“補腎填精”中藥復方改善腦癱大鼠運動發育落后的機制研究

李 烽，朱振興，李志欣，邵銀進，朱惠芳

（1. 贛州市人民醫院康復醫學科；2. 贛南醫科大學第一附屬醫院兒童醫學中心 兒童醫學研究所，江西 贛州 341000）

腦癱是腦部神經受損所致的持續性中樞性運動和姿勢發育障礙，是引起兒童運動功能障礙的常見病因之一，也是導致兒童終身殘疾的常見原因。一直以來，傳統中醫藥在改善腦癱預后方面具有獨特的優勢，其中以針灸和按摩為主要手段［1］，而中藥治療的報道相對較少，原因可能是難以對本病形成統一的辨證標準。然而，中藥是把握整體以辨證施治，能標本兼顧，因此從理論上來說對腦癱也應具有良好的治療效果。據中醫古代醫籍，可將腦癱歸屬于中醫“五遲”“五軟”的范疇。歷代中醫學家認為先天稟賦不足、胎元失養為腦癱的主要病因。而腎主骨，為先天之本，作強之官，從中醫辨證思維來看，腦癱患兒的病本在腎?，F代醫學認為，腦癱主要是胎兒在母體孕期宮內感染或缺氧缺血導致的神經元受損甚至死亡，是腦損傷的最直接后果［2］。其中自噬是調節神經元死亡的重要通路［3］。

磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）是一種由催化亞基和調節亞基構成的異源二聚體復合物，同時具有胞內磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，在傳導細胞內外信號、調控細胞生長、分化和凋亡中發揮重要作用。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B 又被稱為AKT，是PI3K 下游重要的效應分子之一。當PI3K激活后，可促進AKT發生磷酸化，并進一步對下游靶蛋白進行磷酸化。其中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）是PI3K/AKT 下游的關鍵靶點蛋白。mTOR 是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇激酶相關激酶蛋白質家族成員，廣泛參與基因轉錄、蛋白質翻譯、核糖體合成等生物過程，在細胞對缺氧和炎癥的應激反應（如誘導細胞自噬和細胞存活）中發揮了極為重要的作用。有研究［4］表明，在脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）誘導的幼年腦癱小鼠模型中，可通過mTOR 信號通路依賴的途徑誘導炎癥介質（如IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α）釋放，并導致神經元損傷；而mTOR 信號通路的抑制可降低由缺氧導致的神經損傷［5］。自噬作為調節細胞內蛋白和受損細胞器降解和循環再利用的過程，在應對胞內壓力（如代謝應激和氧化損傷）時維持細胞穩態、衰老、免疫及神經退行性疾病等多種生理病理過程發揮重要作用；雷帕霉素誘導的細胞自噬可通過mTOR依賴途徑發揮神經保護作用［6-7］。有研究［8-9］表明，mTOR 信號通路的抑制可改善幼年小鼠腦癱模型的神經炎癥和神經元死亡。由此可見，PI3K/AKT/mTOR 信號通路介導的炎癥反應和細胞自噬在腦癱的形成過程中具有重要作用。

本研究通過腹腔注射細菌LPS聯合缺氧的方法建立幼年大鼠腦癱模型，以模擬由于宮內感染及缺氧導致的幼兒腦癱。在模型鼠中評價“補腎填精”中藥復方對大鼠腦癱所致運動功能障礙的改善情況，并對相關的分子機制進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級性成熟的2～2.5 月齡Wistar 大鼠由贛南醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：SYXK（贛）2023-0004。其中雄性大鼠10 只、雌性大鼠20 只（210～220 g）。子代大鼠由性成熟雄性和雌性大鼠按1∶2數量的性別比例合籠交配獲得。所有大鼠均飼養于SPF 級動物房中。醫學實驗動物處理遵循實驗動物管理和使用規定。

1.2 藥物與試劑 “補腎益精”藥方組成：熟地（6 g）、山藥（6 g）、山茱萸（6 g）、太子參（6 g）、炒白術（6 g）、黃精（6 g）、遠志（6 g）、節菖蒲（6 g）、龜甲（6 g）、鱉甲（6 g）、甘草（6 g）。全部藥材同批次購自贛州市醫藥公司，由贛州市人民醫院中藥房制劑室制備。LPS購自美國Sigma 公司。兔抗大鼠PI3K、 mTOR、磷酸化mTOR（Ser2448）、AKT、磷酸化AKT（Ser473）、LC3、p62、GAPDH 等多克隆抗體均購自Proteintech公司。酶聯免疫吸附試劑盒TNF-α、IL-1β 和IL-6購自Elabscience 公司。IL-4 和IL-10 酶聯免疫吸附試劑盒購自上海江萊生物有限公司。

1.3 分組與方法

1.3.1 幼年腦癱大鼠動物模型的建立 將生育期SPF 級Wistar 大鼠以雄性10 只、雌性20 只合籠，于每日早晨8 時對雌鼠進行陰栓檢查，發現陰栓則記錄為妊娠第0 d。孕鼠單獨飼養，隨機選取15 只作為模型組，5 只為對照組。模型組在妊娠第16 d腹腔注射LPS 450 μg·kg-1，12 h 后將孕鼠置于缺氧環境下（92%氮氣+8%氧氣）處理2 h［10］。對照組不做缺氧處理，腹腔注射同等劑量生理鹽水。飼養環境溫度為22～24 ℃，濕度為40%～50%。

1.3.2 行為學評估及模型鼠篩選 模型組孕鼠和對照組孕鼠產仔后得到幼鼠，將9 日齡的幼鼠進行運動行為學測試及評分，測試項目包括隨意運動、姿勢、肌力、肌張力和不自主動作。同時出現以上5 項功能異常篩選為腦癱大鼠。從對照組孕鼠產下的子代中隨機挑選獲得正常幼鼠。

1.3.3 實驗分組 將所得模型幼鼠隨機選取20 只，分為2 組：腦癱治療組（A1）和腦癱對照組（A2）；正常幼鼠隨機選取20 只，分為2 組：正常治療組（B1）和正常對照組（B2）。另取10 只正常幼鼠不做任何處理，作為空白對照組（C）。

1.4 藥物干預及效果評價 根據中藥劑的臨床用量，結合人體與大鼠體表面積的比例，折算出大鼠的等效給藥劑量，按1 g·（25 mL）-1ddH2O 的質量體積比配制免煎顆粒藥。通過灌胃給予腦癱治療組和正常治療組“補腎填精”中藥復方水劑，給藥劑量為5 mL·kg-1。腦癱對照組和正常對照組灌服等劑量生理鹽水。每日1 次，連續灌服15 d。分別于給藥后第5 d、第10 d 和第15 d 對大鼠運動能力（包括懸吊試驗和斜坡試驗）進行測定。

1.5 ELISA 檢測 動物試驗結束后，大鼠眼眶采血，于37 ℃靜止放置1 h 后取上層血清進行ELISA試驗。整個操作過程嚴格按照試劑盒的操作說明進行［11］，采用雙抗夾心的方法分別檢測外周血中促炎因子和抗炎因子的表達水平。

1.6 免疫印跡 大腦組織預冷PBS 沖洗，眼科剪剪碎，加入RIPA 裂解液，經超聲裂解后提取蛋白，BCA 法測蛋白濃度，上樣，電泳1.5 h，轉膜1 h，室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，PBST 洗膜，二抗孵育1 h，PBST洗膜，采用化學發光法顯影曝光。

1.7 統計學處理 數據采用SPSS 23.0 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，不同時間點的測量值采用重復測量方差分析方法進行處理，組間比較若存在統計學意義再采用LSD 檢驗進行比較。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 腦癱模型大鼠的建模與篩選 腹腔注射細菌脂多糖LPS 并對孕鼠作做一步的缺氧處理，模擬孕鼠宮內感染合并宮內缺氧的情況（圖1），建立腦癱幼鼠模型。觀察各組孕鼠處理后的活動及進食情況，均基本正常。分娩情況為：模型組孕鼠（15 只）分娩時間為20～21 d，娩出存活乳鼠50 只，外觀青紫，狀態較萎靡，平均體重（6.68±0.48） g，次日死亡6只，剩余44只；對照組孕鼠5只分娩時間為21～22 d，娩出乳鼠36只，外觀皮膚粉紅色，可正常吮乳，平均體重為（7.56±0.62） g。待幼鼠達到9 日齡，進行神經行為學檢測，主要包括隨意運動、姿勢、肌力、肌張力和不自主動作的評估。以正常幼鼠建立篩選標準（表1）。對各項行為學進行正態檢驗，均符合正態分布，以單側95%CI界定為正常值，＞-x+1.96×S或＜-x-1.96×S為異常，以此為標準篩選出腦癱模型幼鼠。對模型組44 只9 日齡幼鼠進行以上5個行為學項目的測試，得到腦癱幼鼠42只。

表1 腦癱大鼠模型篩選標準±s

表1 腦癱大鼠模型篩選標準±s

篩選標準隨意運動/s姿勢/分肌力/s肌張力/分不自主動作/分正常幼鼠3.26±0.18 4.00±0.00 118.46±16.36 0.00±0.00 0.00±0.00腦癱幼鼠＞3.86＜4.00＜68.82＞0.00＞0.00

圖1 腦癱模型幼鼠建模示意圖

2.2 “補腎填精”中藥復方改善腦癱大鼠的運動功能 懸吊試驗結果顯示，與空白對照組相比，腦癱對照組的懸吊時間明顯縮短（P＜0.001）；與腦癱對照組相比，腦癱治療組懸吊時間明顯延長（P＜0.001），說明“補腎填精”中藥復方能有效增強腦癱大鼠的上肢力量。而正常治療組與正常對照組相比，懸吊時間差異無統計學意義（P=0.064）（表2），說明藥物的處理對于正常的大鼠不會帶來明顯的運動功能影響。

表2 大鼠各個時間點懸吊試驗結果比較/s±s

表2 大鼠各個時間點懸吊試驗結果比較/s±s

注：A1：腦癱治療組；A2：腦癱對照組；B1：正常治療組；B2：正常對照組；C：空白對照組。A1與A2比較，①P＜0.001；A2與C比較，②P＜0.001。

組別A1 A2 B1 B2 C FP n 10 10 10 10 10 F組間=3 701.45，F時間=437.55，F組間×時間=28.26 P組間＜0.001，P時間＜0.001，P組間×時間＜0.001時間點第5 d 24.64±2.84①8.65±2.61②56.86±7.48 52.68±11.64 58.40±8.96第10 d 32.83±3.41①9.61±1.48②60.32±6.65 64.62±8.48 66.57±10.21第15 d 44.73±4.72①9.21±0.86②68.46±4.92 70.78±8.41 74.40±5.83

斜坡實驗結果顯示，與空白對照組相比，腦癱對照組轉頭時間明顯延長，差異有統計學意義（P＜0.001）；與腦癱對照組相比，腦癱治療組轉頭時間明顯縮短，差異有統計學意義（P＜0.001），說明該復方能顯著改善腦癱大鼠的運動功能。而正常治療組與正常對照組相比，轉頭時間差異無統計學意義（P=0.863）（表3），說明藥物的處理對于正常的大鼠不會帶來明顯的運動功能影響。

表3 大鼠各個時間點斜坡試驗結果比較/s±s

表3 大鼠各個時間點斜坡試驗結果比較/s±s

注：A1：腦癱治療組；A2：腦癱對照組；B1：正常治療組；B2：正常對照組；C：空白對照組。A1與A2比較，①P＜0.001；A2與C比較，②P＜0.001。

組別A1 A2 B1 B2 C FP n 10 10 10 10 10 F組間=77.27，F時間=43.73，F組間×時間=31.18 P組間＜0.001，P時間＜0.001，P組間×時間＜0.001時間點第5 d 6.58±1.22①14.42±1.28②3.11±0.72 3.32±0.54 3.21±0.63第10 d 5.36±0.74①16.43±2.66②2.93±0.48 3.02±0.43 2.8±0.32第15 d 4.42±0.32①15.82±1.69②2.43±0.52 2.85±0.67 2.14±0.54

2.3 “補腎填精”中藥復方對大鼠體重的影響 為進一步評價“補腎填精”中藥復方在動物體內的安全性，對各組大鼠的體重進行監測，正常治療組與空白對照組及正常對照組相比，體重無明顯差異（P＞0.05），說明了藥物的安全性。腦癱治療組與空白對照組相比，體重明顯減輕（P＜0.001），與腦癱對照組相比體重明顯增加（P=0.031）（圖2），說明該中藥復方能改善大鼠的整體機能，促進生長發育。

圖2 大鼠體重曲線圖

2.4 “補腎填精”中藥復方抑制炎癥反應 與腦癱對照組相比，腦癱治療組外周血中促炎因子TNF-α和IL-1β 顯著下降（P＜0.001），但對IL-6 的水平影響不大（P＞0.05），而抗炎因子IL-4 和IL-10 顯著升高（P＜0.001）（圖3）。說明“補腎填精”中藥復方能改善腦癱大鼠炎癥反應。

圖3 “補腎填精”中藥復方對腦癱大鼠炎癥因子的影響

2.5 “補腎填精”中藥復方抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路介導的神經細胞自噬 通過WB方法檢測各組大鼠神經組織中PI3K/AKT/mTOR 信號通路相關蛋白表達水平發現，與腦癱對照組相比，腦癱治療組PI3K 表達增加，磷酸化AKT 和mTOR 表達增加，LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值降低，自噬相關蛋白p62 表達增加（P＜0.01）（圖4），說明“補腎填精”中藥復方能激活腦癱大鼠中PI3K/AKT/mTOR 信號通路，并抑制神經細胞發生自噬。

3 討論

腦癱是導致兒童終身殘疾的最常見原因。根據流行病學調查結果發現，大約每500 名新生兒中約有1 名受腦癱的影響［12］，近年來發病率呈逐年上升的趨勢，給社會和家庭帶來沉重的負擔。早期發現并干預是公認的提高腦癱救治率的關鍵環節。目前西醫學治療措施主要是針對性的功能訓練［13］。在國內，以針灸和推拿為代表的中醫治療策略在腦癱的治療中取得了顯著成效。研究發現，超低頻經顱磁刺激結合針刺治療可有效改善患兒的粗大和精細運動，且小兒推拿在改善痙攣性腦癱患兒的肌力、肌張力、粗大和精細運動，肢體運動能力等方面具有較為顯著的療效［14-15］。相對于針灸和推拿的局部干預，中藥治療從整體出發，辨證施治、標本兼顧，具有其獨特的優勢。但關于中藥用于治療腦癱患兒的報道相對較少，根據一項關于“中藥治療小兒腦性癱瘓”的文獻歸納總結研究發現，用于治療腦癱患兒明確有效的方劑主要包括六味地黃湯、四君子湯、補陽活血湯、補腎地黃湯、地黃飲子、加味六黃湯以及其他自擬方劑［16］。其中涉及的療法包括中藥熏蒸［17］、中藥水療［18］、中藥內服、中藥蠟療［19］、中藥內服聯合藥浴、中藥穴位貼敷以及中藥熏炙，其中中藥熏蒸的使用頻率最高，內服的相對較少。

“補腎填精”中藥復方選自曹霞等［20］的《賈六金辨治五遲五軟經驗總結》，該文總結了此方在腦癱患兒中的療效，然而病例數有限，未能形成系統的臨床研究。經查閱國內外文獻發現，不管是臨床研究還是動物實驗，均未查閱到關于“補腎填精”中藥復方治療腦癱兒的報道。然而在其他疾病中，“補腎填精”中藥復方在臨床上應用廣泛，涵蓋了中醫辨證中“腎精虧虛”的多數疾病，如卵巢早衰、卵泡發育不良、男性少弱精子、子宮內膜薄等癥［21-22］；此外，對神經系統疾病，如阿爾茨海默病、抑郁癥也有一定的臨床效果［23-24］。據查閱中醫古代醫籍，未見關于“腦癱”的記載，但將病癥的描述與現代醫學進行比較，腦癱可與中醫的“五遲”“五軟”相對應。從中醫辨證思維來看，腦癱患兒的病本在腎，因此通過采用傳統中醫藥的“補腎填精”思路，通過建立腦癱幼年大鼠模型，評價“補腎地黃丸合歸脾湯加減”療法在體內對腦癱大鼠神經運動能力的治療作用具有一定的實踐依據。

本研究中采用的“補腎填精”中藥復方，熟地、山藥、山茱萸三藥相配，“三補”為君藥，補益腎中氣血陰陽；太子參、炒白術健脾補虛，滋化脾胃；黃精補氣養陰、健脾、潤肺、益腎之功，使五臟調和、肌肉充盛、骨髓堅強；遠志、石菖蒲具有化痰開竅、健腦益智之功；龜甲、鱉甲常相須為用，龜甲具有滋陰潛陽、益腎健骨、養血補心之功；甘草調和諸藥。從中醫藥理論上來說，本藥方可對癥于腦癱的“五遲”“五軟”，能夠陰陽調和、強健體格、健腦益氣。本研究結果也證實了“補腎填精”中藥復方能有效增強腦癱大鼠的上肢力量和顯著縮短腦癱大鼠的反應時間，整體上改善腦癱大鼠的運動能力，具有一定的臨床研究價值。

研究發現，神經細胞的死亡與腦癱密切相關，其中mTOR信號通路被證實與腦癱的發生相關［8，25］。本研究結果發現，與對照組相比，“補腎填精”中藥復方能顯著促進腦癱大鼠PI3K的表達，并增強磷酸化AKT 和mTOR 的水平，促進下游AKT/mTOR 信號通路的激活；且明顯下調自噬相關微管關聯蛋白LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值，促進自噬相關蛋白p62 的表達，抑制自噬的發生。說明“補腎填精”中藥復方激活了腦癱大鼠神經元PI3K/AKT/mTOR 信號通路，并由此抑制神經細胞自噬，這可能是該中藥復方改善腦癱大鼠的運動能力的機制之一。在后續的研究中，需要對“補腎填精”中藥復方相關的分子機制進行更深入地證實。在臨床上也可開展相應的臨床治療試驗，真實評價該復方在臨床上改善腦癱患兒運動能力的療效。