鈣敏感受體在血吸蟲病肝纖維化中的作用

張文娟，李珂云，馮嘉禾，林樂迎，熊 俊，秦靜茹，胡 衡，李珍妮，賀 喆，曹鎬祿

（1. 贛南醫科大學基礎醫學院；2. 贛南醫科大學心腦血管疾病防治教育部重點實驗室；3. 贛南醫科大學第一臨床醫學院，江西 贛州 341000）

肝纖維化是一種機體對各種原因引起的慢性肝損傷復雜的修復反應，主要特征是細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）沉積和肝星狀細胞（Hepatic stellate cells，HSCs）活化［1］。肝纖維化作為肝臟疾病的過渡階段，通常被認為是可逆的病理過程［2］。我國是全球肝病負擔最重的國家［3］。其中，日本血吸蟲感染是引發肝纖維化的常見原因之一。血吸蟲病肝臟纖維化是血吸蟲感染引起的肝臟特征性病理變化［4］。血吸蟲可溶性蟲卵抗原不斷刺激肝臟，形成蟲卵肉芽腫，從而導致嚴重的肝纖維化［5］。肝纖維化晚期患者出現循環功能障礙，影響患者的生活自理能力，甚至危及患者生命［6］。因此，深入研究血吸蟲病肝纖維化的發病機制至關重要。

鈣敏感受體（Calcium-sensing receptor，CaSR）是一種在細胞外環境中感知鈣離子的受體，主要促進急慢性炎癥，觸發細胞內多種信號通路［7］。研究表明CaSR參與高糖誘導的心肌細胞纖維化［8-9］。CaSR表達上調與糖尿病并發的肝纖維化相關，即Ca2+的增加可以促進HSC 增殖、纖維化和收縮，最終導致肝纖維化［10］。在血吸蟲病肝纖維化中尚未見CaSR作用的報道。本研究建立血吸蟲病肝纖維化模型，探究CaSR 在血吸蟲病肝纖維化中的作用，為血吸蟲病肝纖維化的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 BABL/c 小鼠32 只（SPF 級，雌性，6～8 周齡，18～20 g）購于湖北省疾病預防控制中心，飼養于本校實驗動物中心；日本血吸蟲陽性釘螺購于江蘇省南京市血吸蟲病防治所。Calhex231購于Sigma 公司；一抗α-SMA、Collagen-Ⅰ、GAPDH購于abcam公司；二抗購于Jackson公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 血吸蟲病肝纖維化模型制作 將小鼠隨機分為2組，未感染組和感染組，每組8只。先將血吸蟲陽性釘螺置于去氯水中（24～28 ℃，光照12 h）收集尾蚴。感染組小鼠經腹部皮膚感染（20±2）條尾蚴，未感染組小鼠給予生理鹽水，20 min后，所有小鼠于實驗動物中心飼養8 周。造模結束，麻醉后經頸椎脫臼法處死小鼠，取出肝組織備用。用同樣方法構建單純血吸蟲感染組和Calhex231（CaSR 抑制劑）干預的血吸蟲感染組小鼠模型（每組8 只）。其中單純血吸蟲感染組感染方式同上，Calhex231干預的血吸蟲感染組小鼠于血吸蟲感染當天腹腔給予Calhex231（1 mg·kg-1），每日1 次，直至造模結束（即感染后8周）。

1.2.2 HE 和Masson 染色 取肝組織，固定，經酒精梯度（75%、85%、90%、95%和100%）脫水、二甲苯透明后于包埋機中進行石蠟包埋。HE 染色即取蠟塊切片（4 μm），經二甲苯脫蠟、梯度酒精（100%、95%、90%、80%和70%）水化后，蘇木素染色10 min、伊紅染色1 min，封片觀察。Masson染色即蠟塊切片先脫蠟水化（步驟同HE 染色），再依次經Weigert 氏鐵蘇木素染色8 min，麗春紅染色5 min，蒸餾水漂洗數秒，Masson 復合液染色5 min，磷鉬酸分化5 min，苯胺藍染色5 min后封片觀察。

1.2.3 Western-blot 先用RIPA 法裂解0.12 g 肝組織，4 ℃、10 000 g離心15 min 收集上清液，BCA 法測定蛋白濃度。蛋白質（40 g）依次變性（95 ℃）、SDS-PAGE 凝膠電泳（濃縮膠80 V，20 min；分離膠120 V，50 min）、轉膜（200 mA，90 min）、室溫封閉（5%脫脂奶粉，4 h）、一抗（兔抗鼠α-SMA，Collagen-Ⅰ，1∶1 000）4 ℃孵育過夜、二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，ECL顯影，采用Image J軟件分析條帶。

1.2.4 肝組織中ALT/AST 含量測定 根據南京建成ALT/AST檢測試劑盒說明書操作［11］。

1.2.5 RT-qPCR Trizol法提取小鼠肝組織RNA。依據mona 試劑盒，將RNA 逆轉錄為cDNA，并以cDNA 為模板進行CaSR 基因擴增。以GAPDH 為內參，用2-△△CT法分析CaSR mRNA 的相對表達量。CaSR：上游引物5′-GAGCACATCCCTTCAACCAT-3′，下游引物 5′-GCTAGAGGAGGCGTAGCTCA-3′；GAPDH：上游引物5′-TGAAGGGTGGAGCCAAAAG-3′，下游引物5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。

1.2.6 免疫組織化學 同樣取肝組織切片，先經常規方法脫蠟水化，再依次經抗原修復（3% H2O2）15 min，封閉（3%BSA）30 min，一抗（兔抗鼠CaSR，1∶200）4 ℃孵育12 h，二抗（羊抗兔HRP）室溫孵育1 h，DAB 染色5 min，蘇木精復染細胞核后（染色后均用PBS沖洗3次，5 min/次）封片觀察。

1.2.7 天狼星紅和VG 染色 取肝組織，經4%多聚甲醛固定。天狼星紅染色即取肝臟切片，先經脫蠟水化，再依次經鐵-蘇木精染液染色15 min，自來水漂洗10 min，天狼星紅染液染色20 min，5%冰醋酸漂洗3 min 后封片觀察。VG染色即經相同方法脫蠟水化肝臟切片，先經鐵-蘇木精染液染色15 min，自來水沖洗10 min，再經VG 染液染色5 min，95%酒精快速分化數秒后封片觀察。

1.3 統計學處理 數據使用SPSS 19.0或GraphPad Prism 9.0軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 小鼠肝組織病理學變化 HE 染色結果顯示，未感染組小鼠肝細胞排列整齊、完整，未見明顯變性、壞死和炎性細胞浸潤，而感染組小鼠肝組織中出現大量蟲卵且蟲卵周圍有膠原纖維沉積，形成蟲卵肉芽腫，肉芽腫周圍可見大量炎性細胞浸潤且有局部壞死。Masson 染色結果顯示，未感染組小鼠肝細胞排列整齊，肝小葉結構完整，且肝組織未見明顯膠原沉積，感染組小鼠肝組織大量破壞，出現大量假小葉且周圍有大量膠原纖維化增生（圖1）。

圖1 小鼠肝組織病理學變化

2.2 小鼠肝組織α-SMA 和Collagen-Ⅰ蛋白表達比較 Western blot 結果顯示，與未感染組相比，感染組小鼠肝組織α-SMA 和Collagen-Ⅰ蛋白表達增加，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖2）。

圖2 小鼠肝組織α-SMA和Collagen-Ⅰ蛋白表達

2.3 小鼠ALT、AST含量比較 與未感染組相比，感染組小鼠肝組織中ALT 和AST 含量明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 小鼠ALT、AST含量比較

2.4 小鼠肝組織CaSR表達比較 RT-qPCR和免疫組織化學檢測小鼠肝組織中CaSR 的表達，結果顯示，與未感染組比較，感染組小鼠肝組織中CaSR的表達明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖4）。

圖4 小鼠肝組織CaSR表達比較

2.5 CaSR 抑制劑對小鼠肝纖維化的影響 天狼星紅染色將膠原纖維染成紅色。天狼星紅染色結果顯示，感染組小鼠肝組織結構已嚴重破壞，且出現大量膠原纖維沉積；CaSR抑制劑干預組小鼠肝組織結構出現破壞，但尚有部分組織為完整結構。VG染色將膠原纖維染成粉紅色。VG 染色結果顯示，感染組小鼠肝組織已呈現出大量粉紅色，而CaSR抑制劑干預組小鼠肝組織呈現出部分粉紅色，尚有部分完整組織結構。提示Calhex231 可減輕血吸蟲病小鼠的肝纖維化（圖5）。

圖5 CaSR抑制劑對小鼠肝纖維化的影響

3 討論

肝纖維化形成的核心是HSCs 的活化［12］。HSCs受到刺激，產生ECM。ECM 過度沉積，形成肝臟纖維化［13］。與酒精性肝病、非酒精性肝病和病毒性肝病相比較，血吸蟲病肝纖維化的發病機制不同［14］。血吸蟲病肝纖維化存在HSCs 的活化過程，但并不破壞肝細胞，是以蟲卵為中心形成慢性肝臟肉芽腫的過程［15］。

α-SMA為HSCs活化的指標，Collagen-Ⅰ是ECM沉積的主要膠原蛋白，ALT 和AST 為肝臟損傷的指標［16-17］。本研究發現，血吸蟲病肝纖維化中小鼠的α-SMA 和Collagen-Ⅰ表達增加，且ALT/AST 含量增加，提示血吸蟲病肝纖維化小鼠肝功能破壞嚴重，與QI X 等［18］報道相一致。且在糖尿病并發大鼠纖維化的肝組織及細胞中α-SMA 和Collagen-Ⅰ表達升高，ALT、AST 含量也顯著升高［10］。CaSR 作為Ca2+受體，參與急慢性炎癥［19］。本研究發現，小鼠肝組織中CaSR表達升高，且CaSR抑制劑Calhex231可減輕血吸蟲病肝纖維化。在糖尿病并發的大鼠纖維化模型［10］及急性心肌梗死大鼠模型［20］中也有相似報道。然而LEE P C 等［21］研究發現，與非肝硬化患者相比，肝硬化患者CaSR 表達降低，可能是CaSR在不同疾病中有相反作用。而血吸蟲病患者中CaSR 的表達情況有待于后續驗證。YUAN H 等［22］發現，CaSR促進心肌纖維化細胞分泌TGF-β1，TGF-β1作為促纖維化因子，通過結合心肌纖維化細胞表面的TGF-βRⅡ，活化胞內段的絲氨酸/蘇氨酸激酶，進一步活化TGF-βRⅠ；TGF-βRⅠ活化后，通過絲氨酸/蘇氨酸激酶，依次使Smad2、Smad3磷酸化。磷酸化的Smad2、Smad3 與Smad4 結合，形成三聚體，一起轉移至細胞核內，與轉錄因子結合，啟動纖維化轉錄。CaSR 在血吸蟲病肝纖維化中的作用機制尚需采用CaSR缺陷型血吸蟲病小鼠模型進行探究。

綜上所述，CaSR可能參與小鼠血吸蟲病肝纖維化進程，CaSR有望成為血吸蟲病肝纖維化的潛在治療靶點，該靶點的發現為血吸蟲病肝纖維化的治療提供新的實驗依據。