基于物理方法的皮膚創傷動物模型構建及評價指標研究進展

歐雪，余志杰，何瑤，鄭曉媛?

（1. 重慶大學醫學院，重慶 400030；2. 重慶市第四人民醫院，重慶市急救醫療中心藥劑科，重慶 400014）

世界衛生組織（World Health Organization，WHO）將皮膚創傷定義為全球性公共問題，特別是需要長期治療的慢性傷口，給醫療保健系統帶來巨大的經濟負擔[1-2]。 隨著人口老齡化加劇，以及糖尿病和肥胖的影響，慢性創面的患病率不斷升高[3]。 面對該流行趨勢，迫切需要研究人員對其致病機制進行深入研究，動物模型則成為研究發病機制及治療靶點的主要工具，能彌補在細胞實驗水平缺乏的整體效應影響，為研究人員在整體水平研究皮膚創傷提供了可行性。 目前，皮膚創傷動物模型的構建主要以物理方法為主，如由物理因素造成的機械性損傷（擦傷、切割傷、刺傷、撕裂傷、咬傷、碾壓傷）、溫度性損傷（燒傷、燙傷、凍傷）、壓力性損傷和放射性損傷。 而不同的物理方法構建的動物模型其生物學特點有所差異。 因此，本文基于物理方法皮膚創傷動物模型的構建方法與評價指標，總結分析不同動物模型的優缺點，從而為構建科學合理的皮膚創面動物模型以及研究促進創面愈合的新療法提供參考意義。

1 小鼠模型及評價指標

1.1 小鼠全層皮膚創面模型

目前，構建小鼠全層皮膚創面模型主要采用近交系C57BL／6 及BALB／c 品系小鼠，通過活檢穿孔器或手術剪刀切除小鼠背部或后腿部分皮膚，從而制造1 ～6 個3 ～10 mm 直徑的圓形創面[4-8]。 值得注意的是，當創面直徑太小時，其傷口愈合時間越短、愈合速度越快，不利于需要長期觀察處理因素對傷口愈合的研究。 小鼠耳部皮膚相對較薄，制造1 mm 深至軟骨的小傷口，可在1 周后變為全層孔，該部位受呼吸運動的影響較小，容易觀察血管再生和傷口的愈合情況[9]。 另外，不同部位的創面其收縮程度不同，尾部與背部皮膚相比收縮程度更高，多依賴于上皮間質轉化使傷口閉合，其愈合時間較長，約21 d 才能完全愈合[10]。 同時尾部沒有致密的毛發，無需進行剃毛處理。 此外，由于裸鼠存在明顯的免疫功能缺陷特點且無毛發覆蓋，表現出嚴重的創面炎癥反應，造模成功率較高且能夠動態的可視化傷口愈合情況，也常作為皮膚創面模型動物，但其傷口愈合時間較長[11-12]。

小鼠全層皮膚創面模型主要通過對不同時間點的創面圖像分析， 利用組織病理檢查（histopathology examination， HPE） 和免疫組化（immunohistochemistry，IHC）法評價創面微環境炎性細胞浸潤及非炎性細胞遷移增殖分化程度，再通過定量分析炎癥因子如干擾素（interferon，IFN）-γ、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-6、 IL-10，生長因子如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、轉化生長因子（ttransforming growth factor，TGF ）-β1、 基 質 金 屬 蛋 白 酶 （ matrix metalloproteinases，MMP）、CXC 趨化因子等指標的表達水平，綜合評價模型的成功與否。 其通常在傷后12 h 炎性細胞開始浸潤傷口；24 h 內上皮開始增厚；48 h 內整個傷口表面開始發生再上皮化；5 d 新生血管生成；7 d 炎性細胞減少、實現完全上皮化；10 d 傷口完全愈合[4-6，8]。

1.2 小鼠切除性傷口夾板模型

人類皮膚傷口的愈合過程與小鼠不同，人類主要通過表皮再生促進傷口愈合，而小鼠則主要通過收縮反應[13]。 為克服這一問題建立切除性傷口夾板模型。 該類模型通常選擇內徑大于或等于創面直徑的環形塑料或硅膠夾板固定在傷口周圍，用強力膠或醫用粘合劑粘附，5-0 號尼龍線以間斷縫合的方式固定，從而保證其在傷口位置的長時間固定，直至傷口愈合[14-18]。 切除性傷口夾板模型小鼠普遍存在嚴重的炎癥反應，尤其是糖尿病小鼠的傷口炎癥則更為明顯，并且傷口容易感染且分泌物較多[19]。 因此在模型構建成功后多選擇Tegaderm 透明敷料覆蓋傷口，防止細菌感染和傷口干燥，同時該透明敷料也便于創面愈合情況的觀察。 此外，為避免小鼠轉頭咬斷縫合線，也可使用硅膠背心或醫用繃帶進一步包扎[17，20]。

此類模型已用于評估微移植物技術、細胞療法或機制研究對傷口愈合的效力[21-23]。 愈合初期炎癥階段，中性粒細胞、巨噬細胞、T 細胞數量顯著增加；增殖階段主要以CD31、CD34、Ki67、α-平滑肌動蛋白（smooth-muscle actin，SMA）、收縮上皮長度和再生上皮長度為指標評估創面血管生成、肉芽組織形成及再上皮化程度；MMP 活性常用來評價細胞外基質向瘢痕組織的重塑[14-18，20-23]。

1.3 小鼠皮膚移植模型

大面積皮膚創傷模型主要采用真皮模板、同種和異種皮膚移植、細胞片移植至裸鼠或免疫缺陷小鼠全層皮膚創面模型[24-27]。 該類小鼠由于缺乏T淋巴細胞、無胸腺，具有免疫功能缺陷的特點，因此對移植物的耐受性較好、移植排斥風險更低[25，28]。臨床上常用真皮模板修復皮膚，其可通過創造一個適合宿主細胞滲透和生成新真皮的微環境來取代受損的真皮，同時能抑制傷口收縮、減少瘢痕形成和纖維化。 目前，同種和異種皮膚移植也應用較廣，通?？蛇x擇中厚度或全厚度皮膚，前者愈合速度、血管重建快，僅需7 周時間就能脫去缺血結痂，而后者至少需12 周，但全厚度皮膚能更好的概括人類皮膚的完整結構[25-26]。 此外，也有學者選擇人上皮細胞片移植以評估工程細胞片保存技術，其能完全覆蓋創面、保存良好的細胞外微環境減少細胞凋亡，但移植前需花數周才能產生可移植物，耗時較長[27]。 此類模型多采用肉眼觀察表皮變化、炎性細胞浸潤及促（抗）炎因子表達、血管生成和移植物存活率等指標進行評價[25-28]。

1.4 小鼠潰瘍模型

潰瘍屬于慢性傷口，其具有時間長、過度炎癥反應、持續性感染及耐藥微生物生物膜形成等特點[29]。 目前，有學者通過結扎髂外動脈及切除股淺動脈誘導后肢缺血，再制造膝關節下全層創面以構建足潰瘍模型[30]；或是用兩個圓形磁鐵夾住小鼠背部皮膚12 h，取下磁鐵使血液正常流通12 h 以構建壓力性潰瘍模型[31]。 該模型與全層創面模型相比創面愈合率明顯更低，愈合速度更慢，14 d 仍有結痂，無法實現完全愈合，可用于研究慢性傷口愈合過程中各個階段相關參數的變化，如再上皮化百分率、上皮厚度指數、角質化、肉芽組織厚度和瘢痕抬高指數（scar elevation index，SEI）等[29-31]。

1.5 小鼠燒傷模型

小鼠燒傷創面模型采用沸水燙、紫外照射等物理損傷方式構建。 目前，多采用92 ～100℃水在小鼠背部燙傷，從而制造2 ～4 個燒傷創面或全身20%燙傷[32-33]。 該方法具有燙傷溫度和面積容易控制的優點，并且其作用均勻、重復性好、模型穩定。 另外，WONG 等[34]選擇C57BL／6 小鼠和受傷或燒傷后可完全再生皮膚的非洲刺毛鼠（Acomys），將其暴露于200 mJ／cm2的紫外線照射以構建小鼠燒傷模型。 48 h 急性紫外照射導致C57BL／6 小鼠表皮厚度增加及明顯的炎癥反應，此時角蛋白（keratin，K）14 表達水平顯著高于K10，角質形成細胞處于快速增殖狀態，而Acomys形成了K14＋／K10＋雙陽性中間層，使得角質形成細胞發生快速分化和凋亡，且無表皮增生和炎癥反應，從而實現傷口的快速愈合。 小鼠燒傷模型伴有極少或不出血的特點，可避免止血過程，其主要用于探究細胞療法促進皮膚組織再生的相關機制，通常以CD31、α-SMA、K10、K14 為指標評價血管生成能力和角質形成細胞的增殖情況[32-33]。

1.6 小鼠線性創傷模型

線性創傷模型多在小鼠背部或腹部，利用手術刀對皮膚進行切割以產生線性切口，長度以2 cm 左右為宜，深達筋膜。 此類模型可用于分析經皮給藥的藥物治療效果評價[35]。 該模型以創面抗張力強度（tension strength，TS）、瘢痕強度、HE 染色、血液分析為評價指標及方法，但不適于組織病理學與生化學指標的觀察。

其具體造模方法見表1。

表1 小鼠皮膚創面模型的構建及評價方法Table 1 Construction and evaluation methods of mouse skin wound model

2 大鼠模型及評價指標

2.1 大鼠全層皮膚創面模型

大鼠在生理學、形態學和遺傳學上都比小鼠更接近人類，因此大鼠成為生物醫學的更理想研究動物[36]。 目前，構建大鼠全層皮膚創面模型主要采用封閉群Wistar 及SD 白化大鼠，通過無菌活檢穿孔器、手術剪刀或金屬沖頭切除大鼠背部局部皮膚構建創面。 由于大鼠體型較大，因此，可制造1 ～6 個6 ～40 mm 直徑的圓形創面，但其創面愈合時間、模型穩定性、最終取材量普遍高于小鼠[37-42]。 其具體造模方法見表2，一般造模后7 d 內主要處于炎癥階段，7 ～14 d 主要表現為細胞增殖階段，第7 天開始細胞外基質重塑，完全愈合的時間受創面大小、位置、造模方式等因素影響[37-41]。 例如，為模擬慢性傷口不同程度的局部組織缺血，通過在大鼠皮下放置硅膜或玻璃蓋玻片的方法顯著延遲傷口的愈合[43-44]。 目前，此模型主要用于評估不同的藥物制劑、納米材料及細胞療法對傷口愈合的促進作用[45-48]。

表2 大鼠皮膚創面模型的構建及評價方法Table 2 Construction and evaluation methods of rat skin wound model

2.2 大鼠燒傷模型

通過熱金屬燙傷、電子束照射等物理損傷大鼠背部或臀部構建燒傷創面模型[49-50]。 采用金屬燙傷方法其操作簡單易行且燙傷面積便于控制，但存在金屬塊接觸燙傷區域的壓力難以控制、燙傷深度誤差較大的缺點。 而電子束照射則無需直接接觸致傷源，有效消除了這一影響，并且該方法在麻醉或者清醒狀態下均可進行，且無需剃毛，約1 周會發生脫毛現象，2 周出現大片干性皮膚脫皮，3 周皮膚變濕潤并有毛囊和紅斑出現[49]。 目前，燒傷模型已用于評估新型水凝膠和富氫水促進燒傷創面愈合的相關機制研究，通常造模1 周內IL-6 顯著增加，直到第4 周表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和超氧化物歧化酶（superoxide，SOD）表達水平逐漸升高，丙二醛（malon-dialdehyde，MDA）含量則呈下降趨勢，5 周可實現傷口完全愈合[49-50]。

2.3 大鼠口腔潰瘍模型

主要通過金屬球和30%冰醋酸浸泡的玻璃管按壓下牙齦或上顎以構建口腔潰瘍模型[8，51]。 口腔與皮膚組織不同，在愈合過程中表現出較少的炎癥反應，一般約12 d 恢復[51]。 由于口腔潰瘍病因復雜，發病機制不明，臨床上尚無特效治療藥物，因此該模型可用于探究治療口腔潰瘍的創新療法。

3 其他動物模型及評價指標

兔全層皮膚創面模型的構建多選1.5 ～2.5 kg 的新西蘭白兔，通過手術刀或剪刀切除背部皮膚，制造6 ～20 mm 的圓形或方形創面。 創面形狀不同對應的麻醉方式也不同，通常圓形創面采用肌肉注射鹽酸氯胺酮和賽拉津[52-53]，而方形創面則于4 個頂角皮下注射利多卡因[54]。 兔耳皮膚緊致毛發少，具有較多神經和血管，常于腹側制造6 ～8個7 ～15 mm 圓形創面，由于3 周內成纖維細胞數量顯著增加、膠原蛋白過度沉積、慢性炎癥引起SEI顯著增高，從而導致兔耳肥厚瘢痕，形成兔耳增生性瘢痕模型。 因此該模型常作為研究皮膚疤痕形成的細胞分子機制的首選模型[53，55-58]。

豬全層皮膚創面模型采用大型白色雜交豬、約克夏豬、皮特蘭豬，這類大型動物需在全麻情況下先繪制出傷口圖案，再通過無菌手術刀于背部單側或雙側制造6 ～20 個邊長20 ～50 mm 方形全層創面[59-61]。 豬皮膚的表皮、厚度、毛囊密度、皮脂腺等與人類皮膚相似，被認為是與人類皮膚進行比較的最佳實驗模型，但出于其不同位置收縮程度不同的特點，制造創面時必須嚴格依照標準化程序操作[62-63]。 因此，KUO 等[64]選擇體型、體重和生理狀態與人相似的小型蘭嶼豬，在背部兩側的不同位置制造創面陣列，建立最佳創面大小和相鄰創面最小距離的黃金標準，以有效區分各種干預措施，證實了背部皮膚的傷口位置不會顯著影響傷口的閉合或收縮。 此類模型可用于精確篩選不同創面敷料、細胞治療和藥物的有效性。

羊全層皮膚創面模型多選擇綿羊，在局部麻醉下，采用無菌手術刀片和方形導向器在背部制造1 ～4 個等距、邊長20 ～40 mm 方形創面。 一般需在致傷前1 個月進行驅蟲處理[65-66]。 然而，目前綿羊模型更偏向于骨骼、韌帶和肌腱方面的創傷研究，對皮膚創傷愈合的研究較少。

大型非嚙齒類動物模型造模后出血量較多，1 ～2 周內處于出血和炎癥階段且通常伴有大量滲出液，需定時更換傷口敷料[59-66]；2 ～3 周可觀察到新生肉芽組織形成、細胞外基質沉積和角質形成細胞再上皮化；2 個月基本可實現再上皮化和傷口完全閉合，但仍存在輕微炎癥；6 個月皮膚的細胞外基質重塑程度和拉伸強度仍未恢復到正常水平，若要實現完全恢復需一年或更長時間[52-66]。 詳見表3。

表3 其他動物皮膚創面模型的構建及評價方法Table 3 Construction and evaluation methods of other animal skin wound models

4 總結與討論

大小鼠價格相對低廉、易獲取，而大型動物成本高、飼養難，且皮膚創傷的操作過程及麻醉要求相對較高，因此常選擇大小鼠作為研究皮膚創傷的模型動物。 大小鼠全層皮膚創傷動物模型的構建與其他模型相比操作簡單、周期短、成模率較高，是探究皮膚創面愈合相關機制最常用的創傷模型。而切除性傷口夾板模型、皮膚潰瘍、移植模型和大型動物模型則耗時較長，需考慮夾板的縫合、控制缺血方式的選擇、移植物的準備及保存等問題，并且由于存在嚴重的炎癥反應和滲出物較多的特點，需定時更換敷料以保持傷口濕潤以及防止細菌感染。 但此類模型能夠更好地克服傷口收縮以模擬人表皮再生過程，常用于評估不同細胞療法對傷口愈合的效力。 通過紫外和電子束照射構建的燒傷模型具有燙傷面積易控制、無需直接接觸致傷源的優點，能夠有效減少金屬燙傷導致深度誤差較大的缺點，該模型可應用于臨床常見的燒傷患者和輻射燒傷患者皮膚創面愈合的相關研究。 大鼠口腔潰瘍模型是推動人類口腔內傷口愈合相關機制研究的關鍵一環，然而按壓金屬球和30%冰醋酸浸泡的玻璃管誘導的口腔潰瘍模型與臨床的口腔潰瘍仍有一定的差異，因此如何更好地模擬構建臨床口腔潰瘍模型仍需進一步的探索。

物理方法構建的皮膚創傷動物模型方法多樣，制造的創面沒有統一標準，通常為急性傷口，愈合時間較短且伴隨正常的炎癥反應，無其它的潛在影響因素。 而臨床上多為慢性傷口（如血管性潰瘍、糖尿病足潰瘍、創傷性潰瘍、壓力性潰瘍），影響因素復雜多樣，常表現為嚴重的炎癥風暴、細胞增殖較少、促生長因子表達較低，且常伴有細菌的感染?？梢?，通過物理方法構建的皮膚創傷動物模型與臨床患者的皮膚創傷微環境仍有一定的區別。 因此，下一步研究應聚焦于如何構建更加符合臨床皮膚創傷復雜微環境的動物模型，可通過移菌方式、皮膚移植、基因敲除鼠、物理化學協同誘導等方式構建多因素誘導的復合創傷模型，從而為開發促進皮膚創傷愈合的藥物研究、新療法提供參考依據。

此外，皮膚創傷動物模型的評價方法和指標，主要通過采集圖像進行傷口愈合過程中形態學分析，同時觀察炎性細胞浸潤程度、炎癥因子（IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10）及生長因子（VEGF、EGF、TGFβ1）的表達水平、細胞增殖Mark 蛋白（CD31、CD34、Ki67、PCNA、α-SMA、K10、K14）表達、細胞外基質重塑（MMP-1／2／9、Collagen-3、SEI）共同評價皮膚創傷模型及藥效指標。 然而，目前皮膚創面的圖像采集只限于某個時間點，無法動態監測記錄傷口的愈合過程，因此，創面愈合過程的動態可視化圖像采集仍存在挑戰和難點，如何通過微型生物傳感器、顯微成像儀等設備技術，研究可定量化創面面積、可視化創面圖像、動態化監測創面菌群變化設備仍需做進一步思考與探索，以確保皮膚創傷動物模型評價指標的科學化和精準化。

總之，目前皮膚創傷模型的構建仍處于探究階段，動物模型無法完全模擬人類皮膚傷口的愈合過程，與臨床患者相比仍有較大差異。 研究人員應根據動物品系多樣性、造模方法優缺點、評價指標的選擇性以及操作的可行性，充分結合研究目的，科學合理的選擇最優的皮膚創傷動物模型構建方法，旨在構建更符合臨床皮膚創面微環境的動物模型，為促進創面愈合的新療法、新材料、新藥物研究提供參考依據。