黃曲霉對不同含水量新疆鮮食核桃活性氧代謝的影響

王園夢，白羽嘉*，馮作山，王潔，喻蘋

（1.新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆果品采后科學與技術重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052）

核桃，又稱胡桃、萬歲子等，屬胡桃科胡桃屬植物[1]。中國核桃栽培面積居世界第一，年產量在10 萬t以上[2]。核桃仁營養成分均衡，并具有健胃、補血、潤肺、益腎和補腦等多種功效[3]。新疆核桃雖然面積和產量優勢不明顯，但其已經建成以“溫185”、“新2 號”品種為主的全國最大的薄皮核桃產區[4]。目前，去掉青皮直接出售的鮮食核桃因其口味新奇、口感細膩，且營養價值較高，越來越受到人們的喜愛。在中國，鮮食核桃的消費熱度和需求量越來越高，銷售量每年都不斷增加。研究發現，干制核桃的營養價值、含水量及代謝水平均低于鮮食核桃，在自然條件下影響霉菌生長繁殖的主要因子是環境水分和環境溫度，所以在自然環境下鮮食核桃受到霉菌污染而變質的可能性比干制核桃更高[5]，這大大降低了鮮食核桃的營養價值和市場價值。

黃曲霉菌（Aspergillusflavus）是一種真菌，它的重要代謝產物黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）因其致癌、致畸、致突變性，已成為國民健康的重要威脅。黃曲霉是自然環境中較為常見的霉菌，其孢子可擴散至空氣傳播[6]，經常在種植、貯藏、加工和運輸過程污染玉米、花生等富含脂肪酸的糧食及各類堅果[7-8]，在適宜的環境條件下會產生多種次級代謝產物[9]。當前關于黃曲霉菌對花生、玉米等糧食產物的抗病性的研究及報道較多[10]，但很少有學者研究黃曲霉菌對核桃侵染后的變化。故研究黃曲霉菌污染后鮮食核桃的某些生理代謝機制至關重要，可為進一步控制鮮食核桃采后病害提供科學依據。

在合適的生理條件下，植物體內活性氧的各種相關酶及其他水溶性、脂溶性的抗氧化劑等物質可形成自身抗氧化防御系統，使氧化性損傷與抗氧化防御系統處于一種動態平衡[11]。當外界環境發生變化時，會導致植物體內的動態平衡被破壞，活性氧累積會導致膜脂發生過氧化反應，不斷攻擊植物細胞，導致植物細胞膜發生不可逆損害，從而導致植物體受到傷害[12-13]。為從生理生化方面解釋植物的抗性機理，近年來，人們越來越重視研究植物的抗病性與活性氧及細胞內保護酶系統的關系，先后發現黃瓜、水稻、小麥、玉米、茭白等多種植物受到病原微生物感染后，其體內活性氧代謝及防御酶系統的活性發生變化，并與植物的抗病性相關[14-15]。本研究以新疆薄皮鮮食核桃為試材，將黃曲霉菌接種于不同含水量的新疆薄皮鮮食核桃上，研究黃曲霉菌侵染采后新疆薄皮鮮食核桃的活性氧代謝，分析活性氧代謝關鍵酶活性變化規律，從活性氧的角度解釋新疆薄皮鮮食核桃抵御病原菌侵染的作用機制，以期為黃曲霉菌侵染采后鮮食核桃發生病變的發生機理以及采后防病害、保鮮提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮食核桃：來自于新疆阿克蘇地區溫宿縣的“新2”薄皮核桃，采摘后在無菌條件下剝去青果皮和外殼，取無菌狀態的新鮮核桃仁。黃曲霉菌：分離于自然霉變的核桃仁果實上，純化后馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）保存。

冰乙酸、氫氧化鈉、氨水、無水乙醇、無水乙酸鈉、雙氧水（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；α-萘胺、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉、還原型輔酶Ⅱ二鈉、聚乙烯吡咯烷酮-K30、聚乙二醇辛基苯基醚、氯化硝基四氮唑藍、氧化性谷胱甘肽（均為分析純）：上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 儀器與設備

NBCJ-B 型無菌操作臺、MHP-250 型恒溫霉菌培養箱：上海鴻都電子科技有限公司；LDZX-50KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；FA2104N型電子天平：上海民橋精密科學儀器有限公司；XHFDY 型高速分散器：寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-16G 型高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；TU-1810PC 型紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；DHS-16 鹵素水分測定儀：上海菁海儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 新疆薄皮鮮食核桃仁預處理

對照組：隨機抽取100 組鮮食核桃仁測量初始含水量后，根據初始含水量，采用烘干的方式，將核桃仁的含水量調整至30%、25%、20%、15%、10% 并置于4 ℃恒溫冰箱24 h 使含水量平衡。將同一含水量的核桃仁分別稱取20 g、3 組放入滅好菌的組培瓶中，作為平行樣品。將稱取好的不同含水量核桃仁接種0.4 mL無菌水。接種后放入（28±1）℃霉菌培養箱進行培養。培養至第3 天開始取樣，每隔1 d 取樣1 次，取至第15 天，用于后續測量指標。

試驗組：測量鮮食核桃仁的初始含水量，根據初始含水量將核桃仁用烘干的方式，將核桃仁的含水量調整至30%、25%、20%、15%、10%，放入4 ℃恒溫冰箱24 h 使水分平衡。將同一含水量的核桃仁分別稱取20 g、3 組放入滅好菌的組培瓶中，作為平行樣品。將稱取好的不同含水量核桃仁接種0.4 mL、濃度為1.0×106cfu/mL 的黃曲霉菌孢子懸浮液。用移液槍接種后放入（28±1）℃霉菌培養箱進行培養。培養至第3 天開始取樣，每隔1 d 取樣1 次，取至第15 天，用于后續測量指標。

1.3.2 丙二醛和O2-產生速率的測定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量：每克核桃仁樣品中MDA 的含量，以μmol/g FW 表示，具體方法參考曹建康等[16]的測定方法。超氧陰離子產成速率的測定參考曹建康[16]等的測定方法。

1.3.3 活性氧代謝相關酶活性的測定

過氧化物酶（peroxidase，POD）活性、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、抗壞血酸過氧化物酶（aseorbateperoxidase，APX）活性參考曹建康等[16]的方法進行測定。

1.3.4 還原型谷胱甘肽含量與谷胱甘肽還原酶活性測定

谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活性的測定參考曹建康等[16]的測定方法，還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量參考曹建康等[16]的方法測定。

1.4 數據統計與分析

采用Origin 2018b 64Bit 和IBM SPSS Statistics 25處理試驗數據并作圖，試驗組均采用3 次試驗，取平均值。

2 結果與分析

2.1 黃曲霉侵染對不同含水量的鮮食核桃仁丙二醛和超氧陰離子產成速率的影響

黃曲霉侵染不同含水量鮮食核桃仁后對MDA 含量的影響如表1 所示。

表1 黃曲霉侵染不同含水量鮮食核桃仁后對MDA 含量的影響Table 1 Effect of Aspergillus flavus on malondialdehyde（MDA）after infecting fresh walnut with different water content

由表1 可知，試驗組中，含水量為10%、15%、30%的核桃仁隨著侵染時間的延長，MDA 含量整體呈現先上升后下降的趨勢，含水量20%的核桃仁隨著侵染時間的延長MDA 含量出現先下降后上升最后下降的趨勢，含水量為25% 的核桃仁隨著侵染時間的延長MDA 含量變化趨勢不明顯。含水量10%的試驗組在第7 天出現峰值，MDA 含量為0.003 40μmol/g FW。含水量15% 的試驗組在第13 天出現峰值，為0.002 96μmol/g FW。含水量25%和30%的試驗組變化趨勢明顯，均在第7 天出現峰值，MDA 含量為0.008 40μmol/g FW 和0.001 56μmol/g FW，分別是各對照組同一天MDA 含量的3.70 倍和2.20 倍。對比發現，含水量25%的試驗組MDA 含量變化最明顯。

黃曲霉侵染不同含水量鮮食核桃仁后對超氧陰離子產生速率的影響如表2 所示。

如表2 所示，不同含水量的核桃仁隨著侵染時間的延長超氧陰離子產生速率整體呈現先上升后下降的趨勢，且試驗組不同含水量鮮食核桃仁的超氧陰離子產生速率均高于對照組。含水量10%和20%的試驗組，均在第13 天出現峰值，超氧陰離子產生速率分別為43.79、57.19 nmol/（min·g FW），是侵染初期的2.31、5.53 倍，是各對照組同一天超氧陰離子產生速率的8.02 倍和11.30 倍。含水量15%、25%、30%的試驗組均在第11 天出現峰值，超氧陰離子產生速率分別為50.95、89.23、58.70 nmol/（min·g FW），是侵染初期的2.01、4.40、3.51 倍，分別是各對照組同一天超氧陰離子產生速率的11.38、11.64、9.33 倍。綜合對比發現，含水量25%的試驗組超氧陰離子產生速率變化最明顯。

2.2 黃曲霉侵染對不同含水量的鮮食核桃仁活性氧代謝相關酶活性的影響

黃曲霉侵染不同含水量鮮食核桃仁后對CAT 活性的影響如表3 所示。

表3 黃曲霉侵染不同含水量鮮食核桃仁后對CAT 活性的影響Table 3 Effect of Aspergillus flavus on catalase（CAT）after infecting fresh walnut with different water content

如表3 所示，不同含水量的核桃仁隨著侵染時間的延長CAT 的活性整體上出現先上升后下降的趨勢。說明核桃仁在受到黃曲霉侵染后，為保護自身，過氧化氫酶活性增強。但隨著侵染時間延長，受到黃曲霉脅迫強度增強過氧化氫酶活性被抑制，呈逐漸下降趨勢。試驗組在9～13 d 時出現峰值，CAT 活性分別為32.48、38.67、49.11、133.00、50.89 U。根據CAT 活性峰值的不同，可以看出在核桃仁含水量為25% 時，CAT 活性達到最高，是含水量為10%的核桃仁峰值的4.09 倍，是其對照組在同一天的CAT 活性的5.44 倍。而且在侵染的第13 天出現最高值，說明25% 含水量的核桃仁受到病害的程度最大，抗病性也較強。

黃曲霉侵染不同含水量鮮食核桃仁后對POD 活性的影響如表4 所示。

表4 黃曲霉侵染不同含水量鮮食核桃仁后對POD 活性的影響Table 4 Effect of Aspergillus flavus on peroxidase（POD）after infecting fresh walnut with different water content

由表4 可知，不同含水量的核桃仁隨著侵染時間的延長POD 活性整體呈現先上升后下降的趨勢。含水量為10%的試驗組在第9 天出現峰值，為0.068 33 U，是第9 天對照組的2.77 倍，含水量為15%的試驗組在第7 天出現峰值，POD 活性為0.145 63 U，是第7 天對照組的6.24 倍，含水量為20% 和30% 的試驗組均在第13 天出現峰值，POD 活性分別為0.186 83 U 和0.092 87 U，分別是對照組第13 天的9.92 倍和3.65 倍，含水量為25% 的試驗組在第11 天出現峰值，POD 活性為0.277 93 U，是對照組第11 天的12.79 倍。含水量為25% 的核桃仁POD 活性明顯高于其他含水量，與CAT 活性相同。POD 活性的增加是植物組織受逆性被激發的主要表現形式，說明含水量為25%的核桃仁本身抗病性能力較強。

黃曲霉侵染不同含水量鮮食核桃仁后對APX 活性的影響如表5 所示。

表5 黃曲霉侵染不同含水量鮮食核桃仁后對APX 活性的影響Table 5 Effect of Aspergillus flavus on ascorbate peroxidase（APX）after infecting fresh walnut with different water contentt

由表5 可知，試驗組含水量10%、15%、20% 的核桃仁隨著侵染時間的延長APX 活性整體呈現先上升再下降最后上升的趨勢，含水量為25%、30% 的試驗組隨著侵染時間的延長APX 活性整體呈先上升后下降的趨勢。含水量為10%和20%的試驗組的APX 活性均在第7 天出現峰值，分別為100.50 U 和123.00 U，含水量為15% 的試驗組的APX 活性在第13 天出現峰值，為128.56 U，含水量為25%的試驗組的APX 活性在第11 天出現峰值，為140.26 U，其APX 活性最高，是對照組第13 天的4.08 倍，是侵染初期的4.27 倍。說明含水量為25%的鮮食核桃仁抗病性最強。

黃曲霉侵染不同含水量鮮食核桃仁后對SOD 活性的影響如表6 所示。

表6 黃曲霉侵染不同含水量鮮食核桃仁后對SOD 活性的影響Table 6 Effect of Aspergillus flavus on superoxide dismutase（SOD）after infecting fresh walnut with different water content

由表6 可知，不同含水量的核桃仁隨著侵染時間的延長SOD 活性大致呈先上升后下降的趨勢，且試驗組不同含水量鮮食核桃仁的SOD 活性均高于對照組。含水量為10%、15%、20% 的試驗組變化趨勢平緩，分別在第11 天、第13 天、第13 天出現SOD 活性峰值，為10.43、11.64、14.83 U，與侵染初期相比分別為其1.13、1.34 倍和1.04 倍。含水量為25% 和30% 的試驗組變化趨勢較為明顯，分別在第9 天和第13 天出現SOD 活性峰值，為14.41、13.78 U，是其侵染初期的1.08 倍和1.38 倍，是其對照組同一天SOD 活性的2.93 倍和2.74 倍。

2.3 黃曲霉侵染對不同含水量的鮮食核桃仁GSH 活性與GR 活性的影響

黃曲霉侵染對不同含水量的鮮食核桃仁GSH 活性的影響如表7 所示。

表7 黃曲霉侵染不同含水量鮮食核桃仁后對GSH 活性的影響Table 7 Effect of Aspergillus flavus on sglutathione（GSH）after infecting fresh walnut with different water content

由表7 可知，不同含水量的核桃仁隨著侵染時間的延長GSH 活性呈先上升后下降的趨勢。含水量為10%、15%、30% 的試驗組均在第11 天出現峰值，GSH活性為569.16、847.85、867.56μmol/g FW，分別是侵染初期的1.53、2.70、1.43 倍，含水量為20%、25% 的試驗組在第13 天出現峰值，GSH 活性為1 150.90、1 207.17μmol/g FW，分別是侵染初期的1.88、3.43 倍。含水量為25% 的試驗組在第13 天的GSH 活性是培養同一天對照組的GSH 活性的4.71 倍。

黃曲霉侵染不同含水量鮮食核桃仁后對GR 活性的影響如表8 所示。

表8 黃曲霉侵染不同含水量鮮食核桃仁后對GR 活性的影響Table 8 Effect of Aspergillus flavus on gluathione reductase（GR）after infecting fresh walnut with different water content

由表8 可知，試驗組含水量10%、30% 的核桃仁隨著侵染時間的延長GR 活性出現先下降再上升最后下降的趨勢，試驗組含水量15%、20%、25% 的核桃仁隨著侵染時間的延長GR 活性呈現先上升后下降的趨勢，且試驗組不同含水量鮮食核桃仁GR 活性均高于對照組。含水量10% 的試驗組變化趨勢不大，在第7 天出現峰值，GR 活性為225.44 U，與侵染初期相比增加了1.16%。含水量15%、20% 的試驗組均在第13 天出現峰值，分別為287.67、471.15 U，是侵染初期的3.23、1.95 倍。含水量25% 和30% 的試驗組變化趨勢明顯，分別在第9 天、第11 天出現峰值，GR 活性為667.00 U 和377.22 U，分別是各侵染初期的2.96 倍和2.93 倍，是各對照組同一天GR 活性的10.91 倍和10.71 倍。對比發現，含水量25% 的試驗組GR 活性變化最明顯。

3 討論與結論

病原菌入侵會促使植物產生活性氧，破壞植物細胞壁進入內部細胞，造成細胞大量凋零、死亡，給植物帶來不可逆的傷害[17]。但同時植物體也可以通過自身的酶促清除系統清除活性氧來減輕自身受到活性氧的傷害并適應不利的環境改變[18]。酶促清除系統在植物體內清除活性氧發揮著不可替代的角色，酶促清除系統中的酶系主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、還原型谷胱甘肽（GSH）等[19]。

本文研究發現黃曲霉侵染新疆薄皮鮮食核桃仁時，CAT、POD、SOD 活性在各含水量都大致呈現先上升后下降的變化趨勢。說明各含水量鮮食核桃體內因受到微生物脅迫發生了應激反應，觸動了自身的抵御能力來消滅活性氧。但隨著侵染時間的延長，各含水量鮮食核桃被黃曲霉侵染程度加深，核桃受損和衰老進程加速，這些酶的活性開始出現下降。當鮮食核桃仁含水量為25%時，這些抗氧化酶活性變化趨勢最為明顯，增加幅度最大，而且在侵染至9～13 d 時各種酶酶活性都出現了峰值。說明含水量25% 的鮮食核桃最易受到黃曲霉的侵染，造成鮮食核桃的果實的損傷和產業的損失。陳高等[19]研究黃曲霉侵染花生，發現POD 和CAT 活性先出現峰值后逐漸下降的情況。閆彩霞等[20]研究發現黃曲霉侵染花生后，隨著侵染時間的延長，CAT 和POD 活性逐漸上升出現峰值后開始下降。吳媛媛等[21]研究發現藍莓遭受到灰霉菌侵染后，短時間內這些抗氧化酶活性上升到峰值后逐漸下降。番茄受到病原菌的侵染后，一定時間內誘導CAT、POD、APX 和SOD 活性出現先上升后下降的趨勢[22]。黃曲霉侵染不同含水量新疆薄皮鮮食核桃，試驗組含水量10%、30% 的核桃仁隨著培養時間的延長GR 活性呈現先下降后上升再下降的趨勢，黃曲霉的生長對水分含量有一定的要求，這兩個含水量GR 活性出現較大波動可能是因為鮮食核桃含水量過高或過于干燥，不利于黃曲霉的生長，侵染初期GR 活性出現了下降趨勢，等到侵染中期，少量較為活躍的黃曲霉適應了環境開始緩慢生長，對鮮食核桃細胞壁造成傷害，產生活性氧，GR 活性出現了上升趨勢；黃曲霉侵染不同含水量新疆薄皮鮮食核桃，GSH 活性均出現先上升到峰值后逐漸下降的趨勢，而且試驗組始終高于對照組。植物在受到微生物侵害時，植物表皮及細胞壁是抵抗病害菌的首道保護屏障。當植物感受到微生物的入侵時，產生活性氧，進而酶促清除系統開始工作，努力抵抗病原菌的傷害，所以在早期的入侵過程中能有效制止病原菌的傷害，酶促清除系統的關鍵酶活性也逐漸達到峰值。但隨著病原微生物的大量繁殖，侵染程度加深，植物細胞大量凋亡，自身的抵抗能力減弱，抵抗活性氧的酶活性也會隨之下降。劉馨怡等[23]研究發現，油梨受到油梨蒂腐病菌侵害時，第2 天GSH 含量上升到峰值后開始緩慢下降。王瑾等[24]研究發現，伽師瓜遭受到鏈格孢侵染時，GSH 活性在第15 天出現了峰值后開始下降；在黃曲霉侵染不同含水量的新疆薄皮鮮食核桃時，超氧陰離子產生速率均出現先上升到峰值后逐漸下降的趨勢，而且試驗組始終高于對照組。鮮食核桃受到黃曲霉脅迫的初期，超氧陰離子累積量緩慢增加。隨著黃曲霉的生長繁殖侵染程度加深，超氧陰離子過度累積達到峰值，鮮食核桃細胞遭到破壞，病原菌大量入侵使鮮食核桃受損嚴重。超氧陰離子累積量下降。梁炫強等[25]在探究花生人工接種黃曲霉菌后活性氧代謝與抗病性的關系中發現，隨著接種時間的加長花生的超氧陰離子產生速率呈出現峰值后緩慢下降的走向。裴冬麗等[26]研究發現給番茄接種枯萎菌后，超氧陰離子含量出現峰值后緩慢下降，且試驗組的番茄超氧陰離子含量始終高于對照組；黃曲霉侵染試驗組各含水量核桃仁隨著培養時間的延長MDA 含量變化稍有差異，但整體呈現先逐漸上升直至出現峰值后再下降的趨勢。黃曲霉接種到核桃仁上后，生長繁殖需要適應[27]，生長較為緩慢，破壞核桃仁質膜的能力較弱，侵染中期黃曲霉適應了環境條件，大量繁殖后快速破壞核桃仁的質膜，使MDA 含量達到峰值。后期植物細胞死亡產生MDA 的量減少。丁玉梅等[28]把枯萎病菌接在南瓜上，測量丙二醛的含量與抗病性的關聯性，發現丙二醛含量呈先上升再下降最后上升的趨向。

根據以上分析得出，不同含水量的鮮食核桃遭受到黃曲霉侵染后，在侵染前期，各含水量的鮮食核桃體內活性氧迅速累積，酶促清除系統被激活，不同的抗氧化酶為抵御病原微生物的侵染活性開始有明顯的升高并達到峰值；黃曲霉侵染含水量25% 的鮮食核桃時，酶促清除系統的抗氧化酶活性相比于其他含水量的鮮食核桃都高。說明黃曲霉在含水量25% 的鮮食核桃上更易生長繁殖，破壞能力也更強；同時，含水量25%的鮮食核桃的抗逆性也較強，但隨著侵染時間的延長，受到侵害的鮮食核桃組織大量死亡，酶促清除系統清除活性氧的能力減弱，受到侵染的鮮食核桃因為活性氧的大量積累細胞膜結構被破壞，加快了果實的老化、腐爛。