光譜法研究天然?；撬崤c肝硬化門靜脈高壓大鼠的肝組織蛋白相互作用*

玉 葉,廖 娟,文 彬,鄧 鑫

(1.桂林市中醫醫院,廣西 桂林 541000;2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院;3.廣西中醫藥大學基礎醫學院)

門脈高壓癥是肝硬化的主要并發癥,后期易并發腹水、食管靜脈曲張、肝性腦病和肝腎綜合征等,導致疾病預后不佳,治療上主要針對病因和并發癥治療[1]。有效降低門靜脈壓力可降低肝硬化患者并發癥的發生率,并可能提高其生存率。前期研究表明,天然?；撬峋哂懈纳聘喂δ芗翱垢卫w維化作用[2-3]。此外,Wen等[4]首次發現天然?；撬崮茱@著降低肝硬化大鼠門靜脈壓力,提高門靜脈順應性,有效減緩門脈高壓,其作用機制可能與改善門靜脈力學作用相關[5]。配體-蛋白質相互作用親和力的信息對于評估具有重要藥理意義化合物的治療效果是非常有價值的。因此,本研究運用熒光光譜法探討天然?；撬崤c肝硬化門靜脈高壓大鼠肝組織蛋白間的分子作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物 120只SPF級雄性Wistar大鼠,體質量(200.0±10.0) g,長沙市天勤生物技術有限公司購買,動物許可證號:SCXK(湘)2014-2011,動物合格證號:43006700016127,遵循3R原則,在恒溫(23±2 ℃)、恒濕(50.0%±10.0%)、晝夜循環(12 h∶12 h)條件下飼養。

1.2材料 天然?；撬?從珍珠貝中提取,經蒸煮后,濃縮湯汁,加乙醇沉淀,取上清液,然后對上清液進行脫色處理,結晶得到天然?；撬?,鹽酸普萘洛爾片(別名心得安,規格為10 mg/片,由亞邦愛普森藥業有限公司生產,國藥準字:H32020133,含量97.0%～103.0%);橄欖油(阿拉丁工業公司);甲醛(10.0%福爾馬林);人血清白蛋白[(Human serum albumin,以下簡稱HSA,廠家為Solarbio(索萊寶),純度96%～99%,分子量為66478,Tirs-Hcl緩沖液(Phygene飛凈,PH 7.4)];PBS緩沖液(飛凈);蛋白裂解液(biosharp);PMSF(苯甲基磺酰氯,biosharp);BCA蛋白濃度測定試劑盒(biosharp)等。

1.3方法

1.3.1動物模型的建立 將120只大鼠按隨機數字法分成正常組、模型組、心得安組、天然?；撬峤M四組,每組30只,除正常組外,其余三組用四氯化碳(carbon tetrachloride,CCL4)制備肝硬化門脈高壓大鼠模型,造模同時給藥,療程10周。

1.3.2樣本收集 動物模型制備成功后取材:麻醉,固定,沿大鼠腹中線逐層剪開腹壁并游離肝門靜脈主干,連接電磁流量計以測定門靜脈血流量(portal vein flow,PVF)、門靜脈壓力(portal vein pressure,PVP)、右頸動脈插管用于測定平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)和心率(heart rate,HR);測量結束后,分離肝臟組織,置于生理鹽水中迅速漂洗3遍以清潔殘留血液,凍存并標注。將所取下組織分成兩部分:①置于10.0%甲醛溶液中固定過夜,4℃保存,觀察病理學改變并拍照記錄;②另一部分肝組織提取蛋白,并配制BCA工作液、蛋白標準品,采用全波長多功能酶標儀,于562 nm處測定吸光值。

1.3.3紫外可見吸收光譜 將天然?；撬嵊贸兯苽涑蓾舛扰c組織蛋白相似的溶液,濃度為1 mg/mL,使用紫外分光光度計測量并記錄200～500 nm處相應的天然?；撬嶙贤馕展庾V。

1.3.4熒光光譜 根據提取的上清液所測蛋白濃度相似度配制所需濃度,正常組、模型組、天然?；撬峤M濃度相似,加入pH =7.4 Tirs-Hcl緩沖液制成1 mg/mL的溶液,置于4 ℃低溫保存備用。天然?；撬岱譃閮山M不同濃度梯度(一組:0、2、4、6、8、10、12 μL;二組:0、8、16、24、32、40、48、56 μL)。準確移取濃度為2.5×10-3g/L的天然?；撬嵊? mL離心管中,并用移液管向每個離心管中移入2 mL的1 mg/mL的各組大鼠蛋白溶液,置于漩渦混合器10 s,使混合液充分混合。在291、301、311 K(K:開爾文T,物理中常用T=t+273.15 K,所以t=0 ℃時,T=273.15 K;291K ≈17.85 ℃、301K ≈27.85 ℃、311K ≈37.85 ℃)不同水浴溫度下30 min后測量并記錄相應的熒光值。

熒光光譜掃描參數設置:發射光波長(Em)范圍為295-500 nm,熒光激發光波長(Ex)設定為280 nm,狹縫寬度為5.0 nm,掃描速度為6 000 nm/min,數據間隔為1.0 nm,靈敏度設為Auto。

1.3.5熒光猝滅 熒光測量采用日本島津RF7600熒光分光光度計,激發波長280 nm,發射波長為295～500 nm。研究天然?；撬嵴T導人血清白蛋白(human serum albumins,HSA)熒光猝滅的機理,用Stern-Volmer方程計算了HSA在不同溫度下的熒光猝滅[6]:

F0是未加入猝滅劑時的熒光強度;F是加入猝滅劑后的熒光強度;Kq是雙分子猝滅過程速率常數;Ksv是Stern-Volmer動態猝滅常數;[Q]是猝滅劑的濃度;τ0是未加入猝滅劑時熒光分子的平均壽命,生物大分子的平均熒光壽命約為10-8s。

1.3.6結合常數的計算 對于蛋白質的熒光猝滅為靜態猝滅過程,當藥物分子獨立地與大分子上的一組等效位點結合時,根據lg(F0-F)/F與lg[Q]相比繪制雙對數曲線,可以通過截距和斜率分別得到結合位點數n和結合常數Ka。結合常數(Ka)和結合位點數(n)可以由下式確定[7-8]:

式中,F0表示未加入猝滅劑時熒光體的熒光強度;F表示加入猝滅劑時熒光體的熒光強度,Ka是猝滅劑與HSA的表觀結合常數;n是結合位點數;[Q]為猝滅劑的濃度。

1.3.7熱力學參數的測定 熱力學參數可根據van't Hoff方程[9-11]來估算:

其中Kb類似于相應溫度下的締合結合常數即Ka,R為氣體常數。焓變(△H)由范特霍夫關系式的斜率計算得出。然后,根據以下關系[9-11]估計自由能變化(△G):

△G=△H-T△S

(4)

1.3.8能量轉移的計算R0可以根據施主發射光譜和受主吸收光譜使用Forster公式來計算[12-13]。

(6)

(7)

(8)

其中能量傳遞效率E由上式(5)定義。r是受體和施主之間的距離,R0是Forster臨界距離,在該臨界距離下,50%的激發能量轉移到受體;K2是表示供體相對于受體分子的相對取向的因子;N是介質的折射率;?是在沒有受體或供體的情況下量子產率;J是供體的熒光發射光譜和受體的吸收光譜的重疊積分;Fλ是在波長λ處沒有受體的情況下給體的熒光強度;ελ是受體在λ處的紫外摩爾吸收系數。已有文獻報道K2=2/3,N=1.336,?=0.118[14]。J是重疊區域,從而計算出J、E、R0和r。

2 結果

2.1天然?；撬嶂委熀箝T靜脈壓力相關指標的對比 與正常組比較,模型組、天然?；撬峤M、心得安組門靜脈壓力(PVP)、門靜脈流量(PVF)升高;平均動脈壓(MAP)降低(均P<0.05);與模型組比較,天然?；撬峤M、心得安組PVP、PVF下降(P<0.05),MAP升高(P<0.05);與心得安組比較,天然?；撬峤MPVP、PVF下降(P<0.05),MAP升高(P<0.05)。在HR(心率)方面,組間兩兩比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 大鼠門脈壓力相關指標

2.2天然?；撬崤c蛋白相互作用 在微孔板中加入BCA工作液后,混合溶液出現顯色反應,顏色隨著時間反應不斷加深。以不含BSA的樣品的光吸收值作為空白對照,繪制標準曲線圖(圖1)。根據BSA標準曲線圖計算出待測樣品濃度。見表2。

圖1 BSA標準曲線

表2 各組肝硬化大鼠肝臟組織蛋白濃度(mg/mL)

2.2.1天然?；撬崤c肝硬化門靜脈高壓大鼠蛋白熒光光譜 溫度在291 K、301 K、311 K時,HSA濃度固定,逐漸增加天然?；撬釢舛葴y出的熒光發射光譜圖見圖2、3。隨著天然?；撬釢舛鹊脑黾?不同溫度下HSA熒光強度從0到14出現明顯而規律的下降,即說明HSA的熒光發生了猝滅。此外,17.8 ℃、27.8 ℃、37.8 ℃時均在331 nm附近出現熒光的最大峰,不同溫度下的最大發射波長均出現輕微藍移,藍移可達4.3 nm(327.3～331.6 nm),藍移表明色氨酸殘基的極性較弱(或疏水性較強)。該現象表明天然?；撬嶂兴幬镄》肿涌赡芘c HSA 相互作用生成復合物,其空間構象可能在一定程度上發生變化。

圖2 不同溫度下天然?；撬崤c大鼠肝臟組織蛋白熒光發射光譜(一組)

圖3 不同溫度下天然?；撬崤c大鼠肝臟組織蛋白熒光發射光譜圖(二組)

2.3熒光猝滅 根據圖2、3,運用方程(1)繪制了在不同溫度下天然?；撬崤c大鼠蛋白的Stern-Volmer圖(圖4)。

圖4 大鼠肝臟組織蛋白與天然?；撬狍w系的兩組熒光猝滅SV曲線

基于圖2、3中的圖形,運用方程(1)繪制了圖4的SV曲線圖,根據圖線的斜率和截距,計算出相應的天然?；撬崤c大鼠蛋白相互作用的動態猝滅常數及猝滅速率,結果見表3。

表3 大鼠肝臟組織蛋白與天然?；撬岱磻膬山MStern-Volmer常數

2.4結合常數和結合位點 結合圖4、Stern-Volmer 方程求出Ksv、Kq。由表3可知當溫度為291 K、301 K時Kq均大于最大動態猝滅速率2.0×10100L/(mol·s),實驗結果表明,天然?；撬釋SA的熒光猝滅是天然?；撬?HSA復合物形成的結果,熒光猝滅是靜態猝滅的可能性較大,對于靜態淬火過程,根據方程(2)對淬火數據進行了分析,得出對數曲線(圖5),顯示了HSA-天然?；撬峤Y合的線性依賴關系;線性回歸分析(表4)列出了不同溫度與大鼠蛋白相關的天然?；撬岬慕Y合常數Ka和結合位點n。

圖5 肝臟組織蛋白與?；撬狍w系的兩組雙對數曲線

表4 天然?；撬崤c大鼠肝臟組織蛋白反應的兩組結合常數及結合位點數

2.5熱力學參數和結合力的性質 為了解釋天然?；撬崤c大鼠蛋白相互作用的能量變化,用van't Hoff圖計算了熱力學參數。在△H近似恒定的假設下,給出了天然?；撬崤c大鼠蛋白結合的van't Hoff關系(圖6),顯示了從擬合線原點處的斜率和縱坐標獲得的結合位點的△H和△S的值,根據公式(4)計算出△G(表5)。

圖6 天然?；撬崤c大鼠肝臟組織蛋白的兩組van't Hoff曲線

表5 天然?；撬崤c大鼠蛋白體系的SV對數方程結合常數Ka值及相關熱力學參數

2.6Foster能量轉移 將天然?；撬岬腢V光譜與大鼠蛋白熒光光譜繪制光譜重疊圖如圖7所示,在各組組織蛋白的熒光發射光譜和天然?；撬岬奈誙V光譜之間有光譜重疊。根據Forster理論,能量傳遞效率E定義為上述公式(5)-(8)。其中r是從配體到蛋白質色氨酸殘基的距離,R0是Forster臨界距離,在該距離下50%的激發能量轉移到受體。它可以用Forster公式從施主發射光譜和受主吸收光譜中計算出來,即可以計算天然?；撬?HSA系統的結合距離,結果見表6。

圖7 大鼠蛋白熒光光譜和天然?；撬岬淖贤夤庾V重疊圖

表6 各組非放射性能量轉移相關參數

3 討論

天然?；撬嵩诟鞣N器官和組織成分中起著重要的生理和病理作用,這些作用包括滲透調節、膜穩定、調節鈣水平、抗氧化、抗凋亡、抗炎和抗脂質活性,其中抗氧化作用能影響細胞增殖、炎癥和膠原組織[15]。天然?；撬岷拷档团c組織生理穩態失衡可能會導致骨骼肌,心臟,肝臟和脂肪組織的能量代謝失衡[16]。由表1及圖1實驗結果再次證實天然?；撬峋哂锌垢卫w維化及抑制肝硬化門脈高壓作用。

熒光猝滅是由猝滅劑與熒光團之間的碰撞或形成絡合物而引起樣品熒光強度降低的過程,包括激發態反應、分子重排、能量轉移、基態復合物的形成和碰撞猝滅[17],通常分為動態猝滅和靜態猝滅[14]。動態猝滅過程是熒光團和猝滅劑分子在介質中擴散的結果,只影響熒光團的激發態,不改變吸收光譜。靜態猝滅是由于熒光團和猝滅劑分子之間形成暗色絡合物,經常導致吸收光譜的變化。圖2、3得出正常組、模型組、天然?；撬峤M大鼠蛋白在不同溫度下,隨著天然?；撬釢舛戎饾u增加,一組,二組均出現明顯而規律地下降,說明各組大鼠蛋白與天然?；撬狍w系的熒光發生了相互作用。由于靜態猝滅時配合物的穩定性降低,猝滅速率常數隨溫度的升高而減小。相反,動態猝滅速率常數會隨著溫度的升高而增加,因為溫度越高,猝滅劑的擴散就越快,因此碰撞猝滅的量就越大[18]。由表3可知不同溫度天然?；撬岬腒q均大于最大動態猝滅速率2.0×1010L/( mol·s),可以判定天然?；撬釋Ω鹘M大鼠蛋白的熒光猝滅機制均為靜態猝滅。此外,各組在不同溫度時均在331～309 nm附近出現熒光的最大峰,而且最大發射波長均出現輕微藍移,藍移可達1～2 nm(308～331 nm),藍移表明色氨酸殘基的極性較弱(或疏水性較強)。該現象說明天然?；撬峥赡芘c組織蛋白相互作用從而使其空間構象在一定程度上發生變化生成復合物。

由表4可以觀察出不同溫度天然?；撬崤c正常組蛋白反應的結合位點數近0.5,說明天然?；撬崤c正常組蛋白結合比例約為0.5∶1。推測正常組的結合過程屬于靜態猝滅,因為表觀結合常數Ka隨著溫度的升高值減小,證明了隨著溫度升高天然?；撬崤c正常組蛋白結合產生的復合物的穩定性下降。而模型組,天然?；撬峤M蛋白與天然?；撬岬慕Y合位點數均近1,說明天然?；撬崤c兩組蛋白結合比例約為1∶1。模型組表觀結合常數Ka隨著溫度的升高無明顯規律,猝滅機制是動態猝滅或靜態猝滅待進一步驗證。天然?；撬峤M表觀結合常數Ka隨著溫度的升高而升高,隨著溫度升高兩者之間結合作用增強,結合產生的復合物的穩定性上升。

藥物和生物分子之間的相互作用力可能包括靜電相互作用、多個氫鍵、范德華相互作用、抗體結合位點內的疏水和空間接觸等[12]。蛋白質反應的熱力學參數的顯著性和大小可以解釋對蛋白質穩定性有貢獻的主要作用力。從熱力學角度看,△H>0和△S>0表示疏水相互作用,△H<0和△S<0表示范德華力或氫鍵形成,△H<0和△S>0表示靜電作用力。表5顯示了從擬合線原點處的斜率和截距獲得的結合位點的△H和△S值。從表5看出正常組蛋白兩組△G均為負值,表明正常組蛋白結合過程是自發。兩者相互作用的△H和△S值表明,結合主要是熵驅動的,焓對其不利,是靜電作用力在反應中起主要作用。模型組蛋白一組△G均為負值,但二組△G均為正值,可能受天然?；撬釢舛扔绊?低濃度結合過程符合自發。天然?；撬峤M兩組△G均為正值,表明兩者相互作用過程不是自發。兩者相互作用的△H和△S值表明△G值的主要來源是△H項的較大貢獻,而△S因子的貢獻很小。因此,天然?；撬峤M與天然?；撬嶂g的相互作用可能是氫鍵和范德華作用。

熒光共振能量轉移(FRET)是研究蛋白質-配體相互作用和評估蛋白質的色氨酸殘基與配體之間距離的可靠方法。表6中結果顯示各組供體到受體的距離r<7 nm,表明能量從蛋白到天然?；撬岬哪芰哭D移發生可能性很大,這也符合FRET的條件,表明天然?；撬崤c組織蛋白之間存在靜態猝滅作用。

藥物與蛋白質大分子的相互作用是藥物發生藥理效應的重要途徑,它可以影響生物活性和毒性,結合參數有助于藥代動力學研究和劑型設計。通過光譜法觀察藥物與大分子相互作用前后的光譜對比,與傳統的親和層析、尺寸排斥層析、平衡透析、超濾等方法相比,光譜法具有靈敏度高、分析時間較短等優點。實驗結果表明,天然?；撬峥赡芡ㄟ^改變CCL4誘導的肝硬化門脈高壓大鼠的肝臟組織蛋白結構而達到改善肝組織損傷及血流狀態的作用。