絲素蛋白作為口腔組織再生屏障材料的應用進展

鄭雨欣,丁榆德,陳 楓,楊 帆

引導組織再生(guided tissue regeneration,GTR)在1976年由Melcher第一次提出,是一種能有效促進牙周附著再生的技術[1]。在此基礎上,Buser等[2]于1993年又進一步提出了引導骨再生(guided bone regeneration,GBR),從此開啟了種植骨再生領域的新篇章。在引導牙周組織或骨組織再生的過程中,屏障膜作為再生過程的必要條件之一,是目前研究的熱點。其中絲素蛋白(silk fibroin,SF)具有良好的生物相容性、優異的強度和韌性以及可調節的降解率,備受關注[3-4]。

本文對絲素蛋白作為屏障材料在口腔組織再生方面的國內外文獻作一綜述,探討絲素蛋白屏障材料在GTR/GBR中的研究現狀及前景。

1 GTR與GBR屏障膜

1.1 GTR

牙周炎作為臨床上最常見、最具破壞力的口腔疾病,最主要表現為牙周支持組織的喪失[5]。而GTR作為牙周組織再生的重要手段,是目前治療牙周炎的主要方式之一[6]。GTR治療主要使用屏障膜選擇性地引導目標細胞增殖,阻止封閉環境外的牙齦上皮和結締組織的長入,有利于牙周膜細胞遷移到牙周缺損部位,促進新的組織和骨的形成,形成新的附著[7]。顯然,其中屏障膜的選擇和應用是牙周再生的關鍵。因此,選擇和研發合適特性的屏障膜材料在牙周再生中尤為重要。

1.2 GBR

種植牙自1965年Br?nemark教授首次實施以來,已成為口腔醫師修復缺失牙的首選[8]。其中,充足的骨量是種植成功的關鍵。但研究統計顯示,上前牙區常見牙槽骨骨量不足或骨質欠佳,約90%患者存在頰側骨壁缺失或變薄的現象,需要在種植手術前施行骨增量手術[9-10]。

GBR作為臨床治療上應用最廣泛的骨增量術式,其基本原理與GTR類似,通過屏障膜形成一個封閉環境,阻止該區域外的成纖維細胞及上皮細胞長入,保證負責骨重建的成骨細胞、破骨細胞優先定植,從而實現骨組織再生[11]。而對具有阻擋目標細胞、維持成骨空間作用的屏障膜的研究,目前已成為GBR發展的關鍵之一。

1.3 屏障膜

目前國內外各學者普遍認可GBR/GTR中屏障膜的必要性,臨床最常用的屏障膜主要分為不可吸收膜和可吸收膜[12-13]。

不可吸收膜包括:膨脹型聚四氟乙烯膜(expanded-polytetrafluoroethylene,e-PTEF)以及鈦增強的聚四氟乙烯膜等[14-15],具有強度大、可個性化塑形等優點,適合于缺損類型較嚴重的骨缺損區修復。但因為生物相容性差,早期易引起軟組織并發癥,暴露后容易感染導致成骨不佳甚至失敗,且需要二次手術取出,限制了其進一步發展[16]。

可吸收膜包括牛、豬或者人的肌腱、真皮、皮膚、心包等天然來源的膠原膜以及聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚乙醇酸(polyglycolic acid,PGA)等人工合成的聚合物膜[17-21]。其中膠原膜因具有較好的生物相容性、能快速血管化、免疫原性低、無需二次手術取出等優點,目前已成為屏障膜的首選;但它也存在機械強度不足、降解速度快、空間維持能力差、屏障作用時間短等缺點,在治療較嚴重的骨缺損區時,往往無法獲得滿意的臨床效果[22]。

結合目前各類屏障膜的優缺點分析,優秀的屏障膜應具備以下特點:具有良好的生物相容性、組織整合性、細胞封閉性、維持空間性及臨床可操作性等,研發合適的屏障膜材料已經成為GBR/GTR進一步發展的關鍵[23-24]。

2 絲素蛋白的結構

絲素蛋白是從蠶絲中提取的一種獨特的天然蛋白,其主要來源為家蠶和柞蠶,由18種氨基酸組成,氨基酸序列由兩個不同的亞基構成:一個輕鏈和一個重鏈,再通過一個二硫鍵相互連接,輕鏈由一個非重復的、親水的序列組成,而重鏈的氨基酸序列由重復的Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser和Gly-Ala/Ser/Tyr二肽的重復段構成,形成了12個晶體結構域[25]。這種高甘氨酸含量使重鏈緊密堆積成非常穩定的β-sheet納米晶體,并通過氫鍵相互作用,提升了絲素蛋白的力學性能[26]。

3 絲素蛋白的生物特性及在口腔再生屏障材料中的應用現狀

絲素蛋白具有優良的生物相容性、生物降解性、生物可吸收性、低免疫原性和可調節的力學特性等優點,這也提示了絲素蛋白在組織再生領域的潛在用途[27-28]。

3.1 絲素蛋白屏障材料的生物相容性

生物相容性是屏障膜的基本要素,決定了細胞能否在屏障膜表面黏附、增殖和分化,以及后期人體對屏障膜是否會產生相應的抗原反應。

早在1993年,絲素蛋白的生物安全性與生物相容性就已經被美國食品和藥物監督管理局(FDA)認可。絲素蛋白被廣泛用于縫合材料[29-30],目前,FDA已經批準了不同的絲基醫療設備,如長期生物可吸收手術網片和絲素蛋白基韌帶移植物SeriACLTM。此外,絲素蛋白還被研究制備成用于傷口敷料的生物材料,臨床應用的產品也正在開發中(Akeso生物醫學公司)[29,31]。

而作為屏障膜材料的研究,不論是體內還是體外研究,均發現絲素蛋白沒有細胞毒性[32-34]。絲素蛋白在生物體內GBR過程中引起的炎癥反應程度與目前臨床最常應用的膠原膜相似,其具有良好的生物相容性。Kim等[35]在兔顱骨缺損模型中應用絲素蛋白納米纖維膜并評估其對骨再生的影響,實驗結果證實絲素蛋白納米纖維膜僅有輕微炎癥反應,具有良好的生物相容性和明顯的骨再生效果。同時,Ha等[36]在顯微鏡下觀察到絲素膜周圍幾乎沒有炎癥細胞,且在骨再生的區域有一個組織良好的血管網絡,證實了血管生成是加速絲素膜幫助骨愈合的關鍵因素。實驗結果顯示,絲素膜能獲得理想的GBR效果,且骨增量高度高于膠原膜和聚四氟乙烯膜。Smeets等[37]制備了一種羥基磷灰石、β-磷酸三鈣改性后的絲素蛋白膜,通過兔顱骨缺損實驗表明,與膠原膜相比,新型改性的絲素蛋白膜具有良好的生物相容性,在10周后更有利于支持骨形成,并能有效防止軟組織的長入,起到屏障作用。Kim等[38]采用大鼠顱骨缺損模型證實了絲素蛋白膜與膠原膜相比沒有任何更為嚴重的炎癥反應,且獲得了良好的骨增量效果。這些研究結果均已證明絲素蛋白膜具有良好的生物相容性,可以用作GBR的屏障材料之一。

3.2 絲素蛋白屏障材料的生物可降解性

生物可降解性和生物可吸收性是可吸收屏障膜材料的另一重要特征。理想的可吸收屏障膜材料需要在植入一段時間后,能被患者自身的細胞和細胞外基質逐漸取代。同時,要確保生物降解的副產物是無毒的,在體內代謝時不會干擾其他組織、器官和功能。根據GBR或GTR目標組織的不同,理想的屏障膜需要以可控的速率降解,能提供足夠的屏障時間支持組織再生。因此,控制降解速率是可吸收屏障膜材料研究的主要目標之一。

絲素蛋白作為一種酶降解聚合物,已被證明不會引起免疫原性反應,可以在體外或體內被各種酶(如α-糜蛋白酶、蛋白酶ⅩⅣ和膠原酶ⅠA酶等)降解,其降解產物主要是氨基酸和肽,降解后在體內容易被吸收,生物醫學應用潛力巨大[39-40]。

通過對絲素蛋白在生物體內的降解速率研究,學者們發現其中降解速率可調的關鍵在于其二級β-sheet結構的增減。Wang等[41]在Lewis大鼠中植入絲素蛋白多孔支架后,發現該支架在巨噬細胞的作用下8周開始降解,1年左右完全降解消失。但天然蠶絲纖維的降解速度就相對要慢得多,進一步研究發現,這是因為天然蠶絲纖維的β-sheet二級結構含量明顯高于絲素蛋白[42]。研究表明,絲素蛋白的降解受水不溶性silk-Ⅱ和水溶性silk-Ⅰ結構含量的影響,隨著silk-Ⅱ數量的增加,β-sheet結構量的增加,降解時間也增加。通過對β-sheet結構量的增減,可以調控絲素蛋白降解速率至目標材料所需的范圍[43-44]。例如,絲素蛋白薄膜通過乙醇處理,將水溶性silk-Ⅰ轉變為水不溶性silk-Ⅱ結構,從而增加了更多的β-sheet結構,降解速率減慢[4]。相反,絲素蛋白薄膜通過緩慢的空氣干燥過程只含有較少的β-sheet結構,降解速率就會大大加快。此外,超聲治療也被證明可以將silk-Ⅱ轉化為silk-Ⅰ,從而促進絲素蛋白的降解[45]。同時,也有研究表明,將蛋白酶抑制劑整合到絲素蛋白基體系中,使得蛋白酶酶促降解反應被抑制,可以大大降低絲素蛋白的降解速率[46]。這種增強的降解調控也為絲素蛋白在控制藥物釋放的應用開辟了新的可能性。

而在絲素蛋白作為屏障材料的降解研究中,各學者也做了不同的嘗試。Ge?o等[47]對絲素蛋白膜的降解深入研究,通過熱退火法制備出具有高延展性的絲素蛋白/甘油混合膜,并將其與人牙周膜成纖維細胞一起培養7 d后,發現混合膜的降解能力優于純絲素蛋白膜,并且具有較高的親水性,能大大增強細胞的黏附和活力,有望應用于牙周再生。Ko等[48]應用CF4氣體等離子處理獲得了一種同時具有疏水性和親水性的絲素蛋白膜,在有效阻擋軟組織入侵和促進GBR的同時,歷經5個月的生物降解后,仍未發生明顯的收縮和變形,這為絲素蛋白作為GBR屏障材料提供了新的制備工藝參考。

3.3 絲素蛋白屏障材料的機械性能

在GTR或GBR中,屏障材料要求能夠抵抗外界的壓力,維持穩定的支撐空間,并且在臨床操作時要具備一定的抗壓縮拉伸能力,因此對材料具有較高的力學性能要求。絲素蛋白具有優異的力學性能,斷裂應變率4%～26%,極限強度300～740 MPa,韌性70～78 MJ/m3,這為開發絲素蛋白基屏障材料提供了較大優勢[49]。

盡管天然蠶絲具有優異的力學性能,但大多數由再生絲素蛋白溶液直接制備獲得的材料都是弱而脆的,這主要是因為再生材料中缺乏適當的二級結構和層次結構[42]。因此,為了獲得更好的力學性能,研究者嘗試通過重組再生絲素蛋白的弱氫鍵,使絲素蛋白具有自組裝和自修復的能力,自組裝成更大的纖維結構,獲得更優化的分子層次順序和更優異的力學性能[26,43]。研究表明絲素蛋白的濃度、加工溫度、甲醇/鹽處理、水退火處理、孔徑、3D生物打印技術等各種處理都會影響絲素蛋白的力學性能,我們可以通過改變影響因素來增強絲素蛋白的力學性能[49]?？紤]到絲素蛋白生物材料強大的力學性能,研究人員已經將絲素蛋白應用作為承載組織再生的支架材料,特別是在肌肉骨骼組織的再生中[28]。

3.4 絲素蛋白屏障材料的藥物傳遞作用

在口腔組織再生中,干細胞可以被招募并分化成成骨前細胞、前牙周膜細胞和成骨細胞是GTR的重要條件。其中,生長因子在調節干細胞的歸巢和分化中至關重要。在GTR或GBR中,屏障膜通過釋放生長因子調節干細胞從而提高組織增殖能力和骨再生能力。

由于其較慢的降解速率,絲素蛋白已被證明是生物活性藥物傳遞的載體,特別是在骨再生領域[27,52]。為了模仿生理上的骨骼層次,研究者已經研究了各種形態的絲素蛋白,并應用于輸送骨特異性生長因子,如骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、血小板生長因子、基因和酶等[53-54]。

絲素蛋白目前已被用于輸送生物活性分子,特別是BMP-2,因為BMP-2在促進成骨方面起著關鍵作用。研究表明,負載BMP-2的絲素蛋白顆粒成功地誘導了大鼠異位骨的形成,隨著BMP-2的傳遞速率增加,骨密度也隨之增加,同時加載BMP-2的絲素蛋白組骨形成能力優于單獨使用BMP-2組[55]。這強調了絲素蛋白作為一種有效的載體,在提高BMP-2作為藥物傳遞分子促進骨再生的療效方面具有不可或缺的作用。

為了促進成功的骨再生,有效的組織血管化也是一個重要條件。因此,除了BMP-2外,血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在骨再生中起著至關重要的作用。研究發現,持續傳遞VEGF可以促進新生血管的形成和成骨細胞的分化來幫助GBR[56]。Farokhi等[57]制備了一種負載VEGF的凍干絲素蛋白/磷酸鈣底物電紡絲聚(乳酸共乙醇酸)納米纖維,VEGF在體外28 d測量的釋放譜維持生物活性為83%,該傳遞系統在體外具有良好的細胞相容性,增強了成骨細胞的黏附、增殖和堿性磷酸酶活性。在兔顱骨缺損模型中誘導形成8 mm臨界大小的新骨,獲得了良好的骨再生效果。由于VEGF和BMP-2是參與血管生成和成骨的重要因素,也有學者將兩者結合并包裹負載,體內實驗結果表明,雖然BMP-2單獨介導了骨形成,而VEGF觸發了新生血管,但它們的相互作用促進了術后12周的成骨和成血管[58]。

在GTR研究中,Song等[59]通過靜電紡絲法技術將明膠納米球合并到絲素蛋白納米纖維膜中,制備了一種不使用任何有機溶劑的新型纖維納米給藥系統。實驗表明這種納米纖維膜對金黃色葡萄球菌具有良好且持久的抗菌作用,同時該膜能促進牙周膜細胞的附著、擴散和增殖,有望應用于牙周再生。

4 總結與展望

絲素蛋白是一種獨特的兼具生物醫學和力學特性的天然生物材料。與目前臨床上使用的大多數生物可吸收膜相比,絲素蛋白材料生物相容性良好,且有可控的生物降解性,具有更好的組織愈合效果,在生物模型中顯示出良好的骨再生效果。然而,通過傳統方法制備得到的純絲素蛋白膜的力學性能可能無法滿足口腔生物膜的要求,這也阻礙了絲素蛋白作為屏障材料的應用。我們可以通過改進絲素蛋白的制備方法、結合其他材料優化性能、對絲素蛋白進行基因調控以及通過結合新型技術如3D生物打印來更好地克服這一缺點。例如,將絲素蛋白與其他材料如氧化鋅納米粒子、羥基磷灰石納米粒子混合,以及應用靜電紡絲的方法使絲素蛋白膜具有良好的力學性能和適宜的降解率,從而更適合GTR/GBR的臨床應用。

目前絲素蛋白屏障材料仍處于不斷探索和改進的過程中,需要更多的實驗研究來驗證絲素蛋白改性的成果。當然,在屏障膜中加入生長因子可能是絲素蛋白作為GTR/GBR屏障材料的另一種改進。但仍需要更多關于絲素蛋白膜載藥的研究,同時探討如何控制這些生物因子的釋放,從而驗證其在GTR/GBR中的實際效果。

目前關于絲素蛋白屏障材料的研究并不全面,仍需要大量的生物學、臨床研究和進一步的改性研究來解決當前的問題。但是參考目前絲素蛋白的生物特性以及許多關于絲素蛋白屏障膜的基礎實驗,我們認為絲素蛋白是一個很有潛力的蛋白質基屏障材料,具有廣泛的口腔組織再生應用前景。