肝細胞內Ca2+信號與肝臟再生和肝臟疾病的聯系

郝永樂，鄒仁哲，韓靜雯，陳 菲，唐建紅

（1. 贛南醫科大學基礎醫學院；2. 贛南醫科大學第一臨床醫學院；3. 贛南醫科大學康復學院；4. 贛南醫科大學贛州市實驗動物工程技術研究中心，江西 贛州 341000）

據統計，中國超過1/5 人口患有肝臟疾病，包括乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）和丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染、肝硬化、肝癌、非酒精性脂肪性肝?。∟onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）和酒精相關性肝病等［1］。有研究［2］報道，全世界每年約有200多萬人死于肝臟疾?。ǜ斡不?、病毒性肝炎和肝癌），占全世界死亡人數的4%，其中有60 萬～90 萬人死于肝癌。肝臟疾病主要的致病因素有病毒感染、脂肪積聚、膽汁淤積、藥物誘導和酒精濫用等。Ca2+在肝臟疾病中扮演著重要角色，參與多種肝臟生物學功能調節過程，包括解毒、營養代謝、膽汁分泌、肝內膽汁酸合成和肝臟再生等。正常的Ca2+調節對于維持肝細胞的正常功能和代謝至關重要。

Ca2+作為第二信使，在維持機體細胞穩態中起重要作用，參與調控肌肉收縮、神經元信號傳遞、激素分泌、受精和細胞生長等諸多細胞功能。細胞內Ca2+主要儲存在內質網，內質網也被稱為Ca2+庫，其Ca2+水平高于細胞質。靜息條件下，細胞外環境Ca2+水平是細胞質Ca2+水平的104倍［3］。細胞接收Ca2+信號主要來源于細胞外Ca2+內流和儲存在內質網或肌漿網的Ca2+流動。Ca2+進入細胞的方式根據其調節機制主要分為電壓門控通道（Voltage-gated calcium channel，VGCC）、受體門控通道（Receptor-operated channels，ROC）和Ca2+庫控制的Ca2+通道（Store-operated channels，SOC）。這3個通道具有不同的動力學特性，VGCC 和ROC 能在短時間內產生大量的Ca2+內流，而SOC 允許持續的低濃度Ca2+內流。SOC 在Ca2+濃度低水平時激活，在Ca2+濃度高水平時抑制。

Ca2+在肝臟疾病中發揮重要作用，Ca2+信號失調是急性、慢性肝病的標志。研究表明，細胞質Ca2+濃度增加會激活Ca2+依賴性轉錄因子和激酶，使肝細胞加速進入細胞周期，促進肝臟再生［4］。因此，研究不同肝臟疾病中的Ca2+信號改變有助于深入了解肝臟疾病的發病機制和病程發展，為肝臟疾病的治療提供可能的新方向。

1 Ca2+信號簡述

Ca2+信號系統由廣泛的分子信號構成，這些分子信號協同作用后驅動具有獨特空間和時間特性的Ca2+信號。細胞膜內外以及細胞質和細胞器之間的Ca2+濃度梯度的維持及動態調控主要依賴于位于細胞膜、內質網以及線粒體上的Ca2+通道的改變。

Ca2+可以通過VGCC、ROC 和SOC 方式進入細胞，通過細胞膜Ca2+轉運ATP 酶（Plasma membrane Ca2+-ATPase，PMCA）和Na+/Ca2+交換通道（Na+/Ca2+exchanger，NCX）從細胞質轉運到細胞外。Ca2+從細胞外進入細胞質的關鍵途徑之一是VGCC。VGCC在可興奮細胞發生動作電位時被激活，相關膜蛋白響應膜去極化而打開，并允許Ca2+沿其電化學梯度流入。它們將Ca2+傳導到細胞中，啟動許多生理過程，包括肌肉收縮、神經遞質分泌和基因轉錄等［5］。VGCC 有多種類型，根據其電壓敏感性可分為高壓激活通道和低壓激活通道。高壓激活Ca2+通道家族包括L 型（Cav1.1～Cav1.4）、P/Q 型（Cav2.1）、N 型（Cav2.2）和R 型（Cav2.3）通道，低壓激活通道包括3 種不同類型的T 型（Cav3.1～Cav3.3）Ca2+通道［6］。這些Ca2+通道分布在不同細胞的細胞膜上，并完成特定的生理功能。例如，Cav1.1 通道僅在骨骼肌中表達，它們對肌肉收縮至關重要，而Cav2.2 通道僅存在于神經元中，它們觸發神經遞質的釋放［6］。ROC 主要有N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-Daspartatereceptor，NMDAR）、煙堿型乙酰膽堿受體（Nicotinic acetylcholine receptors，nAChR）和經典瞬時受體電位通道（Transient receptor potential canonical，TRPC）［7］。谷氨酸作為配體可以激活NMDAR，NMDAR 通常存在于中樞神經系統中的神經元突觸后膜上，參與學習和記憶等功能［8］。nAChR 屬于乙酰膽堿受體，通常也稱離子型乙酰膽堿受體。這是一種非選擇性的陽離子通道，允許Ca2+、Na+和K+通過。nAChR 的激活可以介導3 種類型的細胞質Ca2+信號：⑴Ca2+直接通過nAChR 內流；⑵通過nAChR介導的去極化激活的電壓依賴性鈣通道間接引起Ca2+內流；⑶通過內質網蘭尼堿受體（Ryanodine receptor，RyR）和肌醇（1，4，5）-三磷酸受體（Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor，IP3Rs）引起的鈣誘導鈣釋放（由前兩種來源觸發）［9］。TRPC 中TRPC3 和TRPC6 通道是Ca2+滲透的非選擇性陽離子通道，參與許多生理過程［10］。通過細胞膜排出細胞內Ca2+的主要方式有PMCA 和NCX。PMCA 也被稱為質膜ATP 酶，是許多膜Ca2+運輸蛋白之一，對維持細胞內游離Ca2+的低濃度及其信號功能至關重要。細胞內Ca2+濃度升高時，PMCA 通過天冬氨酸磷酸化為Ca2+逆濃度梯度泵出細胞膜提供能量［11］。同樣，NCX 也是排出Ca2+主要通道，在生理條件下，NCX 利用電化學梯度介導3 個Na+進入細胞，1 個Ca2+排出細胞。在病理環境中，NCX 的反向模式占主導地位（即介導3 個Na+排出細胞，1 個Ca2+進入細胞），可顯著改變細胞內Ca2+穩態，在細胞或系統水平上導致許多Ca2+依賴事件發生［12］。細胞Ca2+信號幾乎調節機體生理的各個方面，每一個Ca2+信號的傳導都有一個復雜的傳導鏈，包括一系列感知細胞外信號的受體和Ca2+可滲透通道，這些細胞膜上的通道將Ca2+輸送到細胞內或從細胞內存儲釋放Ca2+，形成特定的Ca2+信號。

Ca2+信號傳入細胞后可以被內質網ATP 酶（Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）識別并將Ca2+泵入內質網腔。細胞受到刺激后，內質網上Ca2+通道蛋白（IP3R 和RyR）的Ca2+敏感性開始增強，排出過載的Ca2+［13］。內質網和線粒體是細胞內Ca2+儲存最多的兩個細胞器，內質網是細胞內最大的Ca2+庫。正常情況下，內質網可以通過多種Ca2+泵和Ca2+通道防止Ca2+耗盡或過載。細胞受到刺激時，內質網Ca2+增加，IP3R 對IP3 更加敏感，同時也導致RyR受到刺激，內質網將過多的Ca2+釋放到細胞質中，從內質網釋放的Ca2+可以通過電壓依賴性陰離子通道（Voltage-dependent anion-selective channel，VDAC）進入線粒體膜間隙［14］。

線粒體是細胞的能量站，也是細胞Ca2+信號傳遞樞紐。線粒體通過其外膜（Outer mitochondrial membrane，OMM）上的VDAC 和線粒體內膜（Inner mitochondrial membrane，IMM）上的線粒體鈣單向轉運體（Mitochondrial calcium uniporter，MCU）復合體攝取Ca2+，通過線粒體NCX（mNCX）排出Ca2+［13］。MCU復合體由兩個部分組成：MCU通道形成亞基和調節蛋白。MCU 通道形成亞基由MCU、MCUb 和EMRE 構成，其主要負責Ca2+滲透［15］。調節蛋白主要包含MICU1、MICU2 和MICU3，這些調節蛋白在細胞質Ca2+水平升高時促進Ca2+進入線粒體［15］。MCU復合體激活的條件是周圍Ca2+濃度高于細胞質峰值，位于內質網-線粒體接觸點（也稱為線粒體相關膜，Mitochondria-associated membranes，MAMs）處的MCU 復合體可被激活。MAMs 的主要功能是嚴格控制局部Ca2+濃度，Ca2+可以從內質網直接儲存到線粒體，而不增加細胞質Ca2+濃度［16］（圖1）。

2 肝臟再生中的Ca2+信號傳導

肝臟再生受到細胞因子、生長因子、激素和神經遞質等的調控，它們與肝細胞相互作用，有助于部分肝切除后的肝臟質量和功能恢復。旁分泌、自分泌和內分泌相互作用推動肝細胞進入細胞周期，并在肝臟再生組織中維持正常的分化功能。在調控信號通路時，一些Ca2+動員激動劑包括去胰島素、精氨酸加壓素、ATP、表皮生長因子和肝細胞生長因子有助于肝臟再生［17］。

胰島素通過影響細胞核Ca2+參與調控肝細胞增殖。胰島素除了具有顯著降血糖作用外，還具有促進有絲分裂作用，可以促進細胞增殖。胰島素誘導分離的大鼠肝細胞發生Ca2+振蕩，這些Ca2+信號依賴于磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）和IP3R 的激活［18］。胰島素通過胰島素受體起作用，胰島素受體是一種異四聚體受體酪氨酸激酶，由2 個具有配體結合活性的細胞外α 亞基和2 個具有酪氨酸激酶活性的跨膜β 亞基組成，在胰島素的刺激下胰島素受體由細胞膜轉移到核內［19］。胰島素與胰島素受體結合后蛋白酪氨酸激酶被激活，β 亞基內酪氨酸殘基發生磷酸化，導致磷脂酰肌醇3-激酶和PLC 配體蛋白的募集［20］。PLC 水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸，形成二?；视停―iacyl glycerol，DAG），激活蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）及IP3，促進Ca2+從細胞內Ca2+庫中釋放結合到細胞核上的IP3R 上，可能是胰島素對肝臟再生產生影響的作用機制［17］。

線粒體Ca2+通過抑制細胞凋亡調節肝細胞增殖，線粒體Ca2+通過調節Bax/Bcl-2 的比例，使肝細胞朝著抗凋亡的方向發展，從而加速肝切除術后肝臟恢復［21］。線粒體Ca2+還可以通過調節線粒體基質中ATP 的產生加速肝臟再生。此外，肝細胞生長因子是肝臟再生的重要刺激因子，在損傷組織中具有抗凋亡活性，并在細胞周期早期誘導細胞內Ca2+升高［22］。在肝細胞中，Bcl-2與凋亡受體結合后激活線粒體凋亡途徑［23］。BH3 相互作用域凋亡激動劑（Bid）的缺失導致內質網儲存Ca2+和細胞內Ca2+水平降低，影響了細胞周期蛋白D1和細胞周期蛋白E的表達，進而調節細胞周期進程［23］。此外，有研究［24］發現，MICU1敲除小鼠會出現線粒體Ca2+過載，進而誘導線粒體滲透性過渡孔（Mitochondrial permeability transition pore，mPTP）加速開放，導致肝臟再生失敗，細胞周期受損和組織損傷可以通過抑制mPTP來預防。綜上，線粒體Ca2+可以通過多種方式促進肝臟再生（圖2）。

圖2 胰島素通過影響細胞核鈣離子參與肝細胞再生

3 肝臟疾病中的Ca2+信號傳導

許多肝臟功能通過細胞內Ca2+調控，如能量代謝、膽汁分泌、線粒體生理、細胞再生和基因表達等［25］。因此，Ca2+信號的異常轉導也預示著肝細胞功能異常甚至肝臟疾病的發生（圖3）。

圖3 不同肝臟疾病中鈣離子信號紊亂示意圖

3.1 慢性病毒性肝炎 HBV 和HCV 中的Ca2+信號轉導及相關蛋白是近年來的研究熱點。HBV 和HCV 感染肝臟細胞后引起細胞膜通透性增加和儲存Ca2+的細胞器（如內質網和線粒體）膜通透性改變，導致細胞質Ca2+增加［26］。HBV 可以利用多種機制提高細胞質Ca2+水平，細胞質Ca2+的增加又能夠促進病毒復制［27］。HBV 介導的Ca2+升高主要依賴于HBV 編碼蛋白HBx。一方面，HBx 通過調控細胞膜、內質網和線粒體中包括鈣釋放激活Ca2+通道調節分子1、IP3R 和mPTP 在內的多個Ca2+通道的激活和表達，提高細胞質中Ca2+的水平［27］。另一方面，HBx 通過Ca2+信號依賴性的富含脯氨酸的酪氨酸激酶2/非受體酪氨酸激酶（Pyk2/Src）和黏著斑激酶途徑激活來促進HBV 復制［27］。CHAMI M 等［28］發現，HBx 能夠通過激活胱天蛋白酶3（Caspase-3）來抑制細胞膜上PMCA 的活性以避免Ca2+外流。Ca2+信號在病毒感染中起著重要作用，越來越多的證據表明，通過合適的藥物控制細胞內Ca2+或Ca2+通道是控制HBV復制的潛在策略［29］。

HCV 主要由3 個結構蛋白（核心蛋白、E1 蛋白和E2 蛋白）和7 個非結構蛋白（p7 蛋白、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B）構成。病毒NS3-4A 蛋白酶裂解線粒體抗病毒信號蛋白并使其與線粒體膜分離，這種作用有助于病毒從先天免疫反應中逃逸［30］。盡管HCV 蛋白合成、組裝折疊大多發生在內質網，但是核心蛋白和NS3-4A 主要定位于OMM。HCV 核心蛋白與線粒體功能密切相關，并通過增加活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和活性氮的產生導致肝細胞氧化應激［31］。HORNER S M 等［32］認為HCV 蛋白在MAMs 中積聚。SCHWER B 等［33］提出HCV 蛋白通過MAMs 中部分膜的短暫融合從內質網橫向擴散到線粒體。并且，HCV 復制會破壞正常內質網功能，誘發內質網應激，同時促進線粒體通過MCU 吸收Ca2+，導致ROS 升高。ROS 在細胞中累積過量時又反過來促進HCV 復制、mPTP 開放和肝細胞氧化應激［34］。

3.2 非酒精性脂肪性肝病 肝細胞內Ca2+濃度異常和細胞內慢性內質網應激是NAFLD 向非酒精性脂肪肝炎、胰島素抵抗、肝硬化、肝纖維化和肝細胞癌發展的核心［35］。肝細胞內發生脂肪變性后細胞內Ca2+穩態顯著改變。一方面，脂滴中存在的部分DAG 在細胞膜激活PKC 的異構體，即PKCε、PKCδ或PKCβ［36］。PKC 通過磷酸化OARI1（SOC 通道蛋白）抑制Ca2+進入內質網，內質網Ca2+濃度降低后導致內質網應激；另一方面，由于Ca2+轉運蛋白的表達減少及內質網膜中磷脂酰膽堿比磷脂酰乙醇胺的比例升高對內質網ATP 酶2b（SERCA2b）活性的抑制導致內質網Ca2+攝取減少［36］。肝細胞表達3 種IP3R，即IP3R1、IP3R2 和IP3R3。IP3R1 主要參與MAMs 上Ca2+轉移和內質網部分Ca2+釋放，IP3R2 是肝細胞中主要的Ca2+通道，參與細胞質Ca2+調節，IP3R3 具有獨特的Ca2+結合特性，在細胞質Ca2+濃度增加時保持開放狀態［37］。有研究［38-39］表明，肝細胞脂肪變性后，cAMP 和蛋白激酶A（PKA）介導的磷酸化激活IP3R1，導致內質網Ca2+部分釋放，IP3R2 受到損傷進而影響Ca2+信號的正常傳導。肝細胞內脂質積累通過多種途徑導致內質網Ca2+降低和線粒體及細胞質Ca2+升高。因此，抑制Ca2+從內質網傳導到線粒體這個途徑有助于治療NAFLD。

3.3 酒精性脂肪肝病 酒精性脂肪肝?。ˋlcoholic fatty liver disease，AFLD）是由長期和過量飲酒引起的，是酒精性肝病最常見和可逆的階段。長期和過量飲酒所導致的肝損傷，早期病理改變發生在線粒體中［40］。慢性乙醇攝入會導致線粒體功能障礙，包括mtDNA 和核糖體損傷、氧化磷酸化抑制和ROS生成增加［40］。游離Ca2+是調節線粒體內部功能的關鍵因素，并在多個水平上控制ATP 合成和ROS 產生。KING A L 等［41］發現，長期喂食乙醇的大鼠更容易發生肝臟線粒體Ca2+超負荷，線粒體Ca2+超負荷觸發mPTP 的開放，隨后可能增加ROS 的產生。其途徑可能是Ca2+從細胞質轉移到線粒體，增加線粒體膜通透性，降低線粒體膜電位，最終導致肝細胞損傷［42］。因此，維持細胞內Ca2+的平衡對于預防和治療AFLD 非常重要。減少酒精攝入和加強對Ca2+的調節可以減少脂肪聚集和肝細胞損傷，從而降低AFLD的發病風險和病程。

3.4 膽汁淤積 肝細胞的主要生理功能之一是分泌膽汁，各種轉運系統抑制、細胞骨架中毒、細胞內Ca2+穩態紊亂和膽汁成分反流等多種機制會引起肝細胞內膽汁淤積的發生。膽汁淤積可引起肝纖維化、膽汁性肝硬化和終末期肝病。在膽汁淤積性疾病的發病過程中Ca2+信號通路起著重要作用［43］。膽汁酸是膽汁的主要溶質，其在膽總管膽汁流量中起重要作用。膽汁酸對Ca2+有高親和力，可以與其形成膽汁酸-鈣復合體。膽汁酸可通過促進細胞攝取Ca2+和增加細胞內游離Ca2+影響細胞代謝，從而引起膽汁淤積［44］。細胞內Ca2+動員激動劑可以誘導短期的膽汁流動效應。胰高血糖素本身不是Ca2+的激動劑，但它能夠調節Ca2+動員激動劑（如抗利尿激素）對膽汁流動起作用。

IP3R 介導肝細胞和膽管細胞中Ca2+信號傳導，IP3R介導的膽管上皮Ca2+信號通路對正常膽汁分泌很重要。膽汁淤積發生時，IP3Rs 在膽管上皮中損傷IP3介導的Ca2+信號通路，這可能與膽汁淤積的病理生理相關［45］。同時，膽汁淤積會損害細胞內Ca2+通道蛋白的表達，并導致膽道上皮細胞的信號傳遞受阻［45］（圖4）。因此，調節肝細胞和膽管細胞Ca2+信號通路可能為治療膽汁淤積性疾病提供一種新的方法。

圖4 IP3R介導的鈣離子信號傳導圖

4 小結

Ca2+在肝臟再生和許多肝臟疾病發病過程中起著至關重要的作用。多種慢性肝病的特征是細胞質Ca2+信號的改變，其伴隨著內質網Ca2+的消耗、細胞核Ca2+以及線粒體Ca2+的改變。病毒感染和脂質積累都會導致內質網應激，促進線粒體吸收Ca2+。膽汁淤積可由多種原因導致，膽管細胞中IP3R介導的Ca2+信號通路不僅是導管分泌的一種途徑，并且對肝臟正常膽汁分泌非常重要。膽汁酸通過與Ca2+結合的方式促進細胞Ca2+攝取，導致游離Ca2+增加破壞細胞代謝，引起膽汁淤積。Ca2+影響肝臟再生則是通過多種途徑，細胞質Ca2+促進肝細胞進入增殖周期，線粒體Ca2+通過抑制細胞凋亡促進肝細胞增殖。肝臟疾病發展過程中，炎癥、氧化應激、脂肪積累等多種因素導致Ca2+信號傳導通路紊亂，進而影響細胞的生理功能。因為Ca2+信號在肝臟疾病發病過程中的重要作用，Ca2+通道的改變未來可能作為肝臟再生或肝臟疾病的診斷標志物。Ca2+拮抗劑可以緩解部分肝臟疾病，如NAFLD、肝纖維化和肝硬化等，但Ca2+拮抗劑對正常肝臟、肝臟再生和肝臟疾病患者的影響還需要進一步研究。