同位素內標稀釋超高效液相色譜-串聯質譜法測定植物源性食品中的6-芐基腺嘌呤

◎ 夏寶林，扈戰強，張亞清，殷晶晶，沈凌志，楊 娜，汪仕韜

（1.江陰市食品安全檢測中心，江蘇 江陰 214400；2.上海中僑職業技術大學，上海 201514）

6-芐基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）是人工合成的細胞分裂素，分子式為C12H11N5，廣泛用于植物組織的培養、果實生長及蔬菜保鮮等。過多的6-BA 會引發惡心、嘔吐等現象，甚至致癌、致畸。我國法律規定在豆芽生產過程中，禁止使用6-BA。

植物源性食品中的6-BA 殘留量檢測常用的凈化方法，主要有液液萃取[1]、固液萃取[2]、固相萃取[3]、QuEChERS 法[4]等。QuEChERS 法因操作簡便、所需溶劑少、提取效率高等優點得到廣泛應用。檢測方法主要有酶聯免疫法（ELISA）[5]、氣質聯用法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法。近年，液相色譜-串聯質譜法逐漸取代液相色譜法，被廣泛用于復雜基質中的目標物檢測。然而，6-BA受基質影響較大，采用基質匹配工作曲線才能準確定量，操作煩瑣，基質效應大。當使用同位素內標進行校準，無需針對不同類別的樣品制作不同的工作曲線，操作簡單且定量準確，具有廣泛的推廣意義。

本文針對不同植物源性樣品，進一步優化了QuEChERS 前處理方法，采用同位素內標進行定量，顯著降低了基質效應，建立了一種快速、準確、高效的植物源性食品中6-BA 殘留量的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

（1）Acquity UPLC-XEVO TQ-S 超高效液相色譜-串聯質譜儀（美國 Waters 公司）；Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（50×2.1 mm，1.7 μm 美國 Waters 公司）；MV5 濃縮儀（萊伯泰科有限公司）；2-16K 通用高速冷凍離心機（賽多利斯科學儀器有限公司）；CP512 電子天平（瑞士梅特勒公司）。

（2）6-BA 標準物質（純度99.2 %，德國Dr.Ehrenstorfer 公司）；6-BA-D5（純度98.32%，北京壇墨質檢科技有限公司）；乙腈、甲醇（HPLC 級，美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；甲酸、乙酸（色譜純，德國CNW 公司）；C18（十八烷基硅烷鍵合硅膠）、PSA（乙二胺-N-丙基填料）、無水硫酸鎂（MgSO4）、氯化鈉（NaCl）（分析純，上海安譜公司）；綠豆芽、黃豆芽、番茄、黃瓜、菠菜、葡萄等均購自無錫江陰當地超市。

1.2 標準溶液的配制

稱取6-BA-D5純品5 mg，溶解于甲醇，并定容至10 mL，配制成質量濃度為0.5 mg·mL-1的標準儲備液，于-20 ℃冰箱中保存。

準確稱取6-BA 標準品10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質量濃度為1 mg·mL-1的標準儲備液，于-20 ℃冰箱中保存。準確移取適量6-BA標準儲備液，用10%甲醇-水（V/V，含0.1%甲酸）逐級稀釋并配制適當濃度的標準工作液，其中內標濃度為5 ng·mL-1。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

準確稱取5.00 g 充分均質的試樣，加入50 μL 的100 ng·mL-1的內標，準確加入20 mL 乙腈，并振蕩提取20 min，依次加入4 g 無水硫酸鎂和2 g 氯化鈉，渦旋1 min 后以4 000 r·min-1的轉速離心10 min，取上清液待凈化。

1.3.2 凈化

將上清液轉移至加有1.2 g 無水硫酸鎂和250 mg PSA 的離心管中，對于顏色較深的試樣需另加30 mg的GCB，渦旋1 min，放置澄清后，取5 mL 上清液于另一10 mL 塑料試管中，在45 ℃條件下氮吹至干，用10%甲醇-水（V/V，含0.1%甲酸），渦旋復溶后過0.22 μm 濾膜，供超高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY BEH C18（50 ×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A 為0.1%甲酸-水溶液（V/V），B 為乙腈；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：10 ℃；進樣體積：5 μL；分析時間：5 min；梯度洗脫程序：0～0.2 min，5% B；0.2～2.0 min，5% B～80% B；2.0～2.1 min，80%B～90% B；2.1～3.0 min，90% B；3.0～3.1 min，90% B～5% B；3.1～5.0 min，5% B。

1.4.2 質譜條件

離子源：電噴霧電離（ESI）源，正離子模式，多反應監測模式（MRM）；離子源溫度：500 ℃；毛細管電壓：1.0 kV；去溶劑氣（高純氮氣）流速為800 L·h-1。質譜參數優化結果見表1。

表1 多反應監測離子及質譜參數表

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優化

6-BA 的結構中含有氨基，屬于堿性化合物，容易得到氫質子形成分子離子，在正離子模式下可以獲得較強的信號。采用甲醇－水為流動相時，響應值低，峰形拖尾嚴重。將水替換為0.1%甲酸水溶液，結果出峰時間提前，響應值增強了3 倍，峰形得到了明顯改善，最終選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

2.2 提取溶劑的選擇

本研究考察了不同提取溶劑對目標物的提取效率，結果表明，甲醇和酸性甲醇的提取效率較差，基質干擾嚴重。純乙腈作為提取溶劑時，因加入鹽有助于乙腈與水的分層，其提取效率顯著提高。純乙腈的提取效率優于1%乙酸－乙腈。因此，本研究最終采用乙腈作為提取溶劑。

2.3 凈化條件的優化

QuEChERS 凈化常見的吸附劑主要有3 種，分別是C18、PSA、GCB。本實驗主要考察3 種凈化劑以及其混合物對凈化效果的影響。PSA 可有效去除雜質，當使用量達250 mg 時，凈化效果良好，低于250 mg 時凈化不完全，大于400 mg 時，對目標物具有一定吸附，影響回收率。PSA 的使用量應在250～400 mg。C18具有一定去除色素的能力，但凈化效果較差。對于顏色較深的樣品，可以加入GCB，但用量不宜超過30 mg。另外，凈化管中加入無水硫酸鎂1.2 g，充分吸收水分，保證凈化效果。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍、檢出限、定量限

6-BA 在0.5～50 ng·mL-1的范圍內線性良好，線性方程為y=0.866x+0.023，相關系數（r2）為 0.999 9。6-BA 定性離子碎片信號強度遠遠低于定量離子，離子比率僅為0.028。為了安全起見，本文以定性離子信噪比確定檢出限，而非傳統的MRM 色譜峰。取陰性基質5.00 g，加入不同質量的目標物，靜置12 h 后，提取凈化，并上機測定，以定性離子的信噪比（S/N）大于3 倍時確定為檢出限，大于10 倍時確定為定量限，得到目標物的檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為1.5 μg·kg-1。圖1 為加標量為0.5 μg·kg-1的菠菜樣品中6-BA 多反應監測結果。

圖1 加標量為0.5 μg·kg-1 的菠菜樣品的6-BA 多反應監測圖（A 為226.2>91.1；B 為226.2>148.0）

2.4.2 準確度和精密度

取綠豆芽、黃豆芽、番茄、黃瓜、菠菜、葡萄等樣品各1 份，每份樣品均質后各稱取6 份，每份5.0 g于50 mL 離心管內分別加入50 μL 的6-BA-D5內標使用液（1.0 μg ·mL-1)，再準確加入一定量的6-BA標準溶液，分別制備成 10、30、50 μg·kg-1的加標樣品靜置 12 h 后，按 1.4 樣品處理操作，并重復測定6 次計算方法的準確度和精密度。不同樣品中，6-BA 的回收率為89.0%～110.3%，相對標準偏差為1.55%～3.56%。

2.5 樣品測定

利用所建方法對購于江陰市各大超市、農貿市場的綠豆芽、黃豆芽、西紅柿、黃瓜、蘑菇、圣女果各20 份進行檢測。3 份綠豆芽、2 份黃豆芽中有檢出，其中，最大值為72.5 μg·kg-1，最小值為5 μg·kg-1。

3 結論

本研究建立了植物源性食品中6-BA 的測定方法，樣品經乙腈提取、QuEChERS 凈化、高效液相色譜-串聯質譜檢測，并采用同位素內標法進行定量。結果表明，該法準確、可靠、高效，能夠滿足國內關于6-BA 殘留限量的要求。