病理學檢查 采用HE 染色法，顯微鏡下觀察各組小鼠組織病理變化。

1.4.2 6 組小鼠肺組織濕干比（wet/dry，W/D）的檢測取部分左肺組織，洗去殘留血液，用濾紙吸干表面水分后稱質量，得到濕質量（W）。隨后放入60 ℃烘箱內烘48 h，再次稱質量，得到干質量（D），計算W/D。W/D 越大，表示肺組織的水腫程度越高。

1.4.3 6組小鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞因子的檢測 采用ELISA 法。按照相應試劑盒說明，測定肺泡灌洗液中IL-6、MCP-1、IL-12/p70、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平。

1.4.4 6 組小鼠肺組織中MPO、p-ERK、IκBα 和p-IκBα 蛋白表達水平的檢測 采用免疫組化法。取剩余左肺組織，按免疫組化試劑盒說明經過脫臘、抗原修復后進行免疫組化檢測。顯微鏡下觀察并拍照，棕黃色為陽性信號。應用Image Pro Plus 軟件測量圖像的累積光密度值和區域面積值，以兩者比值確定肺組織中MPO、p-ERK、IκBα 和p-IκBα 蛋白表達水平。

1.4.5 6 組小鼠肺組織中ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、AMPKα、p-AMPKα、MPO 蛋白相對表達量檢測 采用Western bolt 法。取右肺組織裂解，根據BCA 定量檢測試劑盒方法檢測總蛋白。電泳分離，轉膜、封閉液封閉，用TBST 洗膜3 次，10 min/次，將膜放入含ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、AMPKα、p-AMPKα、MPO 一抗稀釋液的孵育盒中，4 ℃搖床振蕩孵育過夜；TBST 洗凈后，用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗，室溫搖床振蕩反應1～2 h，用TBST 洗凈后加入ECL 發光試劑充分接觸反應3 min。凝膠成像儀成像后，chemi capture 軟件保存圖像，以β-actin 為內參，采用Image J 軟件分析各蛋白相對表達量。

1.5 統計學處理 采用SPSS 22.0 統計軟件。計量資料以表示，兩組樣本間比較選用兩獨立樣本t檢驗，多組樣本間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 6 組小鼠肺組織病理學觀察 對照組肺組織結構基本正常，層次清晰，未見明顯病理學變化；模型組肺組織出現大量炎癥細胞浸潤，組織結構破壞；地塞米松組與金線蓮高劑量組少量炎癥細胞浸潤，組織結構基本完整；金線蓮中劑量組和金線蓮低劑量組有較多炎癥細胞浸潤，組織結構存在破壞，見圖1（插頁）。

圖1 小鼠肺組織病理學觀察

2.2 6 組小鼠肺組織W/D 比較 與模型組比較，對照組、地塞米松組、金線蓮高劑量組、金線蓮中劑量組肺組織W/D 顯著降低（P＜0.01），見表1。

表1 6 組小鼠肺組織的W/D 比較

2.3 6 組小鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞因子水平的比較 與模型組比較，對照組、地塞米松組、金線蓮高劑量組肺泡灌洗液中IL-6、MCP-1、IL-12/p70、IFN-γ、TNF-α 和IL-10 的水平均顯著降低（均P＜0.05）；金線蓮中劑量組IL-6、IFN-γ、TNF-α 和IL-10 水平均顯著降低（均P＜0.05），金線蓮低劑量組，各炎癥細胞因子水平變化均無統計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 6 組小鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞因子水平比較

2.4 6 組小鼠肺組織中MPO、p-ERK、IκBα 和p-IκBα蛋白表達水平比較 與模型組相比，對照組、地塞米松組與金線蓮高劑量組肺組織MPO、p-ERK、p-IκBα蛋白表達水平均顯著降低（均P＜0.05），但IκBα 蛋白表達水平均無顯著性變化（均P＞0.05）。見圖2（插頁）和表3。

圖2 免疫組化檢測小鼠肺組織MPO、IκBα、p-ERK、p-IκBα 的表達情況

表3 6 組小鼠肺組織中MPO、p-ERK、IκBα 和p-IκBα 蛋白表達水平比較

2.5 6 組小鼠肺組織中ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、AMPKα、p-AMPKα、MPO 蛋白相對表達量比較 與模型組相比，對照組、地塞米松組、金線蓮高劑量組、金線蓮中劑量組肺組織中p-ERK、p-JNK、pp38、p-AMPKα、MPO 蛋白相對表達量顯著降低（均P＜0.01），ERK、JNK、p38、AMPKα 蛋白相對表達量未見顯著變化，見圖3 和表4。

圖3 小鼠肺組織中ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、AMPKα、p-AMPKα、MPO 蛋白電泳圖

表4 肺組織中ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、AMPKα、p-AMPKα、MPO 蛋白相對表達量比較

3 討論

ALI 是一種以呼吸困難、急性低氧呼吸衰竭、雙側肺浸潤、肺水腫、進行性低氧血癥等癥狀為特征的危重癥綜合征，當氧合指數＜200時即被稱為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），ARDS 是由ALI 發展而來的一個復雜的級聯過程，是同一疾病過程的兩個階段[14]。該病發病率較高，是新型冠狀病毒感染重癥患者的常見并發癥。目前臨床上缺乏特異有效的治療手段，通常只能采用以控制感染、機械通氣、液體管理等為主的支持性治療。研究發現，以金線蓮為主藥的方劑治療新型冠狀病毒感染患者，可顯著改善患者咽痛、發熱、喘憋氣促等臨床癥狀，縮短呼吸道病原核酸檢測轉陰時間[15]。這提示金線蓮可能對LPS誘導的ALI小鼠具有保護作用。

炎癥反應在ALI 的發病過程起到關鍵作用。炎癥反應促使過多的炎癥細胞遷移并釋放大量促炎和細胞毒介質，造成血管通透性廣泛增加和上皮損傷，導致間質及肺泡水腫和透明膜發育，過度的炎癥過程在ALI 的病理生理中起著關鍵的有害反應，有效控制過度炎癥反應的發生、發展是目前治療ALI 的重要策略[16-17]。金線蓮提取液通過抑制巨噬細胞釋放炎性因子和上調抗炎因子水平發揮對LPS 誘導的小鼠急性炎癥反應的保護作用[18]。本研究結果顯示，與對照組相比，LPS 模型小鼠肺組織病理切片伴有明顯的炎癥細胞浸潤，肺泡間隔及肺泡壁增寬，肺組織的W/D 升高，說明模型建立成功。使用金線蓮提取物干預ALI 小鼠，小鼠肺組織病理損傷有所減輕，炎癥細胞浸潤改善。這提示金線蓮提取物對LPS 所致ALI 小鼠肺部病理變化有較好的改善作用。ELISA 檢測顯示高劑量金線蓮提取物可使肺泡灌洗液中IL-6、MCP-1、IL-12/p70、IFN-γ、TNF-α 和IL-10 水平不同程度降低（均P＜0.05），提示金線蓮提取物通過抑制炎癥過度反應、降低中性粒細胞的浸潤來保護LPS 誘導的ALI。

MPO 是中性粒細胞外捕網的重要成分，亦是中性粒細胞的功能標志和激活標志，具有促氧化和促炎的特性，其異常表達可激活炎癥反應信號進而誘發各種慢性炎癥性疾病[19-20]。本研究的Western blot 檢驗和免疫組化實驗均驗證了金線蓮提取物可使經LPS 誘導的ALI 小鼠肺組織中升高的MPO 表達水平顯著降低，提示金線蓮提取物具有顯著的抗炎作用。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶參與了全身炎癥反應及其調控機制。目前研究表明，ALI 過程中MAPK 信號通路可調節下游產物活性，影響炎癥細胞黏附血管內皮、在炎癥部位激活并釋放炎癥因子[21]。其中，ERK、JNK 和p38 等蛋白質已證實與ALI 關系密切[22]。當MAPK 通路被激活時，p-ERK、p-p38 和p-JNK 單獨或聯合轉移到細胞核，誘導相關炎癥因子靶基因的表達并促進炎癥反應。研究發現，澤漆水提物可通過下調JNK、p38、ERK1/2 蛋白表達，降低炎癥因子TNF-α、IL-6 等細胞因子的分泌，從而減輕LPS 誘導的ALI 的炎癥反應，減輕肺部損傷；麻杏石甘湯通過抑制炎癥反應以改善LPS 誘導的ALI，原因可能是麻杏石甘湯可顯著下調肺組織中NF-κB、ERK1/2、JNK 和p38 的蛋白表達從而影響MAPK/NF-κB 信號通路；p38 抑制劑可通過調節Treg 細胞和Th17 細胞失衡來減輕LPS 導致的ALI[23-25]。種種證據表明，MAPK 信號通路可作為研究治療ALI 的潛在病理機制。本研究顯示，相較模型組，金線蓮高、中劑量組肺組織中p-ERK、p-JNK、pp38、p-AMPKα 和MPO 蛋白相對表達量顯著降低，p-ERK、p-IκBα 和MPO 蛋白表達水平顯著降低，提示金線蓮對ALI 小鼠的抗炎作用機制可能與調節MAPK 信號通路有關。

綜上所述，金線蓮一定程度上改善了LPS 誘導的小鼠ALI，其潛在的機制可能是通過MAPK 信號通路干預細胞因子，發揮抗炎作用。但本實驗未能就金線蓮對MAPK 信號通路靶向調節作用及其上下游蛋白的反饋性調節作用進行研究，擬在今后的實驗中對上述問題做進一步討論?？傊?，調控MAPK 信號轉導通路干預“細胞因子風暴”是金線蓮防治ALI 的有效靶點之一，提示金線蓮藥物及其新型制劑的開發可能是一種新的治療策略。