阿爾茨海默病唾液診斷生物標志物的研究進展

賈云琪,韓景獻,張雪竹(天津中醫藥大學第一附屬醫院針灸科,天津 300380;國家中醫針灸臨床醫學研究中心;通訊作者,E-mail:zhangxuezhu999@6.com)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種常見的癡呆類型,屬于不可逆的中樞神經系統退行性疾病類別,是老年人中常見的神經變性疾病,該疾病以認知障礙為主要臨床表現。目前全球超過5 500萬人患有癡呆,預測到2030年這一數字將達到8 200萬[1],其中AD患者人數約占所有癡呆病例的70%[2],在中國AD的年齡標化發病率為(56.47～207.08)/10萬[3]。此外,據世界阿爾茨海默病報告估計全球75%的癡呆癥患者沒有得到診斷,作為癡呆主要原因的AD,也因此在醫學界備受關注。

AD有較長的臨床前疾病階段,隨著檢驗技術的發展,越來越多的證據表明患者在發病前存在大腦微結構變化與體液代謝變化。AD患者如果在早期階段得到及時診斷并接受治療,甚至在前驅期預測到AD風險并采取一些非藥物手段進行預防,這將會大幅延緩疾病進程,患者生存率將得到提高,并減輕社會及家庭的負擔。

目前,AD的主流診斷方法是腦脊液(cerebro-spinal fluid,CSF)檢測及正電子發射斷層掃描成像(positron emission computed tomography,PET)。CSF檢測需做腰椎穿刺手術,因其屬于有創操作,導致患者在AD早期診斷階段對CSF檢測的接受程度并不理想。PET由于價格昂貴同樣不適用于AD的早期診斷篩查,因此這些方法都不能在早期診斷治療中進行普及。而唾液中可能存在潛在的AD生物標記物,有利于臨床早期診斷、病情監測以及預后判斷[4]。本文通過總結AD發生過程中相關唾液生物標志物的研究進展及不足,對AD診斷的唾液生物標志物今后的研究方向進行進一步討論及展望。

1 中樞神經系統損傷相關標志物

1.1 淀粉樣β蛋白(amyloid β protein,Aβ)

Aβ過度沉積是導致阿爾茨海默病發生的一個重要因素,而Aβ42則是人體內Aβ中最常見的亞型,以Aβ42通過錯誤折疊導致過度沉積形成的可溶性Aβ42低聚物,會在腦內形成淀粉樣斑塊,期間加速Tau蛋白過度磷酸化、神經元之間信號傳遞障礙,甚至誘導氧化損傷,并最終導致神經元死亡,因此Aβ過度沉積被認為是AD病理改變的關鍵環節。近年Boschi等[5]首次運用超靈敏ELISA技術檢測唾液中Aβ42,發現AD患者唾液Aβ濃度顯著高于對照組和非AD組,為對照組的兩倍,且Aβ唾液濃度診斷AD在ROC分析中敏感性為84%,特異性為68%。雖然唾液中的Aβ42與AD在病理機制上的聯系尚未明確,但多數研究結果顯示,AD患者唾液中的Aβ42濃度升高,這一指標足以將AD與非AD區分開[6-8],這些研究結果都有力地證明了唾液Aβ42可成為診斷AD的生物標記物。

1.2 Tau蛋白

Tau蛋白是一種微管相關蛋白,主要表達于神經元細胞質與軸突中,其作用主要在于穩定神經元細胞骨架結構和調控神經細胞生長發育。在AD病理進程中,Tau蛋白的過度磷酸化使微管結構遭到破壞,并與Aβ共同作用增加細胞毒性[9],最終加速神經元死亡。在PET成像中,Tau病理聚集與AD患者的神經變性和臨床表現密切相關[10]。Marksteiner等[11]研究運用Lumipulse技術發現,AD患者唾液總Tau(total-Tau,t-Tau)蛋白水平顯著低于對照組,而磷酸化Tau-181(phospho-Tau-181,p-Tau-181)水平顯著高于對照組,上述研究以輕度認知障礙(mild cognitive impairment,MCI)患者唾液內存在≥18 pg/mg的Tau蛋白,或AD患者唾液內存在≤300 pg/mg的Tau蛋白為診斷界值,實驗室診斷準確率為71.4%。Cui等[12]研究表明,AD患者唾液的Aβ42水平明顯比對照組的更高,Aβ40、t-Tau和p-Tau無明顯變化,p-Tau/t-Tau和Aβ42/Aβ40與AD診斷有一定的相關性,并且這4種生物標志物聯合檢測對AD診斷的正確率在92.11%。到目前為止,唾液檢測生物標志物研究中Aβ和Tau聯合診斷AD的準確率最高,這類AD主流唾液生物標志物研究運用了超靈敏ELISA技術和Lumipulse技術等檢測標志物的數據變化,在數據上使被檢測標志物展現出了一定的診斷優勢,但由于水的含量在唾液中比在血液中高,所以未來研究要想獲得更精準的數據,就需要探索更加精確的檢驗技術,類似于血液Tau蛋白檢測的免疫磁還原(IMR)和Simoa技術等等。

1.3 乙酰膽堿與乙酰膽堿酯酶

在AD病理進程中,乙酰膽堿缺乏會破壞腦內前額葉皮質神經元[13],而乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)作為中樞神經傳導中一種關鍵性酶,能夠降解乙酰膽堿,終止神經遞質對突觸后膜的興奮作用,保證神經信號在生物體內的正常傳遞。Pea-Bautista等[14]提出,AD認知障礙患者的唾液乙酰膽堿呈高水平狀態,AD患者唾液中肌醇、肌酸、谷氨酰胺、乙酰膽堿4項聯合預測AD的敏感度為61%,特異性為92%。Ahmadi-Motamayel等[15]發現,AD患者的唾液AChE活性明顯比健康受試者的高,并提出唾液AChE活性可用于老年AD患者的早期檢測及AD患者的病情監測。但到目前為止,關于檢測唾液AChE診斷AD方面的研究樣本數量都較小,這種唾液生物標志物的臨床有效性還需要進一步在大樣本臨床研究中驗證。

2 炎癥及氧化應激損傷相關的標志物

2.1 乳鐵蛋白

乳鐵蛋白(lactoferrin,LF)是一種具有抗炎特性的免疫蛋白,其存在于黏膜表面。已有研究發現LF與神經退行性疾病AD之間存在一定聯系[16],可能與其能夠防止細胞損傷和組織損傷有關。LF通過舌下黏膜進入腦內,并通過抗炎和抗氧化功能的結合來保護大腦完整性[17]。Reseco等[18]通過ELISA檢測發現,唾液LF水平與人體腦內Aβ負荷的增加有關,其中唾液LF水平減少可能反映了Aβ對老年脆弱皮質區域的最早影響,腦內Aβ沉積會增加人體發生AD的風險,因此這項研究提示唾液LF水平檢測在未來或許能夠幫助預測AD進展。近年來,已有研究數據證明唾液LF有成為AD特異性診斷標志物的希望[19]。然而也有研究人員未在AD患者中發現唾液LF有特異性表現[20]。Antequera等[21]的一項研究表明,雙轉基因APP/PS1小鼠AD初始階段存在唾液LF水平降低的現象,且這種情況在AD中度至重度階段仍然存在。目前來看,研究間存在不一致的數據結果可能是因為研究對象存在疾病階段差異,因此唾液LF成為AD診斷生物標記物還需要進行規范化臨床調查研究進行驗證,而關于研究實驗前的AD精神診斷標準,未來研究應注重探索完善全球通用與地區通用的標準。

2.2 神經膠質纖維酸性蛋白

神經膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星形膠質細胞的中間絲蛋白,同時也是星形膠質細胞活化的特異性標志物,對神經起保護作用。在AD唾液檢測研究中,Katsipis等[22]分別運用ELISA與Dot blot技術檢測唾液中GFAP濃度發現,與對照組相比,MCI患者的GFAP濃度有所減少;與MCI患者和對照組相比,AD患者的GFAP濃度顯著降低;這兩種不同的免疫學方法確定的同組GFAP水平之間沒有發現顯著差異,其中唾液GFAP診斷AD在ROC分析中已經通過ELISA推薦臨界值(GFAP<4.0 ng/mg,約登指數為0.75,靈敏度為75%,特異性為100%)和Dot blot推薦臨界值(GFAP<5.6 ng/mg,約登指數為0.6,靈敏度85%;特異性為75%),研究提示唾液GFAP有望成為AD診斷生物標志物之一,也提示AD患者唾液GFAP濃度降低的原因是AD患者體外表達GFAP的星形膠質細胞退化,從而影響唾液中GFAP水平。

2.3 氧化應激損傷相關產物

氧化應激中的糖基化與AD高度相關,晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products,AGEs)通過活性氧調節淀粉樣前體蛋白表達,增強Aβ集聚,導致AD患者腦內的神經元死亡[23-25]。Choromańska等[26]研究發現區分癡呆患者組與對照組的非刺激產生唾液中最佳的熒光性AGEs值(AUC 0.85,P<0.001)為<1.451 RFU/mg蛋白,靈敏度為75.68%,特異性為75.86%。由于這項研究中呈現的結果強調了唾液AGEs可能是診斷癡呆的生物標志物之一,且AD屬于癡呆的主要病因,所以未來唾液中氧化損傷物的檢測可能會成為診斷AD的輔助手段。

3 口腔微生物群相關標記物

牙齦卟啉單胞菌是一種革蘭氏陰性細菌,是口腔微生物群落的重要組成部分。牙齦卟啉單胞菌能夠隨著循環系統到達血腦屏障,并增加血腦屏障通透性[27]。已經有研究提出,部分口腔致病菌數量的增加以及隨之而來的全身炎癥的增加可能是與AD相關的因素之一,這可能有助于將來更好地完善AD臨床診斷[28]。有研究表明,牙齦卟啉單胞菌在感染小鼠口腔后會進入腦內,最終導致小鼠腦內淀粉樣斑塊成分Aβ1-42的生成量增加[29]。Wu等[30]通過PacBio-SMRT測序平臺確定了口腔微生物群可以輔助診斷AD,而且還發現與對照組相比,AD組微生物多樣性較低,乳酸桿菌、鏈球菌和類桿菌的數量顯著增加,梭桿菌和變形桿菌的數量顯著減少。實際上相比于在唾液中檢測,診斷AD的微生物在腦脊液中檢測優勢更大,微生物標記物在唾液中檢測首要考慮因素就是牙周病等口腔疾病這類混在因素的干擾,因此微生物唾液診斷更偏向為AD輔助診斷手段。

4 代謝組學相關的標志物

研究人員可通過代謝組學技術觀察到人體內所有小分子代謝物的數據表達變化[31],由于代謝紊亂在AD患者神經病理進展中發揮著重要作用,所以許多AD研究開始重視AD患者的代謝產物變化,目前,關于檢測血液代謝物診斷AD方面的研究已經取得了一些進展[32,33]。一項調查AD患者血清代謝組學分析的研究顯示AD患者血清代謝組學數據有助于進一步了解AD的發病機制[34],并且已有研究[35]通過觀察AD患者唾液代謝組學數據發現,唾液代謝有著與血液代謝類似的動態變化,而且已初步證明唾液代謝物在AD生物標志物研究進展中存在重要開發價值,研究顯示與MCI組相比,AD組唾液中的β-丙氨酸通路、檸檬酸循環、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、苯丙氨酸代謝等通路的顯著上調。因此,相比于血液代謝組學檢測,唾液代謝組學檢測為AD唾液診斷提供了一種更簡單的非侵入性方法。Marksteiner等[36]在AD研究中通過靶向代謝組學方法檢測唾液,發現脂質紊亂在AD組和MCI組中十分突出,其中AD組患者唾液中的?；?烷基-磷脂酰膽堿減少,表明AD患者唾液中存在特定的脂質周轉率變化,且研究中的唾液脂質代謝產物可以成為識別AD患者的潛在生物標志物。也有研究開發出了快速超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用(FUPLC/MS)非靶向代謝組學方法作為識別AD患者唾液特征的平臺,并根據預測模型,選擇了胞苷和二氫鞘氨醇-1-磷酸代謝物作為主要候選生物標志物,用于預測MCI向AD的轉化[37]。上述研究均證明了唾液代謝組學的相關生物標志物具有幫助AD患者獲得正確診斷的潛力,但由于人體內唾液代謝產物是動態變化的,所以今后研究不僅僅只考慮規范收集樣本的時間,還應考慮到許多老年患者的身體狀況,研究是否會有合并疾病及服用過藥物對樣本數據的干擾。

5 遺傳學及基因組學相關的標志物

5.1 載脂蛋白Eε4

載脂蛋白Eε4(apolipoprotein E epsilon 4,ApoE4)等位基因是AD的主要遺傳危險因素[38,39]。ApoE4等位基因在AD的淀粉樣斑塊沉積、神經原纖維纏結形成和神經炎癥中都有重要作用[40-43]。González等[44]優化了Sanger測序,并從唾液中提取出DNA序列,分析了AD患者的ApoE基因型,研究發現與對照組相比,遲發性AD患者(34%)的ApoE4等位基因頻率增加了8.5倍。提示盡管ApoE4等位基因不能作為明確的AD診斷物,但有作為AD風險預測因子的潛力。

5.2 DNA甲基化

DNA甲基化是參與AD發生的關鍵因素之一,在AD病理進展中,PP2A低甲基化誘導tau磷酸化發生,最終導致神經原纖維纏結[45],胚胎大腦中由DNA甲基化控制表達的海馬突觸肽基因能夠調控中樞神經系統,該基因與神經發育和精神疾病相關,DNA甲基化又與腦內海馬區的突觸可塑性有關,當海馬區內出現全局DNA甲基化不平衡時,海馬體的完整性會遭到損壞,導致神經炎癥和細胞應激等病理表現的增加[46,47]。此外,腦部前額葉皮層(prefrontal cortex,PFC)突觸功能相關基因表達下的DNA甲基化,與衰老和年齡相關的認知障礙有關[48],而在2型糖尿病引起的認知障礙小鼠PFC中,參與突觸穩態性的蛋白質降低,基因啟動子位點CpG島甲基化百分比會增加[49]。

有研究發現在AD病理早期階段,人體額葉皮層的基因組中有71個離散CpG位點二核苷酸表現出與AD相關的DNA甲基化水平變化[50],這種變化一般發生在AD出現癥狀的初始階段。腦部PFC基因組中的DNA甲基化差異在AD的Braak病理分期中發揮著重要作用,在PFC和血液中的多數CpG位點提示,大腦和血液中DNA甲基化水平之間的相關性適中[51],然而與血液相比,唾液中的DNA甲基化水平更類似于腦組織中的水平[52],這可能是由于外胚層主要形成表皮和神經系統,唾液中的大量細胞來自于表皮組織頰黏膜上皮,它與中樞神經系統的組織細胞起源相同[53]。而關于唾液中頰黏膜上皮細胞在AD方向的研究很少,主要集中在細胞核內的端粒結構、DNA結構等[54,55],目前尚無關于唾液內頰黏膜細胞DNA甲基化與AD診斷的相關研究。

Sommerer等[56]在對神經退行性疾病患者和對照組的尸檢中,通過Illumina甲基化陣列檢驗口腔中頰黏膜上皮細胞和人腦PFC中的DNA甲基化,結果顯示在約25 000個CpG位點(約為總位點數量的3%)中,兩種組織存在顯著的Spearman等級相關性,其中99%的CpG位點在兩種組織中呈正相關,提示該條件下兩種組織中DNA甲基化模式一致。因為口腔中檢測的DNA甲基化可能會被口腔內細菌DNA干擾,所以有研究使用Illumina甲基化陣列與焦磷酸測序檢測唾液中DNA甲基化,從中提取了高質量的甲基化譜,排除了口腔內的細菌對實驗的影響[57],這與之前的多類生物標志物相比,唾液DNA甲基化在AD診斷中的應用優勢很明顯。先前研究人員在一項唐氏綜合征與DNA甲基化的研究中,選取了頰細胞的全基因組包括APP基因,檢驗DNA甲基化模式,發現3 300個CpG位點在組之間的差異甲基化,并在其中發現了與AD病理學相關的TSC2基因探針[58]。這或許提示,未來在唾液生物標志物和AD診斷的研究中,還可以考慮從唾液DNA甲基化位點作為切入點,探索AD的診斷甚至靶向治療。

6 總結與展望

唾液檢測在AD診斷中的主要優勢是簡便、安全,可在短時間內重復收集,并屬于非侵入性的標本采集。與血液、腦脊液采集等侵入性方法相比,唾液檢測能夠避免傷口感染,心理上也更容易接受。而在疾病后期,唾液診斷實際上對于AD這類有著認知障礙和運動障礙的高齡患者來說,更容易操作。不過,目前還沒有文獻明確提出基于唾液生物標志物可以進行AD診斷及疾病進展甚至預后的監測。且迄今為止并沒有文獻確定,僅單一的唾液生物標記物即可對AD進行診斷。展望未來,AD診斷唾液生物標記物可能是一組生物標志物,且最有可能是組合型的,即能與其他非唾液標記物聯合診斷AD或判斷AD發生風險指數。在疾病診斷過程中,唾液樣本采集的明顯缺點包括牙周組織疾病、口腔內食物殘渣,甚至吸煙等干擾,因此以后的AD唾液生物標記物研究應在標本采集方法、采集時口腔狀態、檢測技術等方面更加注意嚴謹操作?，F在關于生物標志物在疾病診斷與監測方面所需的技術研究越來越受到重視,但這項工作未來還需要收集更精確的臨床樣本數據。到目前為止,關于AD研究使用的診斷標準多種多樣,這提示研究人員在今后臨床方向的研究中,不僅要考慮規范樣本采集,還要考慮盡量規范臨床診斷標準,這樣才能最大程度地保證研究中呈現的數據結果能夠準確反映要解決的臨床問題。如今,AD診斷在唾液生物標記物方面的研究并不只在于發現新的診斷標記物,還在于驗證那些有診斷潛力的生物標記物,開發足夠靈敏的檢測方法,并闡述它們的使用方法。