MXene納米材料在生物醫學應用中促成骨的機制研究

朱昕妍,靳牧涵,嚴菁菁,王美琪,張一玲,馬俊青,袁 俊

MXene是一種新興的二維納米材料,于2011年首次被報道,具有多個原子層,由過渡金屬碳化物、氮化物或碳氮化物組成[1]。其特點是以MAX相陶瓷從層狀結構中提取A族元素獲得二維納米薄片,從其MAX相前驅體中合成了Ti2C、Ta4C3和其他MXenes,展示了三種可能的結構(M2X、M3X2和M4X3)。一般化學式為Mn+1XnTx,“M”是過渡金屬原子,“A”代表元素周期表中的A族元素,而“X”是碳或氮[2]。它具有良好的電化學性能[3]、親水性、機械性能和一些生物學性能如生物相容性[4]、生物降解性[5]、光熱性能[6]、抗菌活性等[7],因此越來越多地被應用于生物醫學領域。近年來已有諸多研究將MXene應用于骨組織工程,但對MXene促進成骨的機制研究較少且尚不明確。因此本文主要總結以往研究中MXene納米材料在骨缺損修復中的相關機制,就這一研究領域的最新進展進行綜述。

1 MXene的制備與生物醫學應用

1.1 MXene的制備

合成MXene材料的方法主要分為“自上而下”和“自下而上”兩種[8]。

“自上而下”法是目前常用的MXene制備方法,分為刻蝕和分層2個階段。①刻蝕:使用強腐蝕劑(通常是HF[9])來刻蝕3D MAX相以獲得多層堆疊的MXene,M—A鍵一般比M—X鍵弱,會選擇性地刻蝕M—A鍵[10]。然而使用HF制造MXene會對人體和環境造成損害,且會在材料表面引入大量F-基團,使其難以與生物分子偶聯[11]。因此無氟的制備方法更有利于制備表面端基可控的MXene材料[12]。2019年,Li等[13]使用熔融狀態下的ZnCl2刻蝕Ti3AlC2制備MXene,首次制備出表面為Cl終端基團的MXene材料。之后,該團隊進一步提出了一種Lewis酸熔鹽(如FeCl2、CuCl2、AgCl等)刻蝕MAX相(如Ti2AlC、Ti3AlC2、Nb2AlC等)合成MXene的通用策略[14]。②分層:刻蝕后形成的多層MXene,其層間為較弱的范德華力或者氫鍵,需要進一步利用有機溶劑(如二甲基亞砜[15]、四丁基氫氧化銨[16]等)插層或機械振蕩(如超聲波)[17],增加MXene薄膜之間的距離,從而獲得少層或單層MXene納米片[18]。

“自下而上”法是在原子水平上控制晶體生長,形成2D MXene材料,常采用化學氣相沉積法(chemical vapor deposition,CVD)[19],即以甲烷氣體(CH4)為碳源,以銅鉬箔為襯底,在1 085 ℃以上的溫度用化學氣相沉積法合成超薄碳化鉬(MoC2)。但是該方法制備的MXene材料尺寸太大,且缺乏表面官能團,不利于其在生物醫學領域的應用。

此外,研究者們還報道了模板法[20]和等離子體增強脈沖激光沉積法(plasma enhanced pulsed laser deposition,PEPLD)[21]來合成MXene。

1.2 MXene的性能

近年來,MXene材料的獨特生物醫學特性受到研究者們的重視:①MXene具有良好的抗菌性能,它可以通過氧化應激反應、吸附聚集細菌、銳邊損傷細胞膜、內吞或滲漏進入微生物、化學破壞細胞結構等方式實現抗菌效應[7];②部分MXene在適合波長的光照射下,可以產生氧自由基(reactive oxygen species,ROS),有利于其在光動力治療中的應用[22];③在近紅外光(near infrared ray,NIR)的第一和第二生物窗口具有高的光吸收和光熱轉換能力[5],可用于深層組織的光熱治療(photothermal therapy,PTT)和光聲(photoacoustic,PA)成像[23-24];④MXene量子點(MXene quantum dots,MQDs)利用材料表面缺陷誘導發光或尺寸效應誘導量子限制實現發光特性[25],可作為潛在的放射標記點;⑤MXene具有良好的生物相容性,相對較低的細胞毒性和體內毒性[26];⑥MXene的尺寸大小范圍在納米級到微米級[2],超薄2D平面結構和高表面積體積比使其成為良好的藥物載體[27-28];⑦部分MXene材料具有良好的生物可降解性[5,29];⑧部分MXene(如Ta4C3等)具有良好的CT成像效果[30-31]。因此,MXene在生物傳感、生物成像、腫瘤治療、組織再生、抗菌等生物醫學領域已有較為深入的研究成果。

1.3 MXene的應用

1.3.1 MXene在皮膚組織工程中的應用 Liu等[32]的實驗證實,MXene能夠增強分子間氫鍵,并通過近紅外效應提供抗菌能力,促進傷口愈合。此外,MXene所具備的光電和光熱效應亦有利于其在皮膚組織工程中應用[1]。

1.3.2 MXene在神經組織工程和神經組織再生中的應用 Guo等[33]制備了Ti3C2TxMXene納米材料,在離體實驗中證實其對初級小鼠神經干細胞有促黏附、促增值、促分化作用,表明其在神經再生與組織工程中具備應用價值。

1.3.3 MXene在心肌組織工程中的應用 電生理是心肌組織工程的關鍵環節。2023年,Lee等[34]設計制作了Ti3C2TxMXene黏性水凝膠,并證實其具有高導電性、彈性、高組織黏附性等理化特性,并可誘導體外心肌細胞成熟,在心肌組織工程中具備可靠前景。

1.3.4 MXene在骨組織工程和骨再生中的應用 MXene具備優良的理化生物學性質,可以通過支架、膜、涂層等多種方式介導體內外骨生成[1]。

1.3.5 其他 MXene在血管生成等領域的應用亦有報道[35]。

2 MXene納米材料促進骨生成的研究及機制

MXene已被用于多種組織缺損的研究,如心血管、皮膚、神經組織等[36]。近年來已有研究聚焦于MXene骨組織工程應用。MXene納米材料可以通過增強基底材料的理化性質促進細胞增殖改建、在基因以及分子水平提高成骨相關細胞的活力,并且有利于血管組織再生,加速成骨進程[1]。

2.1 MXene納米材料對成骨相關細胞的影響

2.1.1 促進細胞增殖和黏附 骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)能夠在特定環境中分化為成骨細胞,促進BMSCs的增殖與黏附,進而促進骨缺損的修復。Jang等[37]將2D片層狀Ti3C2MXene納米微粒應用于離體的人類間充質干細胞(human mesenchymal stem cells,hMSC),顯示短時低劑量的Ti3C2MXene(<20 μg/mL)可以促進體外干細胞的增殖。此外Huang等在激光共聚焦顯微鏡下觀察hMSC在有MXene存在的情況下,細胞伸出偽足增加,向周圍擴展趨勢提高,從而對材料擁有更大的黏附性,細胞密度提升,增殖更加活躍[37]。

血管在骨骼塑造和穩態中起著至關重要的作用[38]。血管內皮細胞還具有信號傳導能力,調節骨再生[39]。Yin等[26]在人類臍內皮靜脈細胞(human umbilical endothelial vein cells,HUVECs)離體實驗中報道,Nb2C MXene功能化支架能夠加速HUEVC的遷移能力,促進血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-B和堿性成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor 2,FGF2)的表達,誘導具有血管生成潛力的管狀結構生成。在體實驗也證實了其優異的促血管生成能力。除此之外,MXene還能通過傳遞生理神經電信號增加血管生成[40]。Wang等[41]將VEGF納入MXene進行可控輸送,證實MXene可以促進血管生成效應。

2.1.2 促進細胞分化 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性用于代表早期成骨細胞的分化能力,即活性越高,分化能力越強[42]。Jang等通過檢測ALP,觀察到與在蓋玻片上生長的細胞相比,低濃度Ti3C2MXene納米玻璃材料顯著提高了hMSC的ALP活性,證明了MXene存在會使hMSC的分化活性增加。隨著時間的推移,第7天時生長培養基中的MXene薄膜上生長的細胞ALP 活性與在蓋玻片上培養的細胞的ALP活性趨向一致[37]。同樣,Zhang等[43]通過檢測小鼠前成骨細胞系MC3T3E1 ALP含量,也觀察到在第4天以及第7天,使用碳化鈦MXene納米材料組明顯具有較高的分化活性。

2.1.3 促進細胞橢球體形成 近年來有研究發現,細胞在特定的情況下可以呈現類似液滴形的球狀體或橢球狀體,可以增加細胞存活和活性[44]。Jang等發現MXene顆?？梢宰鳛檎澈蟿└街诩毎|上,并在細胞遷移過程中隨細胞移動,從而促進hMSC形成細胞橢球體。這種現象可能是由于MXene顆粒的親水性和生物相容性使細胞黏附相關蛋白具有良好的相容性[45]。

2.1.4 促進細胞礦物質沉積 羥基磷灰石在間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)的增殖和成骨分化中起重要作用。研究表明,MXene也可以促進細胞外礦物質如羥基磷灰石沉積,從而提高成骨速度。Awasthi等采用體外生物礦化實驗檢測PCL-MXene復合纖維的羥基磷灰石成核性能,發現PCL-MXene上面羥基磷灰石的沉積顯著多于單純的PCL。在羥基磷灰石晶體中,鈣、磷沉積與PCL-MXene電紡絲纖維表面的適當物質的量的比(≈1.6)與羥基磷灰石晶體的標準值基本一致,證明了PCL-MXene復合纖維的羥基磷灰石成核性能[46]。

2.2 MXene納米材料促成骨的材料學機制研究

2.2.1 親水性 材料表面的親水性可以大幅度提高細胞生物學功能,如細胞黏附性及增殖活性。Awasthi等通過測量水接觸角,發現MXene的含量越高,水接觸角越小,材料的潤濕性越大。增加潤濕性可以增加PCL-MXene復合電紡纖維中的細胞黏附和增殖[46]。隨著MXene重量百分比的增加,復合物的潤濕性增強,這可能與MXene末端羥基或含氧基團的親水性有關。MXene修飾的材料表面存在極佳的親水性以及粗糙度,能夠大幅度提高細胞黏附,吸引間充質干細胞定植[47]。

2.2.2 吸附蛋白質 在對MXene結構相似的石墨烯進行分子化學研究時,Kumar團隊[48]發現蛋白質中的RGD序列被空位缺陷的石墨烯表面所吸引,其中單空位對酯基有吸引力,從而促進蛋白質的吸附,增加材料表面的親水性,而蛋白質的RGD序列可以和整合素結合。與石墨烯相似,MXene材料也含有帶負電的含氧官能團[49]。也就是說,這種性質使其一方面可以增加材料表面的親水性,另一方面,蛋白質的RGD序列可以作為配體和細胞絲狀偽足上的整合素結合,促進細胞與材料表面的黏附[48]。

2.2.3 電生理作用 天然骨的生物電已被報道為調節代謝活動的關鍵因素之一[50],可以通過壓電、熱電和鐵電等電效應[51-52]影響成骨細胞、骨細胞和破骨細胞[53],進而影響骨愈合、骨生長和骨重塑等生理過程[54-56]。Hu等[57]制備了MXene/絲蛋白(silk fibroin,RSF)水凝膠,證實其可通過Ca2+/CALM信號傳導通路促進間充質干細胞離體增殖、遷移及成骨分化及血管新生,并在小鼠離體模型中觀測到MXene/RSF促進小鼠顱骨模型骨缺損修復,表明電生理亦可能是MXene促進骨組織再生的重要途徑。

2.3 MXene納米材料促成骨的分子學機制研究

2.3.1 調控成骨細胞基因表達 前期許多MXene研究關注到了MXene對細胞基因表達的影響。Runx2 與成骨細胞中ALP、骨鈣素(osteocalcin,OCN)、Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ,COL-Ⅰ)、骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)及骨橋蛋白(osteopontin,OPN)等主要成骨分化相關基因的表達密切相關,這是因為以上基因的啟動子序列中都存在成骨特異性順式元件(osteogenic specific cis element,OSE),Runx2能與之結合,從而激活這些相關基因的表達[58]。Jang等使用MXene微粒體外處理間充質干細胞后,各成骨相關基因表達均有所上升。這不僅包括Runt相關轉錄因子2,早期成骨相關基因OPN基因、中期成骨相關基因OCN基因,還有晚期成骨相關基因BSP基因[37]。MXene快速誘導早期標志物的表達在超過1周時下降;中晚期成骨標志物的表達在2周內更加活躍。

2.3.2 調控成骨信號通路 骨骼生成受多種合成代謝信號通路的調節,包括Wnt/β-catenin、BMP/Smad信號通路、Hedgehog、FAK、ERK、PI3K/AKT等相關信號通路。這些信號通路通過調控 Runx2 的表達影響骨形成。Runx2及Osterix被認為是調控成骨分化的重要節點,參與組成該成骨分化網絡的信號通路都直接或間接作用于該節點并最終調控其下游靶基因的表達,從而調節成骨細胞分化及骨形成[59]。

Wnt/β-catenin信號通路:Wnt/β-catenin信號通路是調控BMSCs分化為成骨細胞較為重要的一條信號通路。Cui等[60]研究發現,Ti3C2TxMXene納米薄片通過調控HIF-1α/Wnt信號通路促進人牙周膜細胞(human periodontal ligament cells,hPDLC)成骨分化,加速牙周組織的再生。研究顯示,在Ti3C2Tx(60 mg/L)存在下,β-catenin顯著上調。此外,Axin2(一種Wnt信號負調節因子)的表達增強。

BMP/Smads信號通路:BMP/Smads 信號通路是激活成骨細胞分化及骨形成十分重要的一條通路。研究表明,BMPs通過結合細胞膜外特異性受體進而激活BMP/Smads信號通路,使下游的Smads蛋白(如Smad1、5)發生磷酸化,可將TGF-β信號由細胞膜傳至胞核,然后進一步啟動成骨細胞特異性轉錄因子基因(如Runx2、Osterix等)轉錄,Runx2、Osterix繼續促進成骨分化相關基因ALP、OCN、COL-Ⅰ、BSP及OPN等的表達[61]。Du使用三維打印的MXene復合支架刺激體外BMSCs的成骨分化,檢測rBMSCs中成骨分化相關基因ALP、COL-Ⅰ、BMP-2和Runx2的mRNA水平,發現納米片修飾材料上成骨分化相關基因的表達量高于未修飾組[62]。這些發現證明了MXene3D復合支架可通過BMP/Smads信號通路進行骨誘導。

3 結 語

本文聚焦于新興二維納米材料MXene在骨組織再生中促成骨的作用機制,介紹了MXene的基本信息和制備方法,分析其理化生物學性質,展示其在生物醫學領域的應用情況及應用前景,并從細胞學、材料學、分子學匯總報道了MXene成骨相關機制。

MXene材料本身具備獨特的理化生物學性質,能夠通過多種機制調控骨組織再生重建,在骨組織再生中具備良好應用前景。對促骨組織修復再生具有良好臨床應用前景。但是MXene材料在臨床應用中仍存在很大的挑戰:①應明確復合材料支架在體內的生物降解途徑及其潛在的長期毒性,尤其是其生物分布和代謝途徑仍需進行進一步的研究。②應進一步明確復合支架材料表面與組織作用情況,研究高效的表面改性方法和環境友好的材料制備手段,提高臨床應用效率。③進一步明確不同尺寸、成分、形態的復合支架材料在體內環境下的性能變化,尤其是生理環境下的穩定性、氧化性等。目前,用于組織再生的MXene納米材料還處于臨床前階段,仍有待于進一步的研究來推廣其臨床應用。