肝細胞癌雙硫死亡相關LncRNA預后模型的構建和驗證

方 霞，孫江云，袁豐華

（1. 贛南醫科大學基礎醫學院；2. 贛南醫科大學第一臨床醫學院，江西 贛州 341000）

肝癌是全球范圍內常見的癌癥，具有快速生長、易發生遠處轉移及高死亡率等特點，主要的病理類型為肝細胞癌［1］。目前，肝癌最主要的治療策略仍然是根治性切除［2］。由于肝細胞癌發病隱匿且進展迅速，多數患者在診斷時已為晚期，導致治療難度增加，且治療效果差［3］。盡管存在一些治療方法，如經導管動脈化療栓塞、射頻熱消融和靶向藥物（如索拉非尼），用于治療晚期且無法進行手術切除的肝細胞癌患者，但這些方法療效較差［4］。因此，迫切需要在現有治療方法的基礎上尋找更有效的治療靶點或方法，以提高肝細胞癌治療的療效并改善患者預后。

調節性細胞死亡是一種經過精確調控的正常細胞死亡過程，在維持組織穩態、免疫調節、抑制腫瘤發展中起重要作用［5-6］。然而，當細胞死亡調控失衡或異常時，可能會導致腫瘤形成。腫瘤細胞通過突變或異常表達凋亡調控因子（如p53）逃避細胞凋亡的觸發，導致腫瘤細胞無限增殖［7］。雙硫死亡是一種新發現的涉及多種代謝途徑的細胞死亡方式，它與已知的鐵死亡和銅死亡不同，是溶質載體家族7成員11（Solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）高表達的腫瘤細胞在葡萄糖饑餓環境下，細胞內的二硫化物含量異常增加，導致肌動蛋白細胞骨架中二硫鍵含量增加，進而引發肌動蛋白絲過度收縮，最終破壞細胞骨架結構并導致腫瘤細胞死亡的過程［8］。這種細胞死亡方式可能會成為靶向抑制腫瘤的新方法。

長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNAs，LncRNA）是指核苷酸分子大于200的RNA，不具備編碼功能，參與細胞的生長、分化、凋亡等生理和病理過程［9］。LncRNA 在腫瘤發生發展中也起著至關重要的作用。研究表明，LncRNA 在肝細胞癌中異常表達，通過與其他蛋白質或RNA 相互作用，影響腫瘤細胞增殖和死亡［10］。例如LncRNA HEPPAL 通過降低SLC7A11 表達促進肝細胞癌的鐵死亡［11］。目前，雙硫死亡相關的LncRNA 在肝細胞癌中的作用研究較少。本文利用生物信息學技術篩選與HCC 預后有關的雙硫死亡LncRNA，構建風險預后模型，并驗證該模型的可行性，為尋找與雙硫死亡相關的生物學靶點以及進一步研究雙硫死亡相關LncRNA 在HCC中的生物學作用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 數據獲取和處理 從癌癥基因組圖譜（The cancer genome atlas，TCGA）數據庫（https：//portal.gdc. cancer. gov/）獲取肝細胞癌數據集的RNA-seq和相關臨床信息數據，包括50 例正常樣本和374 例腫瘤樣本，提取HCC 的mRNA 和LncRNA 的表達數據，從相關文獻中得到10 個雙硫死亡相關基因包括：GYS1、NDUFS1、OXSM、LRPPRC、NDUFA11、NUBPL、NCKAP1、RPN1、SLC3A2、SLC7A11［8，12-13］，提取雙硫死亡基因的表達量，使用Limma 包進行共表達分析，篩選標準為Pearson 相關性系數|cor|＞0.4和P＜0.001。

1.2 構建并驗證HCC 雙硫死亡相關LncRNA 的預后模型 對TCGA 肝細胞癌數據集中的生存數據進行篩選，保留HCC 患者的年齡、性別、生存時間、生存狀態、腫瘤分級、分期，去除生存狀態和生存時間未知的樣本，并將表達數據與生存數據進行整合。使用Caret 包將HCC 數據按1∶1 隨機分為訓練集和驗證集，在訓練集中進行單因素Cox 回歸分析（P＜0.05），Glmnet 包［14］進行LASSO 回歸分析，用多因素Cox回歸構建模型。計算每個患者的風險值公式為：score=∑i=1n Coef i*xi，其中xi和Coef i分別代表每個樣品的LncRNA 表達量和風險系數。根據訓練集中風險值的中位數將OS 患者分成高、低風險組，并在驗證集和整個數據集中進行內部驗證，使用survminer 包［15］繪制生存曲線、受試者工作特征（ROC）曲線和C 指數（C-index）評估模型的可行性，scatterplot3d 包進行主成分分析（PCA），評估分組的效果。運用單因素和多因素Cox回歸評估風險評分是否為獨立預后因素。

1.3 高、低風險組基因的功能富集分析 使用clusterProfiler 包［16］對高、低風險組差異基因進行GO和KEGG 富集分析，并對高、低風險組的基因進行GSEA 功能富集分析，探究這些基因在HCC 中參與的生物學功能，過濾條件為P＜0.05。

1.4 高、低風險組基因的免疫細胞功能及免疫治療效果分析 使用GSVA 和GSEABase 包計算不同風險組之間免疫功能的差異，并從癌癥免疫圖譜（TCIA）數據庫（https：//tcia. at/home）獲得免疫治療評分數據，評估高、低風險組免疫治療效果。

2 結果

2.1 構建HCC 雙硫死亡相關LncRNA 的預后模型 提取TCGA 肝細胞癌RNA-Seq 數據中mRNA 和LncRNA，得到13 162 個LncRNA，利用Pearson 相關性分析13 162 個LncRNA 和10 個雙硫死亡相關基因，得到320 個雙硫死亡相關的LncRNA，未發現與OXSM相關的LncRNA（圖1A）。隨后，利用雙硫死亡LncRNA 構建預后模型，使用Caret 包將TCGA 肝細胞癌患者樣本劃分為訓練集和驗證集，對訓練集進行單因素Cox 回歸分析（P＜0.05）得到了40 個與HCC 預后相關的雙硫死亡LncRNA（圖1B），使用LASSO 回歸和多因素Cox 回歸分析進一步篩選，最終得到6 個雙硫死亡相關LncRNA（ELFN1-AS1、AL049840.2、MKLN1-AS、CYTOR、AL161645.1 和AC069307.1）（圖1C、圖1D）。

圖1 HCC雙硫死亡相關LncRNA的預后模型

2.2 評估HCC 雙硫死亡相關LncRNA 的預后模型效果 使用Kaplan-Meier（K-M）生存曲線分析高、低風險組的預后情況，結果顯示，在整個數據集、訓練集和驗證集中，總體生存期（Overall survival，OS）差異均有統計學意義（P＜0.05），高風險組的總生存期比低風險組的總生存期短（圖2A、圖2B、圖2C）。此外，對高、低風險組進行風險評估，風險評分分布圖（圖2D、圖2E、圖2F）和生存狀態散點圖（圖2G、圖2H、圖2I）顯示，隨著風險評分增加的患者死亡逐漸增加。 風險熱圖結果表明，ELFN1-AS1、AL049840.2、MKLN1-AS、CYTOR 在高風險組中高表達，而AL161645.1 和AC069307.1 在高風險組中低表達（圖2J、圖2K、圖2L）。

單變量和多變量Cox 回歸分析評估模型的臨床意義，結果顯示，風險評分和腫瘤分期是臨床獨立預后因素（P＜0.05）（圖3A、圖3B）。ROC 曲線結果顯示，風險評分在AUC 值上明顯優于其他臨床特征（圖3C）。在1 年、3 年和5 年的時間點上，風險評分的ROC 曲線下面積分別為0.745、0.709 和0.735（圖3D）。相比其他臨床因素，風險評分的C 指數值更高（圖3E）。此外，通過主成分分析結果表明，風險模型中LncRNA 雙硫死亡基因的表達具有更分散的分布特征（圖3F、圖3G、圖3H、圖3I），說明該模型中將患者分為高風險組和低風險組質量較好。

圖3 評估HCC雙硫死亡相關LncRNA預后模型臨床效果

2.3 高、低風險組基因的功能富集分析 對高、低風險組差異基因進行GO 和KEGG 富集分析，GO 富集分析顯示，生物學過程主要富集在外部封裝結構組織，細胞組分主要富集在含膠原的細胞外基質，分子功能主要富集在細胞外基質成分（圖4A），KEGG 主要富集在PI3K/AKT 信號通路（圖4B）。此外，對高、低風險組差異表達基因進行功能富集分析，發現高風險組主要富集在細胞外基質受體途徑（圖4C），而低風險組主要富集在藥物代謝細胞色素p450途徑（圖4D）。

2.4 高、低風險組基因的免疫細胞功能分析 通過GSEABase 包分析高、低風險組免疫功能之間的差異，結果顯示，高風險組抗原呈遞細胞共刺激（APC_CO_stimulation）、趨化因子受體（CCR）、主要組織相容性復合體Ⅰ類呈遞（MHC_class_Ⅰ）、副炎癥（Parainflammation）和輔助性T細胞2（Th2）的表達高于低風險組（圖5），高風險組的TIDE 評分高于低風險組（圖6）。

圖5 基因免疫細胞功能分析

圖6 TIDE評分比較

3 討論

肝細胞癌是一種常見的惡性腫瘤，具有快速生長、易發生遠處轉移及高死亡率等特點，嚴重威脅患者生命健康［17］，雖然很多學者不斷研究新的治療策略及藥物靶點，但因為晚期肝癌的治療限制性以及對靶向藥物的耐藥性，治療效果差，患者生存率較低。因此，研究肝細胞癌的發生發展機制及尋找HCC有效的治療靶點對于改善患者預后至關重要。

LncRNA 是一類核苷酸分子長度大于200 的非編碼RNA，參與調控多種細胞生物學過程，包括細胞增殖、凋亡及轉錄后水平的分化等［18］。在細胞增殖過程中，LncRNA 可以調節與細胞周期相關的基因表達，影響細胞的增殖能力；在細胞凋亡過程中，通過調節與凋亡相關基因家族（如Bcl-2 家族）的表達，可改變細胞對凋亡的敏感性；在轉錄后水平的分化過程中，LncRNA 還可通過影響mRNA 的剪切和修飾影響基因表達，進而影響其生物學功能［19］。

目前已有多項研究證明，LncRNA 參與調節腫瘤代謝及細胞信號通路影響多種腫瘤的發生發展［20-21］。LncRNA 在肝癌中表達異常，促進肝癌的惡性增殖及血管生成，且與細胞的鐵死亡及銅死亡密切相關［22-23］。雙硫死亡是一種與糖代謝、線粒體呼吸及能量代謝等多個代謝途徑相關的細胞死亡方式。有研究［24］表明，LRPPRC（Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein-1）作為一種參與雙硫死亡的基因，能通過調控能量代謝途徑影響線粒體自噬。LncRNASNHG17與LRPPRC相互作用，增強c-Myc 蛋白的表達，從而促進肝細胞癌的發展［25］。然而雙硫死亡相關LncRNA 在HCC 中作用研究尚少，具體作用機制尚不清楚。通過查閱文獻及應用共表達分析得到雙硫死亡相關LncRNA，并利用單因素Cox回歸、lasso回歸和多因素Cox 回歸構建了6 個雙硫死亡相關LncRNA 預后模型，包括ELFN1-AS1、AL049840.2、MKLN1-AS、CYTOR、AL161645.1 和AC069307.1。已有研究［26-27］表明，ELFN1-AS1 可促進結腸癌及視網膜細胞瘤的惡性進展。MKLN1-AS 在HCC 中高表達且與患者不良預后相關［28］，與本研究結果一致。CYTOR 可通過調節miR-125b-5p/KIAA1522 軸影響肝癌細胞的增殖、細胞周期和凋亡［29］。其中AL049840.2、AL161645.1 和AC069307.1 的作用尚未有研究報道。

隨后，為了驗證該模型的可行性，應用K-M 生存曲線分析得知模型中的高風險組總生存率低于低風險組，在1 年、3 年和5 年的風險評分的ROC 曲線下面積分別為0.745、0.709和0.735，這些值均大于0.65，表明該風險評分具有較高的預測準確性，主成分分析及C指數分析也證明該模型具有良好的預測價值。高風險組功能富集分析結果表明，雙硫死亡相關LncRNA 功能主要富集在與細胞外基質受體途徑有關，此途徑已證實在腫瘤細胞生長、侵襲、轉移和血管生成過程中起重要作用［30］。

在免疫功能方面，通過免疫功能差異分析發現高風險組中抗原呈遞細胞共刺激（APC_CO_stimulation）、趨化因子受體（CCR）、主要組織相容性復合體Ⅰ類呈遞（MHC_class_Ⅰ）、副炎癥和輔助性T細胞2（Th2）高表達，表明雙硫死亡相關LncRNA 可影響腫瘤免疫功能。并且，高風險組的TIDE 高于低風險組，表明高風險組免疫逃逸潛能大于低風險組，免疫治療效果更差。

雙硫死亡是一種新的細胞死亡方式，可能成為靶向治療腫瘤的新方法。LncRNA 通過多種形式影響腫瘤的發生發展。本文基于TCGA 數據庫構建的雙硫死亡相關LncRNA 預后模型具有良好預測性能，為HCC的臨床治療和研究提供新思路。