染料木素磺酸鈉減輕慢性腦缺血大鼠神經細胞焦亡的研究

邢亞康，張麗梅，王愷迪，溫亞娟，黎 曉，3，帥 萍

（1. 贛南醫科大學基礎醫學院；2. 贛南醫科大學第一附屬醫院病理科；3.贛南醫科大學心腦血管疾病防治教育部重點實驗室，江西 贛州 341000）

高血壓、高脂血癥、糖尿病等多種因素容易引起動脈粥樣硬化造成動脈狹窄，其中頸動脈是連接心臟和大腦的供血要塞，提供了大約70%以上的腦血流。當頸動脈狹窄程度逐漸加重（超過50%時），患者可出現頭昏、頭痛、失眠、記憶力減退等慢性腦缺血癥狀，甚至引發腦卒中或血管性癡呆［1］。慢性腦缺血是由不同原因引起的腦血管變窄或大腦供血不足，導致特定腦區域因血流量低于生理需求量而引起的區域性、波動性腦功能障礙，臨床癥狀多緩慢而持久，對患者造成較大的心理和精神困擾［2］。隨著老齡化社會的到來，慢性腦缺血對中老年人健康的危害已日趨嚴峻。據中國慢性病前瞻性研究分析顯示，我國約有1/3 成年人存在不同程度的頸動脈粥樣硬化斑塊，臨床研究統計顯示，60 歲以上的老年人有2/3 出現慢性腦供血不足，80 歲以上老年人中有80%存在慢性腦供血不足癥狀［3］。因此，迫切需要尋找有效的干預手段來治療慢性腦缺血。

目前，慢性腦缺血的藥物治療多以抗血小板聚集、抗凝、改善循環及腦代謝等為主，雖然療效肯定，但常伴有不確定的不良反應。中醫中藥治療慢性腦缺血以多層性、多途徑、多靶點辨證施治為患者廣泛接受，目前已發現治療的有效藥物達幾十種，多以活血化瘀、益氣通絡為主，但治療過程或藥劑煎制過程也有諸多不便。有研究表明，一些植物單體分子結構明確且來源可靠，也具有良好的多靶標活性，且不良反應小或無［4-5］。研究發現，有些植物單體對慢性腦缺血的療效甚至可與西藥相媲美［6-7］。因此，進一步探究植物單體的藥理作用具有廣闊的應用前景。既往研究證明，大豆、咖啡豆等富含的異黃酮類多酚化合物——染料木素是一種具有廣泛臨床應用價值的植物雌激素單體［8］。染料木素在預防和治療腎病、心血管疾病、骨質疏松、神經系統疾病等方面具有較好的活性［9］。然而，染料木素水溶性不強，生物利用度較低，因而限制了其應用。因此，本課題組參照索志榮等［10］的方法，在保留染料木素活性結構的同時，對其進行磺化成功賦予其強水溶性特征，合成了染料木素磺酸鈉（Genistein-3′-sodium sulfonate， GSS）。結合文獻報道及我們前期研究顯示，GSS 具有多靶點效應［11-12］，并能夠通過抑制細胞炎癥發揮對缺血再灌注損傷大鼠的腦保護作用［13-14］，也可通過降低細胞凋亡水平保護慢性腦缺血模型大鼠大腦皮層神經元［15］，但GSS對慢性腦缺血的保護機制還遠未闡明。細胞焦亡是一種新的程序性細胞死亡方式，其產生的炎癥反應與許多神經系統疾病的發生和發展有著緊密聯系。核苷酸結合寡聚結構域樣受體家族pyrin 結構域蛋白3（Nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor pyrin domain containing-3，NLRP3）是一種多蛋白復合物，其激活是細胞焦亡的核心環節。在中樞神經系統炎性因子中NLRP3 數量最多且也在眾多神經系統疾病中扮演重要角色。WANG S Q等［16］研究發現染料木素可激活GPER 啟動細胞信號轉導，抑制NLRP3 等炎癥因子的釋放并在缺血再灌注小鼠中發揮神經保護作用［16］。因此猜想，作為染料木素的衍生物——GSS也可能通過降低慢性腦缺血誘導的神經細胞焦亡，進而減輕大鼠腦內炎癥損傷發揮腦保護作用，本研究對此進行了初步探討。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 本研究使用SPF 級SD 雄性大鼠（8 周齡），購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［動物使用許可證號：SYXK（贛）20180004，動物合格證號：430727210100264331］。本研究涉及的動物實驗已通過贛南醫科大學醫學倫理委員會審核［倫理審查文件編號：NO.2021204］。整個實驗過程參照《動物保護和使用指南》執行，實驗動物使用準則和福利措施符合歐盟指令（2010/63/EU）。

1.1.2 藥物和試劑 染料木素磺酸鈉（分子式C15H10O8SNa，分子量：372.28）純度≥99%，由上海宸香醫藥科技有限公司合成。 NLRP3 抗體（ab214185）、GSDMD 抗體（ab219800）、IL-1β 抗體（ab9787）均購自Abcam 公司；Caspase-1 P20 抗體（WL03450）購自Wanleibio公司；β-actin抗體（MA5-15739）、Tubulin抗體（MA5-11732）、GAPDH抗體（MA1-16757）均購自Invitrogen 公司；山羊抗兔IgG（31460）、山羊抗鼠IgG（31430）等二抗均購自Thermo fisher 公司；PVDF 膜（ISEQ00010）購自Merck 公司；蛋白定量試劑盒（A33972）購自Thermo fisher 公司；增強化學發光試劑（GK10008）購自GLPBIO 公司； ELISA 試劑盒（RLB00）購自R＆D System 公司；逆轉錄試劑盒（C28025）購自Invitrogen公司；蛋白電泳轉膜系統購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與給藥 采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組（Sham）、模型組（2-VO+Vehicle）和治療組（2-VO+GSS），采取腹腔注射給藥，每天1 次，連續給藥8 周，GSS 注射劑量為1 mg·kg-1，假手術組和模型組則注射等體積的生理鹽水。

1.2.2 慢性腦缺血大鼠模型制備 參照 SARTI C等［17］改良后的雙側頸總動脈結扎（Bilateral carotid artery ligation， 2-VO）方法，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉［0.4～0.5 mL·（100 g）-1］進行麻醉，于頸部正中線作一長約2 cm 的切口，隨后逐層分離皮下結締組織，充分暴露右側頸三角區，用玻璃分針仔細分離右側頸總動脈，注意避免牽拉和損傷伴行的迷走神經，用4#手術線于近心端和遠心端分別對右側頸總動脈進行2 次結扎；1 周后，采用相同方法處理左側頸總動脈，假手術組僅暴露雙側頸總動脈但不結扎。手術全程控制室溫在23～25 ℃，相對濕度保持在50%～60%，術中、術后大鼠均安置在溫控墊上直至大鼠完全蘇醒，置于籠中自由進食。第1 次結扎術后次日開始注射藥物至腹腔，持續8周。

1.2.3 ELISA 實驗方法 給藥8 周，大鼠麻醉后腹腔靜脈取血，注意避免溶血。于4 ℃下以1 000 ×g離心20 min，小心收集上層血清。嚴格按照試劑盒操作說明，進行加樣、孵育、洗滌、顯色等步驟操作，于450 nm 波長檢測吸光度值，并對應標準曲線讀出相應值進行統計分析。

1.2.4 Real time-PCR（RT-PCR）方法 在取材期間，從每只大鼠大腦皮層組織中另取10～20 mg 制成組織勻漿，全程于冰上完成。勻漿中繼續加入10×Trizol，待組織充分裂解后加入1/5體積的氯仿，振蕩15 s，樣品靜置2～3 min 后在4 ℃下以12 000 ×g 離心12 min，吸取上清至另一離心管中，再按1/2 的體積加入異丙醇，將混合液振蕩后靜置于-20 ℃一段時間，再次在4 ℃下12 000 ×g 離心10 min，棄掉上清液，用含有75%乙醇的DEPC 水洗滌一次，懸浮沉淀后再次4 ℃下7 500 ×g 離心5 min 棄上清，真空干燥10 min，加入約20 μL 的RNase Free 溶解RNA 沉淀，定量至500 ng·mL-1。隨后進行逆轉錄實驗和實時定量PCR 實驗。qPCR 反應體系：cDNA 1 μL、2×All-in-OneTMqPCR Mix 10 μL、All-in-OneTMqPCR Primer 2 μL（終濃度0.2 μM）、加超純水至20 μL。PCR 反應條件：93 ℃預變性10 min，進行40 個循環，每個循環包括：93 ℃變性10 s，65 ℃退火20 s，75 ℃延伸15 s。引物序列參見表1。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot（WB）方法 取大腦皮層組織加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液充分裂解后，在組織勻漿機中研磨，然后4 ℃下12 000 ×g離心15 min，取上清，采用BCA 試劑盒進行蛋白定量，取20 μg總蛋白加入上樣緩沖液于100 ℃金屬浴中煮沸5 min，冰上放置5 min，開始SDS/PAGE 凝膠電泳實驗。在冰冷環境中將膠上的蛋白電轉移至PVDF 膜，轉膜結束后進行封閉，封閉結束后于4 ℃一抗孵育過夜，TBST洗凈一抗后于室溫二抗孵育1 h，最后使用化學發光成像系統顯影后對條帶進行灰度定量分析。

1.2.6 統計學處理 數據使用Graphpad Prism 8.0.1 軟件進行分析。結果以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way Anova），2組間比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 GSS對模型組大鼠IL-1β表達的影響 ELISA檢測大鼠血清中IL-1β 的含量，結果如圖1A 所示，與假手術組比較，模型組大鼠外周血清中IL-1β 的含量顯著升高（P=0.042 9）；與模型組比較，治療組大鼠外周血清中IL-1β 的含量有所下降，但差異無統計學意義（P=0.073 3）。采用RT-PCR 和WB 方法檢測大鼠大腦皮層組織中IL-1β 的mRNA 及蛋白表達水平，結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠大腦皮層IL-1β的mRNA表達水平明顯升高（P=0.025 5），蛋白表達水平也顯著升高（P＜0.000 1）；與模型組比較，治療組大鼠大腦皮層IL-1β 的mRNA 表達水平及蛋白表達水平均顯著下降，且差異有統計學意義（P=0.020 0、P＜0.000 1）（圖1B、圖1C）。表明GSS可以通過降低大鼠腦內局部炎癥水平發揮對神經細胞的保護作用。

圖1 GSS降低慢性腦缺血大鼠血清、大腦皮層組織中IL-1β的表達水平

2.2 GSS 對缺血誘導細胞焦亡的影響 采用RT-PCR及WB技術進一步檢測了各組大鼠大腦皮層組織中NLRP3、GSDMD和Caspase-1 P20的mRNA及蛋白表達水平。與假手術組比較，模型組大鼠大腦皮層中NLRP3、GSDMD和Caspase-1 P20 的mRNA 水平（P=0.044 3、P=0.022 9、P＜0.000 1）及蛋白表達水平（P=0.000 3、P=0.000 7、P=0.074 1）均升高，與模型組比較，治療組腦皮層中NLRP3、GSDMD 和Caspase-1 P20 的mRNA 水平（P=0.001 2、P=0.004 4、P=0.005 8）及蛋白表達水平（P=0.008 4、P=0.026 8、P=0.038 5）均降低（圖2），提示GSS 可以有效減輕慢性腦缺血誘導的神經細胞焦亡。

圖2 GSS對慢性腦缺血大鼠大腦皮層神經細胞焦亡的抑制作用

3 討論

慢性腦缺血通常發病隱匿，容易被患者忽視，當其發展為血管性癡呆時為時已晚。因此，合理預防至關重要。研究發現，大豆及葛根等食材富含的染料木素可發揮多種植物雌激素樣作用［18］，并且，染料木素已作為國家中藥第1類預防和治療絕經婦女骨質疏松癥的原料藥（批件號2004L01547）。但由于染料木素難溶于水，限制了其生物利用度。GSS是染料木素進行磺化改造后獲取的強水溶性單體。本課題組前期研究證明，GSS 可通過激活G 蛋白耦聯雌激素受體抑制神經炎癥和興奮性毒性損傷［12］，也可通過抗炎癥、抗凋亡［14，18-19］等路徑對缺血再灌注或慢性腦缺血大鼠發揮良好的神經保護作用。本研究結果顯示，慢性腦缺血后大鼠外周血清中IL-1β 的含量和大腦皮層中IL-1β mRNA 及蛋白的表達水平均顯著升高，但GSS 對外周炎癥反應的抑制作用并不明顯，而對大腦局部炎癥的抑制作用顯著。文獻［20］顯示，細胞焦亡與炎癥反應關系密切。IL-1β 的釋放依賴于細胞焦亡執行蛋白gasdermin D（GSDMD），表現為質膜破裂、細胞腫脹和染色質凝集，隨后引起細胞因子和免疫因子的大量釋放，引發過度的炎癥和免疫反應。GSDMD 介導的細胞膜上孔洞形成引起的細胞焦亡是程序性細胞死亡的一種形式，也是一種促炎癥的調節性壞死方式。先前認為，細胞焦亡主要由NLRP3 炎癥小體介導，隨著研究的深入發現，GSDMD 蛋白尤其是Caspase-1裂解的GSDMD 所介導的細胞膜孔形成才是細胞焦亡的關鍵特征［21］。另有研究［22］表明，小膠質細胞的炎性活化在缺血缺氧性腦損傷（Hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）的發生發展中扮演著關鍵角色。TAN L L 等［23］認為，NLRP-3/GSDMD 通路在HIBD 中參與了小膠質細胞焦亡過程并起到了重要的調控作用，該通路激活將導致小膠質細胞的炎性活化，通過減弱小膠質細胞焦亡這一過程，可減輕小膠質細胞活化分泌炎癥因子而引發的周圍炎癥程度，從而減輕HIBD 后早期和持續的腦損傷程度。本課題組成員在腦缺血再灌注損傷大鼠模型中也發現，GSS可以通過調控小膠質細胞極化，減輕大鼠腦內炎癥損傷程度［12-13］，提示GSS 可能通過減少小膠質細胞焦亡而降低大鼠腦內炎癥水平發揮腦保護作用。本研究進一步觀察了慢性腦缺血大鼠神經細胞的焦亡水平，結果發現，慢性腦缺血后，大鼠大腦皮層中NLRP3、GSDMD 和Caspase-1 P20 的mRNA 水平及蛋白表達水平均明顯升高，經GSS 治療后顯著下調。這些結果提示GSS可能通過減輕慢性腦缺血誘導的神經細胞焦亡，降低大腦局部炎癥水平，發揮腦保護作用。然而，目前還不清楚GSS通過何機制減輕慢性腦缺血誘導的神經細胞焦亡，以及尚未明確GSS是通過抑制小膠質細胞焦亡減輕炎癥損傷間接保護神經元為主，還是直接抑制神經元焦亡為主而發揮對慢性腦缺血大鼠的腦保護作用，這也是我們后續擬重點探討的內容。