極光激酶A通過促進巨噬細胞源性泡沫細胞形成參與動脈粥樣硬化發生發展

耿戈戈，張峰華，劉曉炎，樊雯婷，甘 滔

（1. 贛南醫科大學基礎醫學院；2. 贛南醫科大學康復學院，江西 贛州 341000）

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種常見的慢性病，涉及多種嚴重并發癥，是冠心病、腦梗死、外周血管病發病的主要因素。無論是在發達國家還是發展中國家，AS的發病率與死亡率都在逐年升高，嚴重危害人類健康。AS的發病受多種因素影響，包括高膽固醇血癥、高血壓、糖尿病和吸煙等［1］。AS的發病過程主要涉及血管內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞的一系列病變，多項研究表明，這些細胞參與了動脈粥樣硬化斑塊的形成，抑制其病變的發生是改善AS 的重要著手點［2-4］。在AS 發生過程中，血管內皮細胞可被氧化后的脂蛋白或其他炎癥分子激活，通過表達血小板選擇素（P-selection）、內皮細胞選擇素（E-selection）等分子進一步招募單核細胞［5］。被招募的單核細胞在進入血管內膜區域后受巨噬細胞集落刺激因子（Macrophage colony-stimulating factor， M-CSF）等細胞因子刺激分化為巨噬細胞，后者通過清道夫受體吸收氧化低密度脂蛋白進一步轉變成泡沫細胞。泡沫細胞在經歷頻繁的凋亡或壞死后逐步累積形成壞死核，其中包含膽固醇脂、膽固醇結晶以及細胞碎片，顯著增加了斑塊破裂的可能［6］。隨著斑塊的形成，血管中層的平滑肌細胞進入增殖狀態并遷移至內膜，隨后分泌主要由膠原構成的細胞外基質并形成保護性纖維帽。位于纖維帽中的平滑肌細胞能夠演變成巨細胞樣，通過吸收氧化脂蛋白發生泡沫化并隨之凋亡，加劇了斑塊內的壞死和炎癥水平，增加了斑塊的不穩定性［7］。目前臨床上針對AS 的治療方法主要是降脂治療，例如他汀類藥物、前蛋白轉化酶枯草溶菌素/Kexin9 型（PCSK9）抑制劑和非他汀類降脂藥物，以及一些抗炎藥物和血小板藥物的抑制性治療，但以上藥物都無法達到理想的治療效果，甚至還伴有較嚴重的不良反應［8-9］，因此尋找新的有效靶點勢在必行。

極光激酶A（Aurora kinase A， AurkA）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細胞的有絲分裂中起著重要作用，是細胞周期調控的關鍵基因。除了在有絲分裂中起作用，AurkA 過量表達時還可作為癌基因促進癌癥的發生和發展。研究發現，AurkA 通過調控增殖、上皮-間質轉化、轉移、凋亡以及癌癥干細胞的自我更新等促進癌癥發生［10-12］?，F有多種針對AurkA的特異性小分子抑制劑被開發并且進入臨床試驗階段，使AurkA 成為高度可行的治療靶點［13］。除癌癥之外，AurkA 參與糖尿病、主動脈夾層動脈瘤、肺動脈高壓等多種代謝相關疾病的調控［14-16］。在糖尿病模型小鼠中，抑制AurkA 可有效減少巨噬細胞在胰島組織中的浸潤并且顯著下調巨噬細胞中促炎分子IL-6 的分泌［17］，提示AurkA 可能調節促炎性巨噬細胞的生成。DING L 等［18］研究發現，AurkA 高表達于M1 型巨噬細胞，其酶活的抑制能有效遏制M1極化，阻礙自身免疫性腦炎等炎性疾病的發生。AurkA 作為抗壞死因子能夠特異性地促進M1 型巨噬細胞存活，破壞炎性/抗炎性巨噬細胞平衡［17］。同時，關于肺動脈高壓以及主動脈夾層動脈瘤等血管疾病的相關研究顯示，AurkA 能夠調控平滑肌細胞功能，包括增殖和遷移［15］。由此可見，AurkA 與巨噬細胞以及平滑肌細胞的功能調控密切相關?；诖?，我們猜測AurkA可能通過調控巨噬細胞、平滑肌細胞等多種細胞參與AS發生發展。因此，本研究通過動物模型和細胞實驗初步探究AurkA在動脈粥樣硬化發生發展中的潛在作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 C57BL/6J 小鼠（北京維通利華公司），IMDM 培養基（Gibco 公司），氧化低密度脂蛋白（廣州奕元生物技術有限公司），油紅染色液（Solarbio 公司），AurkA 抑制劑MLN8237 以及TCS7010（Selleck 公司），2-羥丙基-β-環糊精（Selleck公司），甘油三酯測試盒（南京建成生物工程研究所），Murine M-CSF（Peprotech 公司），Murine IFN-γ（Peprotech公司），Murine LPS（Sigma-Aldrich公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動脈粥樣硬化小鼠病灶區基因表達譜分析 從GEO 數據庫提取動脈粥樣硬化發病小鼠主動脈基因表達譜數據（GSE 19286），包括了動脈粥樣硬化發病小鼠主動脈樣本（Aorta_APOE-deficient with atherosclerosis_1 和Aorta_APOE-deficient with atherosclerosis_2）以及未發病對照小鼠主動脈樣本（Aorta_non-transgenic C57BL/6J control_1 和Aorta_non-transgenic C57BL/6J control_2）的基因表達數據，選擇特異性識別AurkA 的探針1424511_at和1440129_at，分析AurkA 表達。AurkA 在各類血液細胞中的表達譜數據來自Bloodspot 數據庫（https：//fobinf.com），選擇的數據集為Mouse Normal （RNA-Seq）。

1.2.2 動物模型構建 ⑴AurkA 表達驗證動物模型構建：選用8 周齡普通飼料喂養的C57BL/6J 健康雄性小鼠作為CC組（對照組），再選用8周齡C57BL/6J背景的ApoE-/-（Apolipoprotein E KO）健康雄性小鼠，隨機分為AN 組及AH 組。CC 組和AN 組喂養普通飼料，AH 組喂養21%脂肪、0.5%膽固醇的高脂飼料，每2 天更換1 次飼料，每周進行體重監控，共喂養16 周構建動脈粥樣硬化小鼠模型；⑵AurkA 抑制劑功能實驗動物模型構建：選用8 周齡C57BL/6J 背景的ApoE-/-健康雄性小鼠，隨機分為MC 組（MC 為溶劑處理的高脂喂養的ApoE-/-小鼠組）和M 組（AurkA 抑制劑MLN8237 處理的高脂喂養的ApoE-/-小鼠組），以同樣方法高脂喂食16 周構建動脈粥樣硬化小鼠模型，在建模第12 周開始M 組給予小鼠20 mg·kg-1MLN8237 灌胃，每周2 次，持續4 周，MC組給予小鼠同等體積溶劑（10% 2-羥丙基-β-環糊精和1%碳酸氫鈉）處理。

1.2.3 血脂測定 將全血室溫靜置30～60 min，有明顯的分層后，取血清直接測定，如超過線性范圍用生理鹽水稀釋后測定。按照血清總膽固醇（Total cholesterol，TC）檢測試劑盒、甘油三酯（Triglycerides，TG）檢測試劑盒以及低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）檢測試劑盒說明書指示，分別設置空白孔、標準孔、樣本孔?？瞻卓准尤?.5 μL蒸餾水，標準孔加入2.5 μL 校準品，樣本孔加入2.5 μL樣本液，每個孔中都加入250 μL的工作液，隨后振蕩孔板混勻，37 ℃孵育10 min，測定波長500 nm 處各孔吸光度。

1.2.4 油紅染色 ⑴小鼠主動脈大體油紅染色：稱取0.5 g 油紅加入100 mL 異丙醇中，過夜溶解后使用濾紙過濾直至無沉淀，將配制成的油紅原液按油紅∶超純水=3∶2 混合，配制成油紅工作液備用。將剝離完的主動脈放入4%多聚甲醛溶液中避光固定72 h，將固定好的主動脈放入超純水中漂洗10 min，再轉移至60%異丙醇中漂洗10 min 后轉至油紅工作液中染色60 min。將小鼠主動脈轉移到60%異丙醇中漂洗1 min，棄去舊液，加入新的異丙醇重復洗3次，最后將小鼠主動脈轉移到超純水中，染色完成；⑵主動脈根部油紅染色：將固定完畢的小鼠心臟組織依次放于15%、40%的蔗糖溶液內進行脫水，將脫好水的組織取出吸干表面水分，用鑷子輕輕將組織放入包埋臺進行包埋，待OCT（Optimal cutting temperature）將組織完全覆蓋后將包埋臺水平放于干冰上，快速冷凍直至OCT 變白變硬后再進行切片。將主動脈根部冰凍切片復溫并干燥10 min，4%多聚甲醛固定15 min 后清洗晾干，隨后加入油紅工作液避光染色20 min，染色結束后使用60%異丙醇對切片浸洗2 次，每次5 min，脫色至背景清晰，蒸餾水浸洗3次；蘇木素染色5 min，水洗3次后晾干并用甘油封片即可；⑶泡沫細胞油紅染色：收取BMDM接種于96 孔板培養，加入氧化低密度脂蛋白（Oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）誘導泡沫化，培養24 h后吸掉原培養液，PBS洗2次，加入油紅固定液，避光常溫30 min，然后棄液用ddH2O洗2次，加入60%異丙醇洗5 min，棄去異丙醇，加入油紅染液，搖晃避光染色30 min，棄去油紅染液，水洗2～5次，加入ORO buffer，浸泡1 min，棄液，加入ddH2O，覆蓋細胞，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time quantitative PCR，qPCR） 使用Trizol法提取總RNA，檢測RNA 濃度和純度后進行逆轉錄，所得cDNA 用于進行實時定量PCR實驗。吸取10 μL TB GreenⅡ、1 μL 上、下游引物、1 μL cDNA，用RNase free water補足到20 μL上機進行PCR反應，反應條件為：95 ℃預變性20 min，95 ℃變性10 min，61 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，共40個循環。以β-actin 作為內參基因，AurkA 引物序列：上游引物5′-CTGGATGCTGCAAACGGATAG-3′，下游引物5′-CGAAGGGAACAGTGGTCTTAACA-3′。β-actin 引物序列：上游引物5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3′，下游引物5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′。

1.2.6 HE 染色 先將主動脈根部切片，4%多聚甲醛固定15 min，蘇木素染色5 min，自來水沖洗干凈，85%、95%的酒精脫水5 min，伊紅染色5 min，依次放入無水乙醇Ⅰ 5 min→無水乙醇Ⅱ 3 min→無水乙醇Ⅲ 3 min→二甲苯Ⅰ3 min→二甲苯Ⅱ 3 min直至脫水透明，晾干，封片。

1.2.7 骨髓源性巨噬細胞（Bone marrow-derived macrophage，BMDM）培養 使用8 周齡C57BL/6J 健康雄性小鼠，斷頸處死，從股骨和脛骨中沖洗出骨髓細胞，經紅細胞裂解過濾后制備細胞懸液，加入12 μL M-CSF（終濃度為10 ng·mL-1）進行鋪板培養，72 h 后補加6 mL 培養液與6 μL M-CSF（終濃度為 10 ng·mL-1），再培養4 d刺激BMDM。

1.2.8 巨噬細胞泡沫化 BMDM 誘導成功后，收集細胞重新鋪板培養，分為對照組（Con）、建模組（ox-LDL）以及AurkA 抑制劑處理組（ox-LDL+TCS）。在2 組細胞中加入100 μg·mL-1ox-LDL 構建泡沫細胞模型，同時給予ox-LDL+TCS 組10 nM AurkA 抑制劑TCS7010處理，給予ox-LDL組等量溶劑處理，48 h后利用油紅染色檢測泡沫細胞的脂質累積情況。

1.2.9 流式細胞分析儀檢測 收集外周血細胞，用含2% FBS 的PBS 制成單細胞懸液，300 g 離心5 min，棄掉上清液，加入紅細胞裂解液，用10 mL 細胞染色Buffer 終止紅細胞裂解，300 g 離心5 min，棄掉上清，將細胞制成107·mL-1懸液，取100 μL加入相應熒光標記的抗體（100∶1 或200∶1），混勻后置于4 ℃，避光孵育20 min，洗滌后重懸細胞，用流式細胞儀進行檢測，并利用Flowjo軟件進行數據分析。

1.3 統計學處理 采用Prism 8.0 統計軟件對數據進行分析，各組數據均用均數±標準差表示，組間兩兩比較采用t檢驗，組間多重比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 動脈粥樣硬化斑塊病灶區AurkA 的表達 從GEO 數據庫中調取AS 造模小鼠病灶區基因芯片數據分析，與CC 組相比，AH 組動脈粥樣硬化斑塊病灶區AurkA 表達升高（圖1），提示AurkA 高表達與AS發病相關。

圖1 動脈粥樣硬化斑塊病灶區AurkA的表達

2.2 主動脈中的粥樣斑塊分布情況及血清TC、TG和LDL-C含量 主動脈大體油紅染色結果顯示AH 組主動脈中的粥樣斑塊分布明顯多于AN 對照組（P＜0.05）（圖2）；AH 組血清中TC、TG 和LDL-C高于AN 組和CC 組，AN 組血清中TC、LDL-C 高于CC 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。提示AS模型構建成功。

圖2 主動脈中的粥樣斑塊分布情況

圖3 小鼠血清TC、TG和LDL-C含量比較

2.3 小鼠肝臟、脾臟和主動脈組織AurkA mRNA表達 與AN組相比，AH組肝臟、脾臟和主動脈組織AurkA mRNA 增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 小鼠肝臟、脾臟和主動脈組織AurkA mRNA表達

2.4 AurkA 抑制劑對小鼠體重以及血清TC、TG、LDL-C 含量的影響 與MC 組相比，M 組小鼠體重及血清TC、TG、LDL-C 水平無明顯差異（P＞0.05）（圖5）。

圖5 AurkA抑制劑對小鼠體重以及血清TC、TG、LDL-C的影響

2.5 小鼠主動脈斑塊比較 2 組小鼠主動脈內壁斑塊總面積無明顯差異（圖6），與MC 組比較，M 組主動脈竇中斑塊面積及油紅面積減小，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖7）。

圖6 AurkA抑制劑對小鼠主動脈斑塊總面積的影響

圖7 AurkA抑制劑對小鼠主動脈根部斑塊面積的影響

2.6 AurkA 調控巨噬細胞源性泡沫細胞形成 流式細胞術分析結果顯示，AurkA抑制劑處理雖未改變外周血中髓性細胞占比，但能顯著下調外周血中泡沫細胞前體，即單核細胞的占比（P＜0.05）（圖8）。通過對各類血細胞中AurkA mRNA 分析發現，髓性細胞尤其是巨噬細胞中存在AurkA mRNA 的特異性高表達（圖9），BMDM 的泡沫細胞體外誘導實驗發現，相較于未處理的對照組，BMDM 經100 μg·mL-1的ox-LDL刺激后，大量累積脂質形成泡沫細胞（圖9）。加入AurkA酶活抑制劑處理后，細胞中脂滴累積程度相較造模組顯著降低（P＜0.05）（圖10）。

圖8 AurkA 抑制劑對動脈粥樣硬化小鼠外周血中髓系細胞占比的影響

圖9 不同血細胞AurkA mRNA的表達

圖10 AurkA對巨噬細胞源性泡沫細胞生成的影響

3 討論

動脈粥樣硬化是一種常見的慢性疾病，也是全球人口死亡的主要原因，其發病機制復雜，涉及多種細胞相互作用，近年來不斷有研究表明可以通過調控單種或多種細胞促進或抑制AS的發生發展，但適用于臨床轉化且易于靶向的靶點研究較少。

AurkA 作為調控細胞周期的關鍵分子，其表達或功能異常與疾病的發生息息相關。前期研究大多集中于AurkA 在癌癥發生發展中的作用，而對其是否參與非癌癥疾病的發生研究較少。近年來，AurkA 被發現與多種慢性炎癥以及代謝疾病的發生相關。在實驗性自身免疫性腦炎動物模型中，AurkA通過促進巨噬細胞的M1 極化提高炎癥水平促進疾病發展［18］；在胰島素模型小鼠中，抑制AurkA能夠顯著減少巨噬細胞在病灶區的浸潤、下調促炎因子IL-6水平并改善胰島素抵抗，從而緩解發?。?9］；同樣通過減少促炎因子表達水平，AurkA 抑制劑顯著減輕了滑膜炎癥從而緩解化膿性關節炎［19］。本研究首先通過基因芯片數據發現了AurkA 高表達于AS 斑塊病灶區，隨后通過動物模型驗證AurkA與AS發病的相關性。利用小分子抑制劑抑制AurkA 后發現，AS模型小鼠血脂水平不受影響，主動脈斑塊總面積無變化，但主動脈竇斑塊厚度顯著減少，斑塊中脂質累積明顯降低，同時AurkA被抑制后，外周血中的單核細胞數量減少，進而限制了斑塊中單核細胞的浸潤以及向巨噬細胞的轉化。斑塊中巨噬細胞的減少抑制了泡沫細胞的形成，同時細胞實驗發現抑制AurkA能夠減少巨噬細胞中的脂質累積從而限制巨噬細胞源性泡沫細胞的生成。因此，AurkA 通過抑制巨噬細胞源性泡沫細胞的生成，進而控制斑塊形成以及脂質堆積，改善動脈粥樣硬化。這一發現與前期研究相一致，提示了AurkA 與巨噬細胞功能調控緊密相關。此前AurkA 被發現通過激活AKT信號通路實現對PPARα 以及PGC1α 等脂質代謝基因的調控［20-21］；同時在巨噬細胞中抑制AurkA 活性可影響IκBα 磷酸化水平，抑制NF-κB 信號通路激活［18］，而后者對于泡沫細胞形成有顯著的促進作用［22］；另有研究［23］發現，在肺癌細胞中AurkA 可調控CXCL5的基因水平，而CXCL5同樣可以限制動脈粥樣硬化中巨噬細胞泡沫細胞的形成。因此，AurkA可能通過多通路多靶點調控巨噬細胞功能，影響其脂質代謝水平和炎癥水平，參與泡沫細胞形成。同時，我們還發現AurkA能夠影響外周血中的單核細胞水平。有研究［24］表明，在AS患者以及造模小鼠中都能觀察到髓系造血水平的增強，其中外周血中單核細胞數量增加對斑塊生成具有顯著促進作用。由此可見，抑制AurkA 功能不僅直接影響巨噬細胞向泡沫細胞轉化，同時還從源頭上減少侵入血管內膜的巨噬細胞數量，兩種機制共同作用抑制斑塊形成。

綜上所述，本研究通過動物模型和細胞實驗證明了AurkA 高表達與AS 相關，并且發現AurkA 通過調控巨噬細胞源性泡沫細胞生成參與AS發生發展。AurkA 作為蛋白激酶，其酶活可以被特異性靶向。目前已有多種針對AurkA的小分子抑制劑被開發并進入臨床試驗階段，包括本研究中所使用的MLN8237。因此，本研究為動脈粥樣硬化的臨床治療提供了一個高度可行的新靶標，也為相關藥物開發提供了新的思路和理論基礎。