臍帶間充質干細胞治療椎間盤退變研究進展

張學良，冉 兵，鐘瑞丹，葉軍明

（1. 贛南醫科大學第一臨床醫學院；2. 贛南醫科大學第一附屬醫院疼痛科；3. 贛南醫科大學，江西 贛州 341000）

腰痛是世界范圍內導致殘疾的主要原因，給世界各國造成了沉重的社會經濟負擔，其預防和治療成為全球公共衛生計劃的重要挑戰［1-2］。大約80%的人在一生中的某個階段會受到椎間盤退變和隨之而來的腰痛的影響［3］。目前，椎間盤（Intervertebral disc，IVD）退變機制尚不明確，吸煙、糖尿病、感染、遺傳異常、非生理性機械應力及衰老等可導致髓核（Nucleus pulposus，NP）細胞中線粒體的結構和功能異常，引起IVD內合成代謝與分解代謝不平衡，微環境破壞，表現為IVD內Ⅱ型膠原、蛋白多糖等細胞外基質含量下降，NP細胞數量減少及基質金屬蛋白酶含量增加，最終導致IVD退變［4］。

IVD 由中心凝膠樣的NP、外圍的纖維環（Annular fibrosus，AF）及上下軟骨終板組成，是椎體間的連接部分，對脊柱力學傳導和腰椎結構的維持至關重要。髓核內包含髓核細胞，Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖等細胞外基質，其作用主要為平衡椎體終板壓力和應力。纖維環富含Ⅰ型膠原蛋白和AF 細胞，在脊柱負荷時抵抗來自髓核的橫向張力。終板細胞是嵌入在透明軟骨基質中的軟骨細胞，是椎間盤與椎體的接合部，也是椎間盤營養、代謝的渠道。正常的椎間盤可傳遞和分散脊柱各方向的應力，維持椎間隙高度、減緩脊椎退變［5-8］。

近年來研究發現，間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）在特定條件下可以分化為軟骨細胞樣細胞和髓核細胞樣細胞，移植MSCs 可增加NP細胞數量和細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）含量，從而改善IVD 含水量和高度、延緩IVD 退變［9-10］。目前常用于研究治療IVD 退變的MSC 包括骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）、脂肪間充質干細胞（Adipose mesenchymal stem cells，AMSCs）和臍帶間充質干細胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）。有證據表明BMSCs、AMSCs和UCMSCs均能夠分化為髓核樣細胞（Nucleus pulposus cells，NPCs），改善IVD含水量和高度，延緩IVD 退變［9，11-12］，然而與BMSCs和AMSCs相比，UCMSCs具有更低免疫原性［13］，更適合同種異體應用。此外，UCMSCs 還具有來源廣泛、獲取無痛、容易收集、存儲和運輸、倫理道德爭議少等優點［14］。有研究［15-16］發現，UCMSCs 源性外泌體具有與UCMSCs 相似的功能，不受IVD 惡劣微環境影響，且具有免疫原性低、無致組織骨化或鈣化、無致瘤作用等。本文就臍帶間充質干細胞及其外泌體在椎間盤退化的修復及再生中的作用進行綜述，以期更好地指導臨床研究。

1 UCMSCs概況

1.1 UCMSCs 來源及分離培養 UCMSCs 是一類存在于臍帶（Umbilical cord，UC）組織，具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞。UC 兩端分別連著胎兒和胎盤，在妊娠期間連續不斷為胎兒供應氧氣和營養物質，由一條臍靜脈、兩條臍動脈、臍帶血管周圍透明黏液樣結締組織（即華爾通氏膠）和最外層羊膜組成［17］。UCMSCs 的分離培養方法較多，尚無統一的標準方法［18］。外植體法和酶消化法是常用于提取UCMSCs 的方法［19］。外植體法：新鮮臍帶剝離臍帶動靜脈后，剪成1 mm3左右的碎塊，平鋪于培養皿上，加入含有10%胎牛血清和1%抗生素的低糖Dulbecco改良鷹培養基（L-DMEM），于37 ℃、5%CO2培養箱中培養2 周左右，收集P0 代細胞。酶消化法：使用膠原酶或胰酶消化去除臍帶血管的組織，過濾收集UCMSCs，并于T75 培養瓶中培養［16］。研究表明，外植體法和酶消化法都能有效分離提取UCMSCs，酶消化法能在短時間內從人臍帶組織中獲得大量的UCMSCs，而外植體法有更高的細胞產量。外植體組織釋放的旁分泌因子能夠促進細胞增殖，使其細胞產量豐富［20-21］。

1.2 UCMSCs 生物學特性 UCMSCs 因具有自我更新能力、多向分化潛力、低免疫原性、免疫調節及歸巢能力等特點，被廣泛用于干細胞組織工程研究［22］。研究發現，從健康產婦分娩后華爾通氏膠中提取的UCMSCs 自我更新能力強，體外培養可傳至20 代［23］。UCMSCs 在特定條件下可分化為NPCs。PEREZ-CRUET M 等［9］使用髓核分化培養基將UCMSCs 體外誘導分化為NPCs，然后用PKH26 染料標記分化后的NPCs，并將其移植到兔退變的椎間盤中，8 周后進行IVD 組織病理學、免疫細胞化學和q-PCR 分析，結果表明，UCMSCs 在分化培養基中能夠分化為NPCs，移植后能在退化椎間盤中表達髓核細胞特異基因和蛋白質。DABROWSKI F A 等［24］通過混合淋巴細胞反應（Mixed lymphocyte response，MLR），發現UCMSCs在同種異體移植模型中具有很強地抑制淋巴細胞增殖的潛力。CORSELLO T 等［25］研究發現，UCMSCs 能夠抑制MLR 中T 細胞增殖，但在MLR 中加入UCMSCs 表達的CD276/B7-H3 抗體后，其免疫調節能力消失，這一結果表明UCMSCs具有免疫調節和免疫耐受的特性。另有研究［26］發現，UCMSCs 具有歸巢能力，能夠遷移至效應位點，分泌趨化因子和細胞因子等有助于維持組織穩態和組織修復的蛋白分子，該過程受到信號分子、氧氣和機械信號的嚴格梯度控制。UCMSCs較強的遷移和歸巢特性是修復受損組織的重要機制之一，其遷移和歸巢能力與其表達的整合素α4和巨噬細胞炎癥蛋白1β有關［27］。

UCMSCs 表達多種特異性細胞表面標志物，除表達MSCs 標志物CD105、CD90 和CD73 外，還表達黏附分子標志物CD54、CD13、CD29和CD44，低表達或不表達CD31、CD14、CD34、CD45 和其他造血干細胞相關表面抗原。這符合國際細胞治療學會的間充質和組織干細胞委員會提出的人類間充質干細胞的最低標準［28］。UCMSCs不表達參與T淋巴細胞活化的免疫應答相關抗原，如：CD80、CD86、CD40、CD40L和主要組織相容性復合物Ⅱ類抗原HLA-DR［13，19］，這可能是其具有低免疫原性特點的原因。

1.3 UCMSCs治療IVD退變的作用機制 UCMSCs治療IVD 退變的機制尚不明確，通過多方面作用參與調節IVD 退變。體內外研究發現，MSCs可以通過以下幾種方式發揮再生作用［29］：①分化成髓核樣細胞；②激活椎間盤內源性細胞；③產生抗炎作用。另外，EKRAM S等［10］研究發現，UCMSCs及其分化后的軟骨祖細胞移植入椎間盤后，能夠遷移、歸巢、分散和整合到退化椎間盤中，能在低氧、高滲及營養匱乏的椎間盤環境中存活并修復受損椎間盤。移植MSC 減緩IVD 退化的機制包括通過分化為髓核樣細胞直接增加細胞數量和調控髓核微環境，改善髓核代謝，從而增加細胞外基質產生。QI L 等［30］使用UCMSCs條件培養基培養治療經高糖損傷的髓核間充質干細胞（Nucleus pulposus mesenchymal stem cells，NPMSCs）后，通過流式細胞儀測細胞凋亡，qPCR、蛋白印跡和免疫組化等檢測基因及蛋白表達情況，結果發現，UCMSCs 條件培養基能增加Bcl-2及減少Bax的表達，調節細胞凋亡和有絲分裂，從而保護NPMSCs 免受高糖的損傷。ZHANG B 等［31］研究發現，UCMSCs 外泌體通過激活ERK1/2 和p38 促進細胞增殖并防止氧化應激誘導的體外細胞凋亡。上述研究表明了UCMSCs及其外泌體通過多方面參與IVD退變的修復及再生。

2 UCMSCs治療IVD退變

2.1 動物實驗 近年來研究表明，移植UCMSCs可有效治療IVD 退變。ZHANG Y 等［32］用轉染綠色熒光蛋白基因的腺相關病毒載體（AAV2-EGFP）標記UCMSCs，并移植到犬退變的椎間盤中，分別在0、4、8、12 和24 周使用X 線和MRI 測量椎間盤高度和灰度值，并于24 周后行脊柱生物力學、組織學和基因表達分析；另外，在20周時取移植熒光標記UCMSCs的犬椎間盤，使用免疫組化檢測和熒光顯微鏡觀察UCMSCs移植后存活情況。結果表明，UCMSCs移植后能夠維持退變IVD 屈伸和左右旋轉的運動范圍，改善退變IVD 椎間盤高度和T2 加權像信號強度。同時，UMSCs 移植后可促進聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的椎間盤基質形成，且首次證明了UCMSCs 移植可以在犬退行性IVD 中存活20 周。此外，王彥強等［33］將UCMSCs 移植到兔退變的椎間盤中，分別于術前、術后4、8和12周進行X線、MRI和蛋白多糖的檢測，發現UCMSCs移植組椎間盤高度指數、MRI T2加權像信號強度及蛋白多糖含量均較退變組有所改善。綜上所述，移植UCMSCs 對IVD 退變有一定的修復和再生作用，但IVD 內高滲、低氧、酸性增加及增加的炎癥因子［34-35］使移植后的干細胞無法保質保量地在IVD 內存活。研究發現，髓核祖細胞或髓核細胞可以在較差的IVD 微環境中存活［36］。另外，PENG B G 等［37］認為，通過基因編輯，使其能夠適應IVD 較差的微環境或許是一種令細胞在椎間盤內長期存活的有效方法。

因此，在單純移植UCMSCs 治療IVD 退變的基礎上，有研究者對UCMSCs 進行基因改造或在體外條件下使用定向分化培養基將UCMSCs誘導分化為軟骨樣細胞或髓核樣細胞后再移植到退變IVD 中，以探索UCMSCs分化后的細胞對退化椎間盤的再生修復作用。KHALID S 等［38］將3 種細胞分別移植至大鼠IVD 退變模型中，2 周后進行病理學和免疫組織學分析，比較SOX-9 和SIX-1 轉錄因子轉染的UCMSCs、未轉染UCMSCs 分化的軟骨祖細胞和UCMSCs修復退變椎間盤的作用，結果表明，用Sox-9和Six-1 轉染的UCMSCs 表現出更好的歸巢、整合和分化成脊索細胞的能力，更佳的椎間盤修復作用。另外，PEREZ-CRUET M 等［9］使用分化培養基培養UCMSCs，使其分化為NPCs，然后用PKH26 染料分別標記UCMSCs、UCMSCs 分化后的NPCs，并將其移植到兔退化IVD 模型中，8 周后進行IVD 影像學、組織病理學、免疫細胞化學和qPCR 分析，結果發現，PKH26 標記的細胞定位于移植的宿主髓核區域，移植的UCMSCs 和NPCs 都在兔IVD 中存活，UCMSCs局限于移植部位，NPCs更加分散并整合到宿主髓核中；與UCMSC 移植組的IVD 相比，NPCs 組中的軟骨基因SOX9、ACAN、COL2和NP 基因FOXF1、KRT19、PAX6、CA12和COMP表達顯著上調，且移植NPCs組IVD 結構和細胞完整性均得到改善。另外，該研究首次證明了UCMSCs體外分化的髓核樣細胞移植到兔退變IVD 中具有功能活性，并顯示出修復和再生退變椎間盤的潛力。綜上所述，無論移植UCMSCs或其分化后的細胞對退變的椎間盤都有一定的修復和再生潛力，移植UCMSCs 分化后的細胞治療效果優于移植UCMSCs。然而，移植UCMSCs 分化后的細胞可能面臨注射部位細胞泄露［39］及無法承受椎間盤較高的機械負荷等問題。

研究發現，單純性移植干細胞后細胞在椎間盤內將承受較高的機械負荷，可能對細胞的生存能力或功能有害，將干細胞載入生物材料支架可能是一種提高干細胞植入后長期存活和有效分化的方法［40］。韓磊等［41］將膠原修飾改性聚乳酸-羥基乙酸/磷酸三鈣［Poly（lactic-co-glycolic acid）/tricalcium phosphate， PLGA/TCP］人工支架復合UCMSCs 移植入兔椎間盤退變模型中，于術后2、4、8、12周進行兔椎間盤影像學評估，術后12周進行組織病理學評估，結果發現，PLGA/TCP 人工支架聯合UCMSCs 組椎間盤高度指數及Ⅱ型膠原含量顯著高于退變組，該結果表明PLGA/TCP 人工支架聯合UCMSCs 能有效促進退變椎間盤修復。譚杰［42］使用Ⅱ型膠原/殼聚糖/β 甘油磷酸鈉/透明質酸鈉髓核組織工程水凝膠復合UCMSCs 移植入兔椎間盤退變模型中，術后12 周進行影像學檢查、組織病理學和免疫組織化學評估，結果表明，UCMSCs 可以在Ⅱ型膠原/殼聚糖/甘油磷酸鈉/透明質酸鈉水凝膠中生長及分化，能夠分泌聚集蛋白多糖、Ⅱ型膠原和SOX9 相關蛋白，并且干細胞凝膠復合物植入兔退變椎間盤中對椎間盤退變有一定的修復和再生作用。綜上所述，生物材料支架或水凝膠支架復合UCMSCs移植可能是一種治療椎間盤退變的有效方法。然而，上述研究未對支架/細胞復合體中細胞存活情況及支架機械力學進行測定，且水凝膠支架/臍帶間充質干細胞復合體治療椎間盤退變的研究較少。因此，還需要深入挖掘UCMSCs在治療椎間盤退變上的優勢。

2.2 臨床研究 近年來臍帶間充質干細胞已被廣泛用于類風濕性關節炎［43］、肝衰竭［44］等多種疾病的治療，且獲得了顯著臨床效果。雖然UCMSCs 廣泛應用于多種疾病的治療，且在IVD退變動物模型研究中取得了令人興奮的效果，但將其用于椎間盤源性腰背痛的臨床研究仍相對較少。2014 年PANG X D等［14］首次將UCMSCs 移植到2 例慢性椎間盤源性腰痛患者的退變IVD 中，分別于術前、術后6 個月、12 個月和24 個月對2 例患者進行疼痛VAS 評分和Oswestry 殘疾指數（ODI）評分，結果顯示UCMSCs 移植治療后患者VAS 評分和ODI 評分均顯著下降，腰痛和腰椎功能明顯改善。雖然，上述研究證明了臍帶間充質干細胞移植能夠明顯緩解椎間盤源性腰痛，具有良好的臨床應用前景，但該研究樣本量只有2 例患者，且術后隨訪時間僅為1 年，未進行長期的跟蹤隨訪，偏倚風險較大。因此，還需要大樣本的研究和長期術后隨訪。

另外，關于干細胞移植治療椎間盤源性腰背痛的有效性遭到質疑，PENG B G 等［37］認為，退變的椎間盤軟骨終板可能鈣化，營養物質的擴散受到限制，盲目追求椎間盤修復策略，促進細胞增殖和合成代謝活性，而不考慮退化椎間盤內的營養環境，未必是椎間盤再生的正確方向。另外，PENG B G等［37］對細胞療法局限性如：患者的選擇、IVD 內致痛神經纖維的生長、移植細胞的存活及無法恢復的IVD機械負荷等提出了可能的解決方法。MEISEL H J等［45］分析發現，目前使用同種異體或自體干細胞進行IVD 修復相關研究的證據等級非常低，缺乏大樣本完全隨機對照試驗研究。盡管臨床研究表明存在良好的風險-獲益比，但仍需建立基于細胞治療的臨床證據。

3 UCMSCs來源外泌體在IVD退變中的研究

3.1 UCMSCs 來源外泌體的特點 越來越多的研究發現，不僅間充質干細胞本身可以分化為髓核樣細胞、激活IVD 內源性細胞及具有抗炎作用，還能夠分泌生長因子、趨化因子、微泡和外泌體等，這些分泌物參與細胞間的通訊、調節組織微環境、促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，修復和再生受損組織［46］。外泌體是具有脂質雙分子層的球形顆粒，被膜包含鞘磷脂、卵磷脂、腦磷脂、膽固醇和神經酰胺，直徑大約40～100 nm，密度為1.13～1.19 g·mL-1。外泌體表面標志物為CD9、CD63、CD81 和CD83 等，含有DNA、RNA、細胞因子、其他脂質及蛋白質等與MSCs 相同的調控物質，這使外泌體與其來源的MSCs 具有類似的作用。MSCs 外泌體通過不同的途徑積極參與細胞增殖、免疫調節、細胞凋亡以及ECM 合成代謝和分解代謝。此外，MSCs來源的外泌體具有低免疫原性、低細胞毒性、易獲取、易存儲及高可修復性等特點［47］。

3.2 UCMSCs 來源外泌體的分離提取 目前，關于外泌體的分離提取方法較多，常用方法有超速離心、免疫親和、超濾和沉淀法等，其中超速離心法是分離外泌體的“金標準”，且被廣泛使用。然而，這些方法并非完美無缺。使用這些方法提取外泌體需要昂貴的儀器和大量的樣本，可能遇到污染及產出量少等問題。近年來，微流體技術被用于外泌體的提取，其具有靈敏度高、特異度高、產量高及純度高等特點。然而，微流體技術復雜的系統及較高的成本使其廣泛應用受到了阻礙，隨著微流體技術的發展，有望成為外泌體提取有前途的技術。另外，各種原理的外泌體提取試劑盒的出現，方便了外泌體的提取，但缺點是價格較為昂貴［48］?？傊?，外泌體的分離提取方法種類繁多，傳統分離方法、微流體技術及試劑盒各有優缺點。目前，尚無一種最完美的外泌體分離提取方法，需根據研究需求選擇合適的方法（表1）。

表1 外泌體分離提取方法的比較

3.3 UCMSCs 外泌體治療椎間盤退變 UCMSCs來源外泌體具有低免疫原性、無腫瘤形成、易保存等優點，已在多種疾病治療中表現出巨大的優勢。UCMSCs 外泌體對退變的椎間盤具有一定的修復作用。YUAN X Q 等［49］體外研究發現，UCMSCs外泌體中miR-26a-5p 靶向作用于髓核細胞中mRNA 甲基轉移酶L14（METTL14），下調METTL14 水平，降低了NLRP3 mRNA m6A 甲基化，減少了NLRP3 蛋白表達，使髓核細胞促炎因子和焦亡減少，從而延緩IVD 退變。ZENG X L 等［16］使用UCMSCs 條件培養基培養D-NPMSCs，通過三系分化誘導、流式鑒定及qRT-PCR 等技術分析后發現，使用條件培養基的D-NPMSCs 組在成脂、成骨和成軟骨方面要優于未使用條件培養基的D-NPMSCs 組，且流式鑒定MSC特異性表明標志物CD29 和CD105 顯著增加，qPCR結果顯示Tie2基因表達顯著上調。這些結果說明，UCMSCs條件培養基在體外條件下能夠促進D-NPMSCs恢復到健康的MSCs 表型，且能改善D-NPMSCs的干性。余家悅［50］將UCMSCs 來源外泌體與D-NPMSCs共培養3 天后，通過qPCR 和蛋白印跡檢測IL-1β 和IL-6等在基因和蛋白水平上的表達情況，結果發現，UCMSCs 來源外泌體能減少D-NPMSCs 炎癥因子IL-1β 表達，增強IL-6 的表達，說明UCMSCs 來源外泌體具有抗炎作用。通過檢測Tie2、NANOG、SOX2、OTC4的表達情況和髓核細胞標志物CD24發現，UCMSCs來源外泌體能夠增強D-NPMSCs的多能性，改善DNPMSCs 去分化狀態。因此，其對退變椎間盤的修復起到重要作用。然而，上述研究只在體外條件下證明了UCMSCs 外泌體具有促進IVD 內細胞增殖及改善其干性的作用，對于UCMSCs 外泌體在體內是否具有修復退變IVD 的能力尚未進行研究。UCMSCs 外泌體在治療椎間盤退變的機制尚不完全清楚，且缺乏臨床應用研究。因此，還需進一步研究探索。

4 小結與展望

UCMSCs 具有易獲取、低免疫原性及倫理爭議少等優點，且移植后可以延緩和修復椎間盤退化，是安全有效的。目前為止，移植細胞在椎間盤中存活時間和存活率，以及治療功效尚未達到預期。雖然，移植UCMSCs來源外泌體不用考慮存活問題，且其在骨折、腎衰竭及脊髓損傷等疾病的治療中已表現出巨大優勢，但其治療椎間盤退變的體內研究極少?？傊?，UCMSCs 及其外泌體治療椎間盤退變在體外及動物研究方面取得了一定成果，但缺乏可靠的臨床研究，完全修復和再生退化的椎間盤還需要深入地研究。