槐角黃酮調控miR-199a-3p/p38MAPK/NF-κB對乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和炎癥因子分泌的影響

王維伊,陳 冉,楊翊檸

(江蘇省腫瘤醫院/江蘇省腫瘤防治研究所/南京醫科大學附屬腫瘤醫院 檢驗科,江蘇 南京,210009)

乳腺癌是世界上最常見的威脅女性生命健康的惡性腫瘤,盡管激素療法、化療和靶向治療等抗癌療法已經取得長足的發展,乳腺癌患者預后已有所改善,但仍然面臨著耐藥性、副作用較大等挑戰[1]。中草藥可提高癌癥治療效果、延長生存期,其在癌癥預防和治療中的作用越來越受到重視?；苯屈S酮是中藥槐角的主要活性成分,研究[2-3]報道,槐角黃酮除具有抗氧化、抗炎活性外,在肺癌、肝癌中也表現出抗腫瘤活性。然而,槐角黃酮對乳腺癌的抗癌作用及其機制尚不清楚。微小RNA(miRNA)被認為是癌癥防治的潛在靶標,既往研究[4-6]表明,乳腺癌中微小RNA-199a-3p(miR-199a-3p)表達下調,并通過調節乳腺癌細胞增殖、凋亡和運動能力發揮抑癌作用。炎癥參與腫瘤細胞與微環境的相互作用,在腫瘤的發生、進展和轉移中具有促進功能[7]。本研究從細胞增殖、遷移、侵襲和炎癥因子分泌等多角度探討槐角黃酮對乳腺癌的抗癌作用,分析其機制是否與調控miR-199a-3p表達相關,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

乳腺癌細胞BT549購自中國科學院上海細胞庫; miR-NC、miR-199a-3p mimics、anti-miR-199a-3p、anti-miR-NC購自南京金斯瑞生物公司; 中藥槐角由本院中藥房提供; Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司; CCK-8試劑盒購自南京凱基生物; 腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、IL-1β酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測試劑盒購自北京索萊寶生物公司; Transwell小室購自美國康寧公司; Trizol試劑、miRNA第一鏈cDNA試劑盒、miRNA qPCR試劑盒(SYBR Green)購自北京天根生化科技公司; 兔源磷酸化p38 MAPK(p-p38MAPK)抗體(3438-100)購自武漢艾美捷生物公司; 兔源磷酸化核因子κB-p65(p-p65)抗體(LM-3485R)購自上海聯邁科技公司; 山羊抗兔IgG二抗(ab205718)、兔源基質金屬蛋白酶2(MMP2)多克隆抗體(ab97779)、兔源β-actin多克隆抗體(ab210083)購自美國Abcam公司; 兔源MMP9多克隆抗體(AF5228)購自美國affinity公司。

表1 槐角黃酮對BT549細胞增殖、遷移和侵襲的影響

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和分組:BT549細胞接種在DMEM培養基中,放入37 ℃、含5% CO2的濕潤培養箱中培養,培養基中補充1%青鏈霉素混合液和10%胎牛血清。將BT549細胞接種于6孔板后進行過夜培養,隨后利用Lipofectamine 2000分別將miR-NC、miR-199a-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-199a-3p轉染至BT549細胞。轉染48 h后收集各組細胞,實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測miR-199a-3p水平,分析過表達或抑制效果。參照陳明珠等[8]實驗方法制備槐角黃酮提取液。將含1、5、10 mg/mL的槐角黃酮[2]培養液分別與BT549細胞孵育48 h,依次設為低、中、高劑量組; 轉染miR-NC、轉染miR-199a-3p mimics的BT549細胞依次設為miR-NC組、miR-199a-3p組; 采用含10 mg/mL的槐角黃酮培養液孵育轉染anti-miR-NC、轉染anti-miR-199a-3p細胞48 h,依次設為高劑量+anti-miR-NC組、高劑量+anti-miR-199a-3p組。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活力:將未轉染的BT549細胞以及轉染miR-NC、轉染miR-199a-3p mimics、轉染anti-miR-NC、轉染anti-miR-199a-3p的BT549細胞分別接種于96孔板,根據實驗分組加入含對應濃度槐角黃酮的培養液孵育。溫育48 h后,棄去培養液。各孔內加入10 μL CCK-8試劑,再孵育4 h。酶標儀測量450 nm處的吸光度(A)以表示細胞活力。

1.2.3 克隆形成實驗檢測克隆能力:磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌各組BT549細胞2次,以每孔5×102個的密度接種6孔板。每周更換2次培養液。培養箱孵育2周后,采用甲醇固定細胞集落,采用0.1%結晶紫染色。計數超過50個細胞的集落。

1.2.4 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲:侵襲測定采用包覆基質膠的Transwell小室,遷移測定采用未包覆基質膠的Transwell小室。PBS洗滌各組BT549細胞2次,將其重懸在血清培養液中。將200 μL細胞懸液、500 μL含10%胎牛血清培養液分別加入上室、下室。培養箱孵育24 h,用棉簽去除未穿膜細胞。采用4%多聚甲醛對穿膜細胞進行固定后,0.1%結晶紫染色15 min。最后,顯微鏡下計數膜上隨機5個視野的細胞數,用平均值表示細胞遷移或侵襲數量。

1.2.5 ELISA法檢測TNF-α、IL-6以及IL-1β水平:細胞培養結束后,收集細胞培養液上清,參照ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-6以及IL-1β分泌水平。

表2 槐角黃酮對BT549細胞炎癥因子分泌的影響 ng/L

1.2.6 RT-qPCR檢測miR-199a-3p表達:Trizol法獲得總RNA后,分別以miRNA第一鏈cDNA試劑盒、miRNA qPCR試劑盒進行逆轉錄和RT-qPCR。采用2-ΔΔCt法計算miR-199a-3p表達量。

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測基質金屬蛋白酶2(MMP2)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、p-p38MAPK、p-p65蛋白表達:RIPA裂解法獲得細胞蛋白后,十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離蛋白,并濕轉至PVDF膜上。隨后,5%脫脂奶粉中孵育膜2 h阻斷非特異性結合,利用針對MMP2(1∶2 000稀釋)、MMP9(1∶1 000稀釋)、p-p38MAPK(2 μg/mL)、p-p65(1∶200稀釋)、β-actin(1∶3 000稀釋)的抗體在4 ℃孵育10 h。室溫下,在酶標二抗的稀釋液中孵育1 h。最后,采用底物化學發光 ECL法進行顯色反應,采用Image J軟件分析目的條帶相對于β-actin條帶灰度值。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 槐角黃酮對BT549細胞增殖、遷移和侵襲的影響

與正常對照組比較,低、中、高劑量槐角黃酮處理后BT549細胞A值、克隆數、MMP2和MMP9蛋白表達、遷移數和侵襲數均降低,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1、表1。

A:細胞克隆實驗(放大200倍); B:Western blot檢測MMP2、MMP9蛋白的表達。

2.2 槐角黃酮對BT549細胞炎癥因子分泌的影響

與正常對照組比較,低、中、高劑量槐角黃酮處理后BT549細胞培養液中TNF-α、IL-6以及IL-1β水平降低,差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

2.3 槐角黃酮對miR-199a-3p表達的影響

與正常對照組比較,低、中、高劑量槐角黃酮處理后BT549細胞miR-199a-3p表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05),見表3。

表3 槐角黃酮對miR-199a-3p表達的影響

2.4 過表達miR-199a-3p對BT549細胞增殖、遷移和侵襲以及炎癥因子分泌的影響

轉染miR-199a-3p mimics后,BT549細胞miR-199a-3p表達水平與轉染miR-NC比較升高,差異有統計學意義(P<0.05),表明轉染miR-199a-3p mimics可促進miR-199a-3p表達。與miR-NC組比較,miR-199a-3p組BT549細胞A值、克隆數、MMP2和MMP9蛋白表達、遷移數和侵襲數均降低,細胞培養液中TNF-α、IL-6以及IL-1β水平降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2、表4。

表4 miR-199a-3p抑制乳腺癌細胞BT549增殖、遷移和侵襲以及細胞炎癥反應

A:細胞克隆實驗(放大200倍); B:Western blot檢測MMP2、MMP9蛋白的表達。

2.5 抑制miR-199a-3p表達可逆轉槐角黃酮對BT549細胞增殖、遷移、侵襲以及炎癥因子分泌的影響

與高劑量+anti-miR-NC組比較,高劑量+anti-miR-199a-3p組BT549細胞miR-199a-3p表達水平降低,細胞A值、克隆數、MMP2和MMP9蛋白表達、遷移數和侵襲數均升高,差異有統計學意義(P<0.05),細胞培養液中TNF-α、IL-6以及IL-1β水平升高,差異也有統計學意義(P<0.05),見圖3、表5。

表5 抑制miR-199a-3p表達可逆轉槐角黃酮對BT549細胞增殖、遷移、侵襲以及炎癥因子分泌的影響

A:細胞克隆實驗(放大200倍); B:Western blot檢測MMP2、MMP9蛋白的表達。

2.6 p38MAPK/NF-κB信號通路蛋白的表達水平變化

與正常對照組比較,高劑量組BT549細胞p-p38MAPK和p-p65水平降低,差異有統計學意義(P<0.05); 與高劑量+anti-miR-NC組比較,高劑量+anti-miR-199a-3p組BT549細胞p-p38MAPK和p-p65水平升高,差異有統計學意義(P<0.05),見圖4、表6。

表6 NF-κB信號通路蛋白的表達水平的變化

圖4 Western blot檢測p-p38MAPK、p-p65蛋白的表達

3 討 論

本研究探討了槐角黃酮對乳腺癌細胞生物學行為的影響,結果顯示,槐角黃酮可降低乳腺癌BT549細胞活力和克隆能力,減少遷移和侵襲細胞數,且這種抑制作用表現出顯著的劑量依賴效應,表明槐角黃酮具有抗乳腺癌作用?；|金屬蛋白酶(MMPs)是Ca2+依賴內肽酶,其能夠降解細胞外基質(ECM),促進癌細胞侵襲和轉移。此外,MMP2和MMP9屬于MMPs的明膠酶成分,能夠促進基底膜和ECM降解和腫瘤轉移[9]。本研究表明,槐角黃酮可以呈劑量依賴性方式來降低BT549細胞中MMP2和MMP9蛋白表達水平,這些影響與槐角黃酮對BT549細胞的遷移和侵襲的抑制作用吻合。此外,研究[10]表明炎癥與癌癥的發生、發展和擴散密切相關,在IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子刺激下,NF-κB等信號通路可激活并調控靶基因表達,進而促進癌細胞的生存、增殖、侵襲和轉移。本研究顯示,槐角黃酮以劑量依賴的方式抑制IL-6、IL-1β、TNF-α分泌,表明槐角黃酮可抑制乳腺癌的炎癥反應。

miRNA是短鏈非編碼RNA分子,其表達異?？烧{控靶基因表達,進而影響細胞增殖、血管生成、侵襲轉移、細胞凋亡、放化療耐藥、周期分布等腫瘤生物學過程[11]。目前研究[12]表明,中草藥的抗癌作用可能與調控miRNA表達相關,例如異澤蘭黃素可抑制miR-21的表達,而miR-21通過抑制YAP1來介導異澤蘭黃素對腎細胞癌的抗遷移和促凋亡作用。既往研究[2-3]證實,槐角黃酮可以通過調控miR-342-3p、miR-188-5p表達來抑制肝癌、肺癌進展。本研究檢測到槐角黃酮處理后BT549細胞中miR-199a-3p表達水平顯著上調,提示槐角黃酮的抗乳腺癌作用可能依賴miR-199a-3p表達增加。據報道,miR-199a-3p低表達參與前列腺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤進展[13]。過表達miR-199a-3p可通過抑制TFAM表達來降低乳腺癌細胞對順鉑的耐藥性[14]。本研究中,過表達miR-199a-3p可下調MMP2和MMP9蛋白表達,抑制細胞增殖、遷移和侵襲能力,與HUANG R Y等[15]報道的結果一致。此外,過表達miR-199a-3p還可抑制IL-6、IL-1β、TNF-α分泌。為了證實槐角黃酮的抗癌作用是通過上調miR-199a-3p表達實現的,本研究采用槐角黃酮處理轉染anti-miR-199a-3p的BT549細胞,結果顯示,抑制miR-199a-3p表達可顯著削弱槐角黃酮對BT549細胞增殖、遷移、侵襲和促炎因子分泌的抑制作用,表明槐角黃酮的抗乳腺癌作用至少部分與調控miR-199a-3p表達有關。

p38MAPK/NF-κB通路在調節細胞凋亡、分化、增殖以及炎癥反應中起著重要作用[16]。研究[17]表明,右美托咪定可以通過抑制p38MAPK/NF-κB信號通路來增強卵巢癌大鼠的免疫功能,抑制卵巢癌的形成。外泌體膜聯蛋白Ⅱ能夠誘導p38MAPK/NF-κB通路活化,并增加IL-6和TNF-α的分泌,促進血管生成和乳腺癌轉移[18]。本研究中,槐角黃酮處理可抑制p38MAPK和p65的磷酸化,表明槐角黃酮能夠抑制p38MAPK/NF-κB通路活化。下調miR-199a-3p表達可逆轉槐角黃酮p38MAPK/NF-κB通路的抑制作用,說明槐角黃酮可能通過上調miR-199a-3p表達、抑制p38MAPK/NF-κB通路發揮抗乳腺癌作用。

綜上所述,槐角黃酮可抑制乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和炎癥反應,其機制可能是通過上調miR-199a-3p表達、抑制p38MAPK/NF-κB通路實現的,這初步揭示了槐角黃酮的抗乳腺癌作用和機制,為抗乳腺癌藥物的開發提供了新方向。