納米孔基因測序技術在HLA基因分型中的應用

朱孟琳，何燕琴，謝水蓮，楊 影，萬紹貴

（1. 贛南醫科大學基礎醫學院；2. 贛州市中心血站檢驗科；3. 贛南醫科大學基礎醫學院分子病理中心，江西 贛州 341000）

主要組織相容性復合物（Major histocompatibility complex，MHC）是一組能編碼代表個體特異性抗原的基因群，其中編碼人類基因的MHC又稱為人類白細胞抗原（Human leukocyte antigen，HLA）復合體。人類白細胞抗原系統在免疫功能調節系統中，HLA分子與胸腺中T 細胞相互識別，來確定是否為自身分子［1］。因此準確的HLA分型在移植、輸血、自身免疫疾病的臨床診斷等方面均有重要作用［2］。

納米孔基因測序技術是利用納米級蛋白孔作為生物傳感器，通過電流的變化識別DNA 或RNA的堿基序列［3］。該方法可以直接快速實時對DNA或者RNA堿基序列進行讀取，為研究HLA分型提供了很大的助力。本文主要綜述納米孔基因測序技術在HLA基因分型中的應用。

1 HLA基因結構與功能

HLA 復合體位于第6 號染色體短臂2 區1 帶3亞帶（6p21.3）區域內，該區域是人類基因組中多態性最強的區域。截至2022年7月12日，世界衛生組織（World health organization，WHO）認證的HLA 序列數據儲存庫（IPD-IMGT/HLA 數據庫）已經收錄了35 220 個HLA 等位基因。按照HLA 復合體在染色體上距離著絲粒的遠近，可將HLA分為3個區，即Ⅰ類基因區、Ⅱ類基因區、Ⅲ類基因區（圖1）［4］。經典HLA 基因編碼的產物直接參與機體免疫反應的抗原提呈過程。HLA Ⅰ類抗原分子由兩條多肽鏈組成，即HLA 基因編碼的α 鏈和非HLA 基因編碼的β鏈，組成4 個結構區，其中α1 和α2 組成結構區形成HLA Ⅰ類分子的肽結合槽；同樣，HLA Ⅱ類分子是由α1和β1形成肽結合槽，該區域是抗原識別區域，決定HLA 抗原特異性的部位，也是不同基因型HLA分子的結構差異［5］。故HLA 基因型的不同決定其HLA 抗原特異性，HLA 的抗原表位被認為是發生移植免疫反應的關鍵分子部位，HLA 抗原表位錯配數越高，移植后發生免疫排斥反應的可能性越大［6］。因此，在進行器官或骨髓移植之前，對供體和受體的HLA 分子進行精準的配型極其重要，以防術后發生嚴重的移植免疫排斥。

圖1 HLA復合體結構示意圖

2 HLA分型方法

隨著測序技術的不斷發展和進步，DNA 測序方法不僅可以帶來更準確的HLA 基因分型，而且可以發現新的等位基因。為了更好分辨新的等位基因，國際上建立統一的命名規則（圖2）。將不同HLA等位基因分為4 個數字區域和修飾后綴（N/S/L 等）進行區分，在進行HLA 分型中識別到第一個數字區域為低分辨率分型（Low resolution typing），識別到前兩個數字區域以上為高分辨率分型（High resolution typing），識別到所有數字區域為等位基因水平分型（Allele level typing）［6-8］。2021 年8 月我國國家衛生健康委員會發布的《人類白細胞抗原基因分型檢測系統技術標準》確定了聚合酶鏈反應——直接測序法（Polymerase chain reaction sequence-based typing，PCR-SBT）為HLA 分型方法的金標準。PCR-SBT是針對HLA Ⅰ類基因和HLA Ⅱ類基因的各外顯子進行PCR 擴增，后用Sanger 測序方法（第一代測序方法）對擴增序列進行測序，該方法是直接在DNA水平對HLA 進行分型，相比于傳統血清學方法對HLA 分型更為準確。但由于HLA 基因高度的序列相似性以及等位基因之間的大量多態性和鑲嵌結構，PCR-SBT 方法在HLA 分型中會出現模棱兩可等位基因組合等問題。同樣下一代測序技術（Next generation sequencing， NGS）也在HLA 基因分型中研究廣泛，但受限于測序讀長較短和序列拼接困難的缺陷等，HLA 的精準分型仍存在挑戰［9］。而作為第三代測序技術代表的納米孔基因測序技術可能可以解決這些問題。

圖2 HLA等位基因的命名

納米孔基因測序技術核心是納米級的蛋白質孔或“納米孔”，設計來源于α-溶血素［10］。在充滿離子的溶液中，給納米孔兩側施加恒定電壓，產生通過納米孔的離子電流，單鏈DNA 或RNA 分子通過馬達蛋白的驅動，穿過納米孔，而其間各個堿基對離子電流的阻礙可形成不同的電流信號，后將不同的電流信號通過計算算法解碼得出堿基序列［3］。納米孔基因測序技術在對于HLA 應用方面，不僅有助于發現新等位基因，如WANG Y H 等［3］利用納米孔基因測序技術發現一種新的HLA-A*11：335 等位基因、SHAW B E 等［11］在DPB1 測序中發現新突變（DPB1*02：01：02 + DPB1*04：01：01：13）；而且可以對HLA 基因進行快速分型，極大提高器官移植效率。

3 納米孔基因測序技術在HLA 基因分型的應用

除三代測序以外，其余測序均以短測序讀長為主，而HLA 基因區域具有高度重復性，難以進行組裝和易遺漏位置信息［12］，納米孔基因測序技術有著長讀長的特點，在用于HLA 全長基因讀取可以提供更為完整的基因信息。自2014 年牛津納米孔技術公司（Oxford nanopore technologies， ONT）研發出的第一臺納米孔測序儀MinION 后，納米孔測序技術就廣泛應用于各種基礎研究，AMMAR R 等［13］將納米孔檢測技術應用于HLA 基因分型，檢測HLA-A、HLA-B 和CYP2D6 顯示CYP2D6（單次最佳命中比對）平均覆蓋率為1 236.4×，HLA-A（多次命中比對）為785.5×，HLA-B（多次命中比對）為1 416.3×，表明納米孔基因測序在HLA 分型中具有很大的潛力。隨著該測序技術的發展，2018 年LIU C 等［14］利用MinION 對HLA Ⅰ類基因進行測序并開發新的算法工具Athlon，HLA 分型準確率在低分辨率和高分辨率下皆為100%，促進了HLA 分型的發展和完善，提高HLA 分型的通量和準確性。到目前為止，2020年1月發布的R10.3測序芯片也被應用于HLA 基因分型檢測，所測樣本有102 個，樣本檢測有HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLADOA1、HLA-DRB1、HLA-DRB3/4/5 位點共1 836 個等位基因（918 個基因型），原始讀數準確率的中位數可達93.7%，相較于R9.4芯片其準確率提高6%，越來越多的研究表明，納米孔基因測序技術可應用于HLA 分型［15］。實時納米孔基因測序技術作為第三代測序中的代表，目前被廣泛應用于各個生物學研究領域，如全基因組測序、靶向基因組測序、全長轉錄組測序、宏基因組測序、突變分析、表觀遺傳學研究等方面。目前主要利用納米孔基因測序技術同靶向測序方法結合對HLA 基因進行分型，在準備基因組文庫時主要采用2 種方法：一種是利用PCR富集目標基因區域；另一種是基于PCR 擴增cDNA樣本。前者是對樣本進行DNA 提取后直接測序分析，可以減少文庫建立的繁瑣；后者對樣本進行RNA 提取后轉錄為cDNA 進行測序，該測序可同時對RNA進行表達分析，得到完整的轉錄本。

3.1 基于PCR 擴增基因組樣本的納米孔基因測序技術在HLA 基因分型中應用 利用PCR 對目標HLA 基因區域進行擴增，將得到的擴增子進行文庫制備，將制備好的文庫加載到納米孔測序芯片（Flow cell）上進行測序，后對測序數據進行分析。靶向基因區域主要包括3部分：基因多態性區域、基因外顯子區、全長基因區域。采用的靶向技術包括普通PCR、Long-range PCR和多重PCR等。DUKE J L等［16］通過Long-range PCR對HLA-DPB1基因座進行擴增；STOCKTON J D 等［17］通過Long-range PCR 對HLA Ⅰ類和HLA Ⅱ類基因進行擴增；MONTGOMERY M C等［18］通過Long-range PCR 對Ⅰ類HLA 基因中的HLA-A、HLA-B 和HLA-C 基因座進行全長擴增，通過MinION 進行測序皆可以得到高分辨率的HLA 基因分型。此外，HLA 系統在人體內基因組中呈現高度多態性，其遺傳基礎和主要表現為復等位基因，而納米孔檢測技術的長讀長可以簡化等位基因的定相分析，如STOCKTON J D 等［17］利用單樣本測序獲得HLA純合子和重建來自父母本的單倍型。

3.2 基于PCR 擴增cDNA 樣本的納米孔基因測序技術在HLA 基因分型中的應用 PCR-cDNA 測序是ONT 基于cDNA 測序開發的一種測序方法，僅需1 ng RNA 作為起始材料，將RNA 轉錄為目標基因區域或全長cDNA 進行PCR 擴增，后將擴增的PCR產物進行測序文庫制備（主要使用文庫試劑盒為SQK-PCS108 試劑盒），將制備好的文庫加載到納米孔基因測序芯片進行測序，從而可得到基于cDNA的測序數據。MONTGOMERY M C 等［18］收集12 個健康供體外周血中的單核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），提取該細胞中的mRNA，后將mRNA轉錄為cDNA文庫并加載到MinION芯片上進行測序，將其產生的數據與現有數據庫中HLA-A、HLA-B、HLA-C的2號和3號外顯子的參考序列和人類基因組hg38進行比對，結果表明HLA-B的相對表達量較HLA-A、HLA-C 高。JOHANSSON T 等［19］針對HLA 12 個基因座的cDNA 進行擴增，將擴增的基因文庫進行MinION 測序。上述實驗的HLA 基因分型均可達到高分辨率分型，表明基于PCR 擴增cDNA 樣本的納米孔基因測序技術可以同時進行HLA 的基因分型和HLA 表達。在實體器官移植中HLA 的表達會影響供受體的相容性［18］，如果通過該項技術對供受體進行評估，可以更準確地評估患者接受該項治療的風險，但目前移植中心未將此項納入供受體評估。納米孔基因測序技術相較于NGS突出的優點是長讀長，可以檢測出NGS 未檢測到的剪接異構體位點。OKA M 等［20］利用該測序技術建立非小細胞肺癌細胞系的全長轉錄本，并從中鑒定出新型和潛在的新抗原。

4 納米孔基因測序技術在臨床上HLA 基因分型中的應用

4.1 納米孔基因測序技術鑒定HLA分型在器官移植方面的應用 HLA 分布在所有有核細胞上，是免疫識別和免疫監視的重要效應分子，是器官移植成功率的關鍵影響因素。而供、受者間的HLA 基因型差異是引發急性移植排斥反應的主要因素，因此臨床上需要檢測供受體高分辨率的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DPB1 是否匹配，特別是HLA-DBP 基因是否匹配對移植后器官存活率有重要影響［21］。器官移植時間越短對于器官在受體內運行的有效性越高，但目前DNA 測序對HLA 基因分型所用時間較長，未能在分配供體前實現基因分型。而納米孔基因測序技術可實現快速、實時測序。STOCKTON J D 等［17］使用大約8 h進行建庫測序，可得到測序深度為500 X 的數據。CORNABY C等［22］使用大約6～7 h便可提供高分辨率HLA 分型和完整的轉錄本表達。MOSBRUGER T L等［23］分別使用三種不同的PCR 方案進行樣品基因擴增，總流程時長約6 h，均能實現高分辨率的HLA基因分型。DE SANTIS D 等［24］開發了一種快速高分辨HLA 分型方法，使用基于NGS的AllTypeTM產品對HLA 12 個基因座進行擴增，總流程時長大約4.5 h，同時利用此新型分型方法和SSO-PCR 分型方法同時進行，對10 例已故供體進行實時分型，證明該新型分型方法相對于SSO-PCR 方法產生數據分辨率更高、測序總流程時間更短。納米孔測序技術對于HLA 分型時間介于NGS 和PCR-SSO 之間，但卻可以獲得較PCR-SSO 更多的額外信息和高分辨率分型，使得可在已故供體分配時間內實現分型，并提高分辨率、增加供受體相容性。

4.2 納米孔基因測序技術鑒定HLA基因分型應用于臨床診斷 隨著檢測技術的不斷發展，人們可通過DNA 水平輔助疾病的治療或探索疾病的發生發展。如痛風性關節炎患者治療時會實時檢測患者是否有攜帶HLA-B*5801 基因型，評估或檢測患者疾病狀態［25］。納米孔基因測序技術可對HLA 基因進行高分辨基因分型，有助于臨床了解相關疾病發生發展。MATERN B M 等［26］在研究中分兩步進行實驗：第一次實驗數據可覆蓋71個已知的Ⅰ類等位基因組中的70 個，包括除了HLA-B*83 以外的所有HLA Ⅰ類等位基因組；第二次實驗，67 個診斷樣本同時進行MinION測序和Sanger測序，實驗結果證明兩者測序結果的一致性達100%。Sanger 測序是目前認為技術成熟的測序技術并廣泛應用于臨床實踐中，而目前納米孔基因測序技術在HLA 系統中并未用于臨床，但該實驗證明納米基因測序技術進行高準確度HLA 基因分型可用于臨床常規診斷。不僅如此，ONT 的便攜性測序儀MinION 可輕松用于基礎實驗室，無需使用測序核心設施，其基因組文庫建立大多使用PCR 靶向技術，成本較低，可大范圍應用于臨床。STOCKTON J D 等［17］驗證了納米孔基因測序技術可在資源有限情況下進行HLA 分型診斷相應疾病。

5 總結與展望

納米孔基因測序技術是一種新興的技術，在HLA 基因研究中發揮著重要作用。盡管其準確率高達98.9%，但仍存在一些固有缺陷，如個別等位基因覆蓋率低，文庫制備導致的讀長限制和測序深度低等。此外，數據量大、分析復雜以及分析軟件缺乏等因素也限制了其應用。

納米孔基因測序技術在HLA 分型中最常見的基因組文庫準備方法是基于PCR 擴增出測序產物，該方法雖價格低廉，但針對HLA 目的基因的引物多和PCR 固有的問題，會導致結果中出現難以分辨的高度重復序列、高GC 難以擴增等問題。CRISPR/Cas9 是一項基因編輯工具，可通過設計特異性crRNA 探針對任意的靶向DNA 片段進行準確切割，而MinION 可直接針對該靶DNA 片段進行測序，基于Cas9的納米孔基因測序技術無需PCR 擴增，不受CG 含量影響，具有測序深度高等優點，這將會是基于納米孔基因測序技術的靶向測序在未來HLA分型方面的主攻方向。