固相自養-異養反硝化脫氮同步去除微污染物

曹 陽,劉彩虹*,陳子惟,劉乾亮,何 強(.重慶大學環境與生態學院,三峽庫區生態環境教育部重點實驗室,重慶 400044；.哈爾濱理工大學化學與環境工程學院,黑龍江 哈爾濱 50040)

目前,排放的污水主要包括市政和工業污水,不同污水中污染物成分差異較大,種類復雜,且不同污染物及其轉化產物之間還會產生協同、拮抗等復合毒性作用,威脅生態安全和人類健康.其中,以重金屬鉻和高氯酸鹽為代表的有害物污染問題不容忽視[1-2],藥物與個人護理品(PPCPs)也在水體環境中頻繁檢出,常見的如雙酚A(BPA)和萘普生(NPX)在污水中檢出濃度為ng/L～μg/L 級別[3].在城鎮污水廠處理過程中,以上微污染物常與NO3--N 共存,需同步去除.污水廠進水由于碳氮比(C/N)較低,常依賴于外加碳源實現出水中氮排放達標.為克服傳統液體碳源易過量、易燃、有毒的弊端,近年來固相反硝化應運而生,其中以人工可降解多聚物與天然纖維復合而成的復合碳源[4]最具優勢,但其在運行過程中仍存在脫氮效率不足等問題.近年來,有研究[5]表明鐵(Fe2+)自養反硝化可實現高效脫氮,若將其與異養反硝化結合,可進一步減輕體系中各反硝化還原酶之間對碳源電子的競爭,整體提高反硝化效能.此外,硫自養反硝化可通過異養反硝化產生的堿和硫自養反硝化產生的酸實現酸堿互補、降低異養反硝化過程中污泥的產量、降低自養反硝化過程中SO42-的產量等途徑增強體系中反硝化速率,同時降解高價態微污染物和PPCPs[6].

目前,大部分研究對于異養反硝化耦合鐵(FeO)自養反硝化的研究較少,對于將異養-自養復合反硝化運用于痕量污染物(Cr( Ⅵ)、ClO4-、BPA、NPX)與NO3--N 同步去除的研究亦較少.基于此,本文在聚己內酯復合花生殼(PCL/PS)固體碳源的基礎上,考察其分別耦合單質硫(S)、氧化鐵(FeO)和同時耦合二者所構建的復合碳源對反硝化體系脫氮效能的強化作用,以及同步去除微污染物(以Cr( Ⅵ)、ClO4-、BPA、NPX 為例)的能力,揭示復合自養/異養反硝化體系的微生物群落結構、功能種群分布的關聯性及微觀作用機制,旨在為尾水深度脫氮及微污染物同步處理工藝的構建提供參考.

1 材料與方法

1.1 固體碳源的制備與表征

花生殼作為富含木質素和纖維素的天然材料,具有強吸附性,選作復合碳源的天然成分(采購于中國重慶本地),同時選用PCL(分子量～50000Da,中國一順工業有限公司)作為聚合物基,添加劑均為分析級采購.復合碳源制備方法如下:花生殼經蒸餾水洗滌后,在35℃下脫水,研磨成粉末.采用高速混合機(50KG-25,安博維機械有限公司,中國)對共混后的固體碳源進行均質處理,通過直徑為2mm 的雙螺桿擠出機(20R,南京永杰化工機械有限公司),按3mm的規格進行最后切割.制備的4 種固體碳源的原料組成及質量配比如表1 所示,該比例由前期研究[7]并結合雙螺桿擠出機中可添加的天然材料的最大百分比確定.將制備的固體碳源在40℃下干燥15h后加入反應器.固體碳源采用 SEM(Gemini 300,ZEISS,德國)對其表面形貌進行表征,并對固體碳源上的微生物形態進行測定.固體碳源官能團利用傅里葉變換紅外輻射(FTIR)光譜儀(Thermo Scientific Nicolet 6700)進行分析,采用KBr 壓片法,波長范圍4000～400cm-1.

表1 固體碳源組成及質量配比Table 1 Solid carbon source composition and mass ratio

1.2 實驗污泥

實驗所用污泥(MLSS=14380mg/L)為重慶雞冠石污水處理廠厭氧池污泥.實驗用水為人工模擬二級出水,COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TN、PO43--P 濃度分別為157.21～212.66,0～0.15,0～0.11,8.42～13.94,10.23～14.71,9.41～11.54mg/L, pH 值為7.5～8.0.其它相關化學試劑如BPA(C15H16O2,MW=228.29)、重鉻酸鉀、高氯酸鈉、NPX、1,5-二苯基碳酰二肼、丙酮等均為分析純級別.所有溶液和儲備液均采用超純水配制.

1.3 實驗方法

實驗共分4 組(A～D,分別以Cr( Ⅵ)、ClO4-、BPA、NPX 為目標去除微污染物),考察每組在4 種固體碳源體系下(PP、PP-S、PP-F、PP-SF)對微污染物的去除情況,并設置3 組平行. 原水中NO3-N 濃度為5mg/L,Cr( Ⅵ)、ClO4-、BPA、NPX 濃度分別為0.5mg/L,20mg/L,20μg/L 和20μg/L.

以500mL 厭氧瓶為反應容器,實驗開始前,在每個厭氧瓶分別加入80g固體碳源和400mL實驗配水,曝氮氣15min,以排出配水和厭氧瓶內原有的氧氣,再接種40mL 污泥.所有厭氧瓶瓶口均用丁基橡膠塞加鋁蓋密封,在25℃、40r/min 的溫水搖床中運行.根據相關研究[8-9],設置運行周期為14d.實驗開始后每24h 采樣1 次,測定NO3-、NO2-、微污染物(Cr( Ⅵ)、ClO4-、BPA、NPX)及TOC 的含量.

1.4 分析儀器與測試方法

每24h 對反應器的出水取樣并測試污染物濃度,常規水質指標測試前先經0.45μm 微孔的濾膜過濾,按照《水和廢水監測分析方法》[10]進行檢測.Cr( )Ⅵ濃度測定前水樣用0.22μm 微孔濾膜二次過濾,依據《二苯碳酰二肼分光光度顯色法》(GB7467-1987)使用紫外-可見分光光度計(UV-2600,日本)進行檢測.采用Dionex Aquion(AQ)離子色譜進行ClO4-的檢測分析.BPA 和NPX 使用高效液相色譜儀(HPLC)進行檢測,色譜柱為CNW Athena C18-WP,5μm, 100A,直徑為4.6mm,長度為250mm;柱溫40℃;流動相比例甲醇:超純水=75:25(V/V),柱溫30℃,流速0.1mL/min,進樣量10μL,保留時間3min,檢測波長254nm.

1.5 微生物樣品分析

實驗結束后,在各組燒瓶的下層固態混合物中采集生物膜樣本,進行微生物分析.將生物膜置于0.1mol/L 磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中,以225r/min 的轉速振蕩40min,使附著的生物膜懸浮.然后,將樣品在10000r/min 下離心10min 后收集沉淀,并使用E.Z.N.A.土壤DNA 試劑盒(Omega Biotek,Norcross,GA,United States)進行DNA 提取和純化.以27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 和 338R(5'-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3')為引物,對V1～V2區域進行擴增,隨后對純化后的PCR 產物進行16S rDNA 高通量測序.基于KEGG 數據庫中的16S rDNA數據,利用PICRUSt2 預測與微生物代謝相關的功能酶/基因,采用R 軟件進行Pearson 相關性分析、IBM SPSS Statistics 26.0 軟件進行組內和組間方差分析(ANOVA)、CANOCO5 軟件進行主成分分析(PCA).

2 結果與討論

2.1 固體碳源的表征

如圖1 所示,PP 表面呈現粗糙的層狀結構,可能是由于花生殼中富含木質纖維素,由于微生物附著通常會隨載體表面粗糙度的增加而增加,PP 的層狀結構將利于微生物的黏附.隨著放大倍數增加,PP-S表面一些單質S 分子聚集形成團聚體堆積在PP 的表面及孔隙中,耦合了FeO 的固體碳源表面較為平整、有細小孔洞分布.二者同時耦合時,固體碳源表面既有S 粒聚集又有細小孔洞分布.從EDS 結果可知,耦合后材料的元素主要有C、O、Fe、S.從表面形貌的結果來看,S 已成功耦合在PP-S、PP-SF上,FeO 已成功耦合在PP-F、PP-SF 上,表明成功制備PP-S、PP-F、PP-SF3 種新型改性固體碳源.

圖1 固體碳源表面的SEM 和EDS 表征結果Fig.1 SEM and EDS characterization results of solid carbon source surface

2.2 固體碳源反硝化及同步去除微污染物效能分析

2.2.1 復合自養-異養反硝化體系同步去除Cr( Ⅵ)由圖2 可知,前期PP-S 平均脫氮率最高,反硝化性能最好.第3～5d,PP 和PP-S 對NO3--N 的去除率穩定在90%～95%,NO3--N 濃度低至0.29mg/L.但隨著碳源的消耗,NO3--N 濃度逐漸上升,推測可能是前期異養反硝化作用較強,碳源減少,抑制微生物的代謝,迫使微生物逐步進入內源呼吸階段.而PP 的回升幅度大于PP-S,推測是單質硫作為電子供體可以在系統電子供體相對不足時(C/N 下降)通過硫自養反硝化作用參與脫氮,彌補反應器中因碳源消耗造成的電子供體不足,同時生成H+分擔部分堿度,保證脫氮效率穩定.該結果表明,單質硫作為系統備用電子供體,在碳源不足時可作為異養反硝化的補充,維持穩定的脫氮效率.然而,PP-F 的NO3--N 濃度一直保持較高水平,平均脫氮率僅有17.2%,可能是Fe2+在細胞外被氧化,生成的鐵垢滯留在細胞周圍,阻礙養分的吸收和代謝產物的外流,導致細胞活性下降甚至死亡[11].對于Cr( Ⅵ),4 組實驗反應器均具有較好去除能力,Cr( Ⅵ)平均去除率分別為85%(PP)、82%(PPS)、75%(PP-F)、75%(PP-SF).其中,PP、PP-S、PP-SF中的最高去除率均可達92%.在整個實驗周期內,每個反應器效能的變化趨勢相似,表明各反應器的性能穩定且可重復.隨實驗進行,PP、PP-S、PP-SF 去除率略有上升最后穩定在85%左右,同時,NO3--N 去除率略有下降,推測后期NO3--N 與Cr( Ⅵ)對電子存在競爭關系,且Cr( Ⅵ)對電子供體具有更強的利用能力.

圖2 投加微污染物為Cr( Ⅵ)時復合自養-異養反硝化體系對NO3--N 和Cr( Ⅵ)的去除Fig.2 The removal of NO3--N and Cr( Ⅵ) by the composite autotrophic-heterotrophic de nitrification system when the micropollutant was Cr(VI)

由此可見,PP 的反硝化脫氮同步去除Cr( Ⅵ)的能力最優,PP-S 其次,耦合自養反硝化后并未對體系內微污染物Cr( Ⅵ)的去除起到促進作用.但值得指出的是,PP-S 的脫氮速率較高,這主要是由于硫自養反硝化對反應進行了電子的補給.

2.2.2 復合自養-異養反硝化體系同步去除ClO4-由圖3 可知,在ClO4-同時存在的情況下,4 種固體碳源對NO3--N 均可在5d 內實現90%的去除率.PP-S、PP-F 和PP-SF 于第3d 最先實現對NO3--N 的最大去除,NO3--N 濃度到達最低點,分別為0.67,1.22,0.51mg/L,而PP 則于第5d 降解NO3--N 最低至0.52mg/L,其中以PP-SF 的脫氮速率最快.體系對ClO4-的去除發生在NO3--N 被基本去除之后,前期NO3--N 濃度較高時ClO4-幾乎無變化,當NO3--N 濃度低于1～2mg/L 時,ClO4-才開始呈現較明顯的降解,這與Giblin 等[12]的研究結論一致.ClO4-濃度從第3d開始逐漸減少,且在第4～5dNO3--N 濃度降至最低時ClO4-的降解速率最快,并在第13～14dClO4-濃度降至最低(0.12mg/L),此時反應器對ClO4-去除率達到99.4%.這些現象說明與ClO4-相比,NO3--N 更易作為電子受體而被還原去除,同時NO3--N 幾近完全降解時,可促進ClO4-的降解,這與謝宇軒[13]的結論一致.通過對比PP 的表現,耦合鐵自養反硝化后反應器對高氯酸鹽的去除性能明顯有了極大提升,PP-F、PP-SF 的去除率分別高達99.4%、96.2%.與此同時,投加了FeO 的反應器中溶液變黃,且檢測到有大量的Fe3+產生,說明FeO 為反應提供了電子,通過化學還原作用主導了高氯酸鹽的降解.根據已有研究結果可知,鐵自養反硝化過程中,Fe(II)的氧化由化學作用主導[20],Fe(II)作為電子供體協助去除ClO4-可能的化學反應式為:7Fe2++ClO4-+4H2O→7Fe3++Cl-+8OH-.由于S 在微生物作用下發生歧化反應:4S+4H2O→H2SO4+3H2S,產生大量H+,pH 值降低較快,抑制微生物對高氯酸根的降解[14],因此PP-SF 的去除率略低于PP-F.在后文微生物群落分析中,梭菌屬數目的增加也證實此種情況,除FeO 的化學作用外,生物作用也不容忽視.

圖3 投加微污染物為ClO4-時復合自養-異養反硝化體系對NO3--N 和的ClO4-去除Fig.3 The removal of NO3--N and ClO4- by the composite autotrophic-heterotrophic denitrification system when the micropollutant was ClO4-

總體評估,PP-SF 反硝化脫氮同步去除ClO4-的能力最優,其脫氮表現優于含鉻體系,這可能是在高氯酸鹽的存在下,NO3--N 更易被還原去除.耦合了鐵自養反硝化后對體系內微污染物ClO4-的去除有了極大促進,但PP、PP-S 去除ClO4-的表現不佳,表明該體系中Fe(II)可能在促進ClO4-去除中起到了重要的作用.

2.2.3 復合自養-異養反硝化體系同步去除BPA從圖4 可知,PP 的反硝化性能最好,對NO3--N 去除率高達100%,在PP 中添加S 或FeO 后,對NO3--N在前期有一定去除,后期產生抑制作用,尤其是添加了FeO 后,這可能是鐵對微生物的抑制作用導致.此外,4 種碳源對BPA 表現出良好的去除能力,平均去除率皆為99%以上.結合BPA 和NO3--N 的去除趨勢分析,可能源于PPCPs 的非生物轉化,即在生物脫氮體系中,PPCPs 會與NH2OH、NO2-、NO3-等氮活性物質直接發生化學反應.Yu 等[15]研究發現向體系內加入的NH2OH(5μmol/L)能與體系內磺草靈直接反應,使其氮雜環上的-NH2發生羥基化反應,或氧化為NO2,并將鄰位的-H 取代為-OH.此外,鄭杰蓉等[23]發現相同時間內,投加乙酸鈉后反硝化菌群對磺胺嘧啶(SDZ)的降解率提高40%左右,表明SDZ作為碳源與乙酸鈉共同被反硝化菌群利用.由此推斷,本實驗體系內可能也存在異養菌將PPCPs 作為碳源利用的情況.

圖4 投加微污染物為BPA 時復合自養-異養反硝化體系對NO3--N 和BPA 的去除Fig.4 The removal of NO3--N and BPA by the composite autotrophic-heterotrophic denitrification system when the micropollutant was BPA

通過總體評估,PP 的反硝化脫氮同步去除微污染物BPA的能力最優.各組固體碳源的脫氮同步去除BPA 表現中主要在反硝化脫氮方面有所差距.耦合自養反硝化后對體系效能無顯著提升,但值得指出的是耦合硫自養后體系效能發揮更為穩定.

2.2.4 復合自養-異養反硝化體系同步去除NPX 由圖5 可知,實驗運行3～4d 時,各組均實現了對NO3--N 的最高去除,去除率分別為80.2%、87.4%、65.6%、95.4%,PP-SF 對NO3--N 的去除效果最好.各組均在9～10d 時實現了對NPX 的最高去除,去除率分別為100%、99.96%、97.35%、99.95%,這與 Marchlewicz 等[17]的研究結果相似.Marchlewicz 等從波蘭某化工廠的土壤中分離出了可降解萘普生的菌株,當外加碳源對NPX 進行共代謝降解的過程中,萘普生的降解率顯著提高,可達90%以上.但NPX 可能對自養微生物生長代謝產生一定干擾,因此耦合了自養反硝化后并未對異養反硝化去除微污染物產生促進作用.

通過綜合評估,PP-SF 反硝化脫氮同步去除NPX 的能力最優,PP-S 次之.與BPA 體系類似,各組碳源主要在反硝化脫氮方面有所差距,耦合自養反硝化后體系效能有所提升并更為穩定.

2.2.5 固體碳源的優選與分析 通過對比4 種污染物體系中4 種固體碳源的反硝化脫氮與同步去除微污染物結果:(1)固體碳源不同,其所擅長降解的微污染物種類不同.經綜合考評,本實驗得到的脫氮與同步去除微污染物性能較好的固體碳源為PP 和PP-SF,其中PP 的脫氮及同步去除Cr(Ⅵ)和BPA 的能力較好,而PP-SF 則在去除ClO4-和NPX 時表現最好.

(2)在ClO4-的存在下,NO3--N 更易被還原去除,且體系中去除ClO4-的主要貢獻者為鐵自養反硝化反應.在Cr(Ⅵ)、BPA、NPX 存在時,各組固體碳源反硝化脫氮及同步去除微污染物的綜合性能主要取決于反硝化脫氮方面的差距,而耦合了FeO 的固體碳源表現不太理想.這可能是由于Fe2+在反應過程中具有較強的還原性,極易失電子而被氧化,降低生物的利用率,從而出現鈍化現象而降低脫氮效率[18],且Fe2+在酸性條件下較穩定,但大多數鐵自養反硝化菌的生物活性會受到抑制.

(3)耦合了S 的固體碳源在脫氮和去除微污染物的表現中都取得了較穩定的成績,其優勢在于:產生適當酸度,平衡體系pH 值,與有機碳源一同為微生物提供了穩定的生長環境;硫自養過程中,S 元素由0 價變為+6 價,大大提高了對單位底物的供電子能力;在碳源消耗而減少時,硫自養反硝化承擔部分NO3--N 負荷,彌補了系統反硝化效率不足的問題,同時也保證出水有機物含量較低.雖然耦合硫自養技術后呈現了明顯的優勢,但自養菌較異養菌相比生長繁殖速度慢,容易在底物(本實驗為NO3--N、高價污染物)競爭中處于劣勢,導致耦合體系穩定性不佳.因此,應深入研究如何控制實驗條件使自養菌、異養菌之間更好地協作,促進脫氮和微污染物去除的效能提升.

2.3 微生物群落結構分析

在實驗結束時,提取各組底部生物膜進行高通量測序,采用ACE、Chao1、Shannon 和Simpson4個指標,分析各反應器和接種污泥中的微生物群落多樣性,同時對物種不同分類水平上的群落結構進行分析.通過表征微生物多樣性及物種組成,考察各系統反硝化及同步去除微污染物的規律、機理及差異性.

2.3.1 Cr( Ⅵ)復合自養-異養反硝化體系 ACE 和Chao1 指數表示菌群豐富度且與菌群豐富度呈正相關,Shannon 和Simpson 指數表示菌群物種多樣性程度,Shannon 指數與菌群多樣性呈正相關,Simpson 指數與菌群多樣性呈負相關.如表2 所示,與對照組相比,添加了S 或FeO 的體系中擁有更高的微生物豐富度和多樣性,其中以PP-F最為顯著,這可能是鐵對反硝化有一定抑制作用,使活性污泥整體系統沒有向以反硝化微生物為優勢的方向發展,從而未能形成以優勢種群領導的群落結構.

表2 Cr(Ⅵ )復合自養-異養反硝化體系中的生物多樣性指數Table 2 Biodiversity index in Cr(VI) complex autotrophicheterotrophic denitrification system

由圖6(a)可知,4 組固體碳源的優勢門均為Proteobacteria(變形菌門)、Firmicutes(厚壁菌門);添加了FeO的PP-F、PP-SF具有獨特的優勢門Bacteroidetes(擬桿菌門),添加了S 的PP-S、PP-SF 具有獨特的優勢門Patescibacteria(髕骨菌門).其中Proteobacteria 是固相反硝化系統(如PCL、PBS 等)中的優勢種群,多數異養和自養反硝化菌均歸屬于Proteobacteria,具有強化脫氮作用[19],Firmicutes 和Bacteroidetes 則通常與有機物的水解、發酵及產酸有關,通常作為異養菌和脫氮功能菌參與到污水處理中[20].Patescibacteria 有同步硝化和反硝化功能,是厭氧氨氧化耦合反硝化啟動的主要菌門之一[21-22].對比各組固體碳源對反硝化和微污染物去除的表現來看,PP 因具總量最多的反硝化主要菌門Proteobacteria和Firmicutes(二者相對豐度分別為36.2%、63.2%,共99.4%),在反硝化脫氮中表現最好,而耦合了S/FeO 自養反硝化后雖擁有豐富的微生物多樣性但卻并未對異養反硝化實現強化作用,可能與自養反硝化菌與異養反硝化菌存在一定的競爭關系有關.

圖6 Cr(Ⅵ)(a)、ClO4-(b)、BPA(c)、NPX(d)復合自養-異養反硝化體系微生物在門(左)、屬(右)水平上的種類及分布Fig.6 Species and distribution of microorganisms in Cr(Ⅵ)(a),ClO4-(b),BPA(c),NPX(d) complex autotrophic-heterotrophic denitrification system at phylum(left) and genus(right) levels

由圖6(a)可知,在4 組固體碳源體系內均發現大量異養反硝化菌,如Clostridium_sensu_strito(梭菌屬)、Lactococcus(乳球菌屬)、Novosphingobium(新鞘氨醇桿菌屬);添加了 FeO 的體系內還含有Prevotella_9(普雷沃氏菌屬),屬于擬桿菌門,可產生木質纖維素降解酶[23],促進纖維素降解.對照組PP中排名前三的優勢屬分別為 Clostridium_sensu_strito_1、Acetobacter(醋菌屬)、Lactococcus,均屬于厚壁菌門,相對豐度分別為34.6%、26.2%、21.9%,共計82.7%,遠高于其他3 組,反硝化性能領先.其中,Lactococcus 代謝產生大量酸質,能迅速降低反應體系內的pH 值以防亞硝酸鹽積累,同時促進Cr( Ⅵ)的去除,且能抑制其他有害微生物的繁殖[24].據研究[25],Lactococcus 還對難降解有機物具有降解能力.PP 中還發現了少量Nitrospira(硝化螺旋菌屬),可參與亞硝酸鹽氧化過程[26]產生硝酸鹽,并利用硝酸鹽為電子受體進行反應[27].

2.3.2 ClO4-復合自養-異養反硝化體系 如表3 所示,PP-S、PP-F、PP-SF 的ACE、Chao1 和Shannon指數均顯著大于PP,simpson 指數均小于PP,說明這三者具有更高的菌群豐富度和物種多樣性,其中最高者為PP-SF,可能是硫自養反硝化、鐵自養反硝化與異養反硝化耦合后反硝化細菌不斷增長和富集的緣故.

表3 ClO4-復合自養-異養反硝化體系中的生物多樣性指數Table 3 Biodiversity index in ClO4- complex autotrophicheterotrophic denitrification system

由圖 6(b)可知,4 組固體碳源的優勢門為Proteobacteria(變形菌門)、Firmicutes(厚壁菌門),這與前文中Cr( Ⅵ)復合自養-異養反硝化體系群落結果相似.不同的是,添加了S/FeO 的PP-S、PP-F、PP-SF 中的優勢門Bacteroidetes(擬桿菌門)遠高于PP,而PP 中的優勢門Patescibacteria(髕骨菌門)則多于前三者.有研究表明[28],這些菌群對生物膜反應器中污染物的去除起主要作用,Proteobacteria 和Firmicutes 可在厭氧環境下通過分解有機物來獲取營養物質,與脫氮作用有關,且大多數高氯酸鹽還原菌都屬于變形菌Proteobacteria[29];Bacteroidetes 包括3 大類細菌:Bacteroides 、 Flavobacillus 和Sphingomycetes,可降解花生殼中豐富的纖維素[30].總體而言,4 組碳源中反硝化菌門Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes的總相對豐度為86%～93%,因此反硝化脫氮差異不大.

由圖 6(b) 可知,Clostridium_sensu_strito 和Lactococcus是4組固體碳源體系已知的前兩位優勢屬,均為具有反硝化脫氮、有機物降解功能的微生物.其中Clostridium(梭菌屬)中包含一些可降解ClO4-的細菌、硫酸鹽還原菌以及鐵還原菌[31],在中性、中溫條件下對ClO4-的去除率達90%以上[29],可在NO3--N濃度較低時將SO42-和Fe3+作為電子受體[32].在 PP 中發現了相對豐度為 5.4%的益生菌Acetobacter(醋菌屬),而其他3 組中則含有相對豐度最高的自養反硝化菌Prevotella(普雷沃氏菌屬),包括Prevotella_1、Prevotella_7、Prevotella_9.在PP-F中發現了3.56%的Parabacteroides(副桿狀菌屬),是一種典型厭氧菌,可通過糖酵解作用產生反硝化電子供體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)[33].此外,各組碳源體系均存在少量Denitratisoma(脫氮單胞菌屬),為典型異養厭氧反硝化菌,與厭氧氨氧化菌之間存在一定協同效應[34].

2.3.3 BPA 復合自養-異養反硝化體系 如表4 所示,PP-S、PP-F、PP-SF 的ACE、Chao1 和Shannon指數均大于PP,simpson 指數均小于PP,說明這三者比對照組具有更高的菌群豐富度和物種多樣性,其中以PP-F、PP-SF 最為顯著,推測FeO 可能為影響群落微生物多樣性的最大因素.

表4 BPA 復合自養-異養反硝化體系中的生物多樣性指數Table 4 Biodiversity index in BPA complex autotrophicheterotrophic denitrification system

由圖6(c)可知,4 組固體碳源的優勢門均為Firmicutes(厚壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門),其中PP-S、PP-F、PP-SF 中的優勢門Bacteroidetes(擬桿菌門)多于PP,這與前文中ClO4-復合自養-異養反硝化體系的群落結果相似.不同的是,PP-S 中的優勢門Patescibacteria(髕骨菌門)多于另外三者.總體上看,4 組固體碳源中脫氮功能菌的總相對豐度均高達95%以上,但各自脫氮能力有所差異.此外,生物脫氮中混合菌群的協同作用能實現PPCPs 較高去除,一方面,異養菌能直接對PPCPs 實現共代謝降解[35];另一方面,自養菌可將PPCPs 降解成簡單產物,進一步被異養菌作為碳源利用,實現完全降解.同時,在復合反硝化體系中還發現了與硫自養反硝化有關的Epsilonbacteraeota(ε-變形菌門),可深度降解廢水中難降解有機物[36].

由圖6(c)可知,各固體碳源體系內優勢菌屬主要有Lactococcus、Novosphingobium、Clostridium_sensu_strito、Prevotella、Enterobacte(腸桿菌屬)等,大多數為具有異養反硝化脫氮、污染物降解功能的微生物.其中,腸桿菌屬在降解有機污染物過程中能釋放生物表面活性劑,提高對污染物的生物利用率[37].同時,在PP-SF 中出現了2.62%的Pseudomonas(假單胞菌),兼具異養和自養反硝化及聚磷作用,并具有電化學活性[38].史江紅等[39]分離出的一株香茅醇假單胞菌(Pseudomonas citronellolis)能實現對E1、E2 和EE2(均為甾體類雌激素,一種環境內分泌干擾物)的近100%降解,由此推測該菌屬也可能對BPA 的降解有相當貢獻.在PP 體系中,發現了相對豐度為3.82%的Acinetobacter(不動桿菌屬)和2.41%的Kluyvera(克呂沃爾氏屬),Acinetobacter 能降解芳香族化合物,Kluyvera 是變形桿菌在屬水平上的異養反硝化優勢菌種.研究表明,BPA 會抑制活性污泥脫氫酶活性,降低微生物的活菌比例[40],結合前文中各組碳源的反硝化脫氮同步BPA 降解的效能和菌屬豐度差異,推測BPA 的存在降低了Lactococcus、Novosphingobium、Acinetobacter、Kluyvera 等菌屬豐度,影響系統的脫氮性能.

2.3.4 NPX 復合自養-異養反硝化體系 如表5 所示,PP-S、PP-F、PP-SF 的ACE、Chao1 和Shannon指數均大于PP,simpson 指數均小于PP,說明這三者具有更高的菌群豐富度和物種多樣性,其中PP-F 最高,表明FeO 是影響群落微生物多樣性的最大因素,同時對比PP-S、PP-SF 的多樣性指數,推測鐵自養微生物和硫自養微生物在該體系下可能存在一定競爭關系.

表5 NPX 復合自養-異養反硝化體系中的生物多樣性指數Table 5 Biodiversity index in NPX complex autotrophicheterotrophic denitrification system

由圖6(d)可知,4 組固體碳源的優勢門均為Firmicutes(厚壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門),其中PP-S、PP-F、PP-SF 的優勢門Bacteroidetes(擬桿菌門)多于PP,而PP-S 的優勢門Patescibacteria(髕骨菌門)則多于另外三者,這與前文中BPA 復合自養-異養反硝化體系的群落結果一致.此外,在添加了S/FeO 的固體碳源體系中也發現了一定數量的Epsilonbacteraeota 和Nitrospirae(硝化螺旋菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門),均與反硝化作用有關,且PP-F中存在Actinobacteria(放線菌門,能夠參與鐵循環)和Deferribacteres(脫鐵桿菌門,一種能厭氧降解芳烴的鐵還原菌)[41].結合前文脫氮及同步去除微污染物的研究結果來看,PP-SF 因擁有最高豐度的脫氮功能菌而表現突出,其中 Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria 的相對豐度分別為43.74%、39.34%、14.03%,總豐度為97.11%.

由圖6(d)可知,各固體碳源體系內的優勢菌屬為Clostridium_sensu_strito,其具有較強的有機物降解和無機物還原能力,易在厭氧環境中富集.通過對比,Lactococcus 和Lactobacillus 在PP 和PP-S 體系中的相對豐度明顯高于PP-F 和PP-SF,而PP-F 和PP-SF 體系中的Prevotella_9 則遠多于PP 和PP-S.另外,在 PP-F 中存在相對豐度為 5.02%的Parabacteroides(副桿狀菌屬),可進行糖酵解作用產酸,這與前文ClO4-體系中的結論一致.此外,PP-S 中發現有 8.50%的 Prevotella_7.結合前文研究發現,NPX 的添加雖然降低了PP-SF 體系中的微生物多樣性,但增加了優勢種群Clostridium_sensu_strito和Prevotella的相對豐度,且NPX本身或其降解產物可能對微生物有毒害作用,因此PP-SF 更有助于微生物在NPX 的環境中適應并繁殖.

2.3.5 各體系內微生物群落結構對比 微生物群落結構分析表明S 和FeO 的加入增加了固相反硝化體系中微生物的多樣性和豐富度,使微生物群落結構趨于復雜,增加了Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria 等與木質纖維素降解和自養反硝化相關菌屬,以及Pseudomonas 等好氧菌屬的相對豐度,一定程度上提高了反硝化體系中有機質的降解和物質轉化,但當體系中微生物多樣性過高且各占有一定豐度時,反而不利于優勢菌的形成,進而對體系反硝化性能造成負面影響. Clostridium_sensu_strito、Lactococcus 和Prevotella 是4 個固體碳源體系的主要優勢菌屬,影響體系脫氮作用,其總體相對豐度為PP>PP-SF>PP-S>PP-F,與實際反硝化脫氮和微污染物的去除表現大致一致,但由于其并非影響生物脫氮的唯一菌種,如 Novosphingobium、Enterobacte、Nitrospira、Kluyvera、Denitratisoma等也會對體系性能造成影響,因此PP 和PP-SF 在去除各微污染物時偶有起伏.同時,體系中微污染物的存在也會對微生物的種群豐富度和多樣性產生影響,且在運行過程中,當條件受限時,由于一些菌種同時存在脫氮或者降解同種有機污染物,體系中反硝化脫氮和微污染物去除可能存在一定競爭關系,加之其去除機理復雜,包括自養菌轉化、物理化學轉化、異養微生物轉化以及各菌群的協同作用等,還與進水組成、處理工藝工況、微生物活性和污染物質自身理化特性密切相關,其中哪種機理占主導作用還需進一步深入研究.

3 結論

3.1 固體碳源對微污染物降解的選擇性不同.異養反硝化對于添加了Cr( Ⅵ)、BPA 的污水具有更好的反硝化脫氮和同步去除微污染物性能,如PP 對NO3--N、Cr( Ⅵ)的去除率分別為 94%、92%,對NO3--N、BPA 的去除率均可達99%以上;復合自養-異養生物反應體系可高效脫氮同步去除ClO4-、NPX,其中PP-SF 中的去除率最高,性能最穩定,其對NO3--N、ClO4-的去除率分別為 90%、96%,對NO3--N、NPX 的去除率分別為96%、99%,而PP-S和PP-F 的反硝化脫氮和同步去除微污染物性能較不穩定.

3.2 自養反硝化帶來更豐富多樣的微生物.硫自養反硝化和鐵自養反硝化的耦合增加了固相反硝化體系中微生物的多樣性和豐度,相關微生物主要來自Proteobacteria、Chloroflexi、Deferribacteres、Actinobacteria 等門類,同時與有機質降解相關的菌屬及好氧菌屬的數目有所增加,提高了對污染物的降解效能.對于 4 組固體碳源, Clostridium_sensu_strito、Lactococcus 和Prevotella 是決定反硝化脫氮的主要優勢菌屬,同時,體系中微污染物的存在和微生物群落間的相互作用也會對實驗結果產生影響.