供肝保存液的演變和革新

喻國濤 尹燕鋒 顏春濤 鄒光旭 張黃燕 馬麗 胡宗強

肝移植是治療各種終末期肝病唯一有效的方法[1]，該領域較為突出、普遍亟待解決的問題之一是供肝保存問題，維持供肝良好的功能是移植成功的首要條件和根本保障。如何減少離體肝臟在冷缺血期間的一系列損傷，改善和提高移植物的保存質量，是目前該領域研究的熱點和難點?，F階段，臨床上出現了各種類型的保存液來對抗供肝在冷藏期間的缺血損傷，但仍未達到理想的保存效果，尤其是對于邊緣供器官的保護作用不太理想。繼續采用傳統的保存方案可能越來越難適應當前社會醫療發展的需求，器官保存領域迫切需要迎來新的技術突破和革新。因此，在當今供者極度匱乏的情況下，為了改善移植物免受冷缺血損傷，其關鍵要素仍然是尋求最佳的供肝保存方案[2]。本文闡述了供肝保存液的發展現狀和演變歷史，總結了肝臟在離體狀態下的損傷機制及保存液的作用和原理，根據器官保存技術的發展探討供肝保存液的發展方向及面臨的困境，為供肝保存液的研發提供參考。

1 供肝在冷缺血期間的損傷機制

供肝從離體直至恢復血液的再灌注期間，將經歷不同程度的冷缺血期，引起缺血、缺氧及代謝物堆積等，致使移植物功能的下降[3]。在此期間，供肝的損傷主要表現為[4-6]：（1）在缺氧時細胞內氧化磷酸化受抑制，由有氧代謝轉變為無氧代謝，肝內儲存的能量底物（糖原等）被快速消耗，并產生大量的乳酸和氫離子引起組織細胞酸化、水腫加重，而細胞在酸性環境中容易受到損傷，進而影響溶酶體、內質網、線粒體等細胞器的功能。（2）隨著冷缺血期的延長，細胞無氧代謝增強，細胞內的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）大量分解引起細胞酸化、水腫加重、代謝廢物過度堆積、細胞內外離子穩態發生改變，導致肝臟組織學形態、細胞超微結構的完整性受到破壞。（3）低溫下細胞膜鈉泵（Na+-K+ATP 酶）等的活性顯著下降，細胞內環境穩態被打破，加速細胞水腫的發生。（4）在缺血缺氧期，肝細胞內代謝紊亂和能量底物快速耗竭，產生大量的黃嘌呤及活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）等，引起肝臟的脂質過氧化損傷。心臟死亡器官捐獻（donation after cardiac death，DCD）供肝由于經歷更長的熱缺血時間，細胞內的能量底物被過度消耗，容易引起移植物功能障礙的發生。而邊緣供者（如脂肪變性、高齡、小體積等類型的供肝）由于肝臟自身的脆弱性，在冷藏期間更容易受到損傷，甚至引發移植肝衰竭，增加了受者在移植術后移植物功能障礙和不良預后的發生率[7]。

2 供肝保存液的特征和演變歷程

2.1 供肝保存液的分類

經過了幾十年的努力，保存液領域取得了極大的發展，國內外已經出現了無數種保存液用于肝臟保存。保存液根據結構特點分為傳統低溫器官保存液[ 組氨酸-色氨酸-酮戊二酸保存液（h i s t i d i n etryptophan-ketoglutarate solution，HTK 液）、威斯康星大學保存液（University of Wisconsin solution，UW 液）等]和新型器官保存液[Institut Georges Lopez（IGL）-1 液等]。根據保存液中成分的特點分為仿細胞內液型保存液（Euro-Collins 液、UW 液等）、仿細胞外液型保存液（Celsior 液等）、血漿類似保存液、高滲型保存液、攜氧載體保存液、非體液型保存液。除此之外，隨著動態保存和超冷保存等新型器官保存技術的興起，各種用于器官保存的灌注溶液和超冷儲存溶液也相繼被開發。雖然各種類型的保存液在成份上有所差異，但是它們在肝臟保存中發揮的功能大致相同，主要是防止組織細胞水腫、提供能量底物、減少缺血損傷和抗凋亡等，以改善移植物的缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）以及促進移植物功能的恢復[8]。

2.2 供肝保存液的功能

目前，移植保存領域的焦點是不斷解決保存液的抗氧化、預防能量底物耗竭、減輕細胞水腫、攜氧等問題，從而穩定細胞內環境、減少線粒體損傷，促進移植物功能恢復。對于保存液的組成和功能，許多研究者認為，一款成熟的保存液至少要滿足以下幾個條件[9-10]：（1）有效防止低溫狀態下的細胞腫脹；（2）防止供肝在保存和灌洗期間細胞間隙發生膨脹；（3）防止組織細胞在保存期間發生酸化作用；（4）為低溫缺氧的肝細胞提供能量底物；（5）防止IRI。

氧氣是參與細胞代謝并產生ATP 的關鍵物質，也是細胞活動的驅動因素。一些學者認為即使將離體供肝置于0～4 ℃的環境中，仍需要向細胞供應少量的氧氣，而傳統的靜態冷保存（static cold storage，SCS）并不能滿足這一保存需求[11]。因此，許多學者通過向保存液中補充攜氧載體以解決低溫下細胞的耗氧問題，取得了較好的肝臟保存結果。其次，還有部分學者在保存液的基礎上添加抗冷凍成分解決了器官在深低溫下結冰的困境，采用超冷儲存可使供肝的代謝率降至最低水平，顯著延長了移植物的保存時間。

2.3 供肝保存液的成分

目前，雖然各種保存液在成分上存在一定的差異，但對于供肝保存的原理類似，根據其組成特點大致可分為以下幾個方面[12-14]：（1）膠體及非滲透性成分（羥乙基淀粉、聚乙二醇、葡萄糖、甘露醇、乳糖酸鹽、棉子糖、海藻糖等），主要是維持低溫缺血下離體器官中細胞和組織間質的正常形態及電解質平衡。（2）抗氧化的成分（別嘌呤醇、谷胱甘肽、色氨酸、N-乙酰半胱氨酸等），能夠減少細胞氧自由基和鈣離子超載的負擔，并清除細胞內的氧自由基，從而減輕IRI。（3）緩沖成分（磷酸鹽、碳酸氫鹽、組氨酸），主要是抵消細胞中無氧代謝途徑和ATP 分解產生的各種酸性代謝廢物。（4）能量底物成分（腺苷或谷氨酸/谷氨酸鹽、α-酮戊二酸等），能為肝細胞提供能量代謝基礎ATP 和改善的線粒體功能。（5）電解質成分（Na+、K+、Ca2+、Mg2+等），用于維持細胞內外各離子的平衡，減輕細胞水腫和酸中毒的程度。（6）超冷保存液中含有抗冷凍成分（聚乙二醇、海藻糖、3-O-甲基-D-葡萄糖、2，3-丁二醇等），具有防止細胞內、外結冰，穩定細胞膜，減輕細胞超冷損傷的作用。（7）動態保存液含有攜氧載體成分[ 血紅蛋白氧載體（hemoglobin-based oxygen carrier，HBOC）、大鼠或人濃縮紅細胞、牛HBOC-201、人源血紅蛋白囊泡、全氟碳化化合物、M101、納米載氧顆粒等]，為低溫下肝細胞提供氧氣。

2.4 供肝保存液的演變歷程

器官保存液是移植物保存中不可缺少的一個重要介質，能夠顯著改善移植物功能。截止至目前，國內外有數十種保存液可用于供肝的保存，如國外的UW 液、HTK 液、IGL-1 等；國內成熟的有高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液（HC-A 液）、CZ-1 液、HX-1 液等。目前絕大部分的保存液都是基于SCS 的觀念和原理開發。最初的保存液是1969年由Collins 等研制的Collins 液，它以葡萄糖作為滲透性物質，具有低鈉高鉀高鎂的特性[15]。1976年歐洲移植中心去除了Collins 液中的鎂離子，稱為Euro-Collins 液，它相對更符合細胞生理，但容易發生細胞腫脹，存在著較多的缺陷[16]。1970年由Bretschneider 教授研制了HTK 液，它最初用于心臟的保存，具有低鉀、低黏度、經濟等特點，被廣泛用于肝臟、腎臟等器官的保存[17]。1988年貝爾澤等研發了UW 液，使供肝在低溫下的保存時間由6 h 延長至20 h[18]。直至目前，HTK 液和UW 液仍是供肝保存液的“金標準”。而它們的出現似乎也開啟了保存液研發的新革命，推動了保存液發展的快速進程，以至于后繼的多種保存液都是在其基礎上改進或更新。研究顯示，HTK 液在預防術后膽道并發癥方面具有一定的優勢，但同時也增加了術后早期移植物功能丟失的風險，尤其是DCD 及冷缺血時間＞8 h 的供肝。而UW 液的高黏度易引起器官的灌注不均勻及沖洗不完全，增加了術后膽道并發癥的發生率，尤其對邊緣供器官的功能有著極大的影響[19]。雖然對兩者的爭論不一，但大部分研究認為使用HTK 液或UW 液保存供肝的肝移植受者在移植物存活、受者存活、原發性無功能（primary non function，PNF）發展和術后并發癥方面差異無統計學意義[20]。

目前，盡管有許多器官保存液相繼問世，但大多是基于HTK 液和UW 液的保存理念改進或優化。其中，以UW 液為基礎開發的保存液包括：（1）IGL-1液，其具有預防肝細胞和線粒體損傷的作用，聚乙二醇上調線粒體乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）2 的表達，并與谷胱甘肽結合，防止有毒醛加合物和氧化蛋白的形成，減輕肝臟的冷缺血損傷，同時能夠抑制細胞在冷藏期間發生自噬和凋亡。而通過IGL-1 液改進而來的IGL-2 液也顯示了獨特的線粒體保護作用[21]。（2）Dsol 液，溶液含30%的重水，具有抑制冷藏期間細胞Ca2+超負荷、減少線粒體損傷及維持細胞骨架完整性的作用，從而增強了細胞抗氧化應激、抗凋亡的能力[22]。（3）其它，由日本東京大學研制ET-kyoto 液、上海長征醫院研制的CZ-1 液等都借鑒了UW 液的優點。Custodiol-N 液是以HTK 液為基礎開發的保存液，加入了N-乙酰組氨酸、氨基酸和鐵螯合劑，能夠抑制移植物缺氧損傷及氧化應激的程度，并在保護微泡脂肪變性的供肝免受冷缺血損傷方面具有優勢[23]。同時吸取了HTK 液和UW 液優點的保存液有：（1）Celsior 液，是一種高鈉低鉀的仿細胞外液型保存液，具有低黏度、高鈉、低鉀等特性，能夠較HTK 液顯著降低移植術后的排斥反應發生率，為移植物提供了更好的耐受力。Celsior 液中加入雙氯芬酸能夠激活過氧化物酶體增殖激活受體-γ 并抑制核因子-κB 轉錄因子，顯著降低大鼠肝臟氧化應激、炎癥和凋亡的程度，改善移植物的功能[24]。（2）SMO 液，使用枸櫞酸鹽作為緩沖系統，擁有較強的緩沖能力，能夠保證溶液穩定的pH 值，并添加了多種與細胞保護相關的成分[25]。

一些學者通過向保存液中添加具有肝保護作用的成分，進一步提升了保存液的功能。其中在UW 液中的成分包括氫氣（富含氫的UW 溶液，能夠上調血紅素加氧酶的表達，且具有較強的抗氧化和抗炎作用，能夠減少IRI 誘導的氧化應激和炎癥反應）、二甲雙胍等[26-27]。向HTK 液中添加的成分包括甲烷（具有減輕線粒體呼吸及維持Ca2+平衡，保護冷缺血下的移植物形態，改善移植物功能）、復方甘草酸苷（降低低溫下的冷缺血損傷）等[28-29]。而IGL-1 中添加的有效成分包括褐藻多糖（改善細胞氧化應激和線粒體功能障礙）、曲美他嗪（減少冷缺血下的肝和線粒體損傷）等[30-31]。

我國中藥種類繁多、成分復雜，許多中藥成分尤其是從中藥中提取的某些單體成分或復合物，被證明具有顯著的肝保護作用，如三七中的皂苷成分、金線蓮中的槲皮素、五味子中的木脂素類化合物、黃芪、山銀花的醇提物及總皂苷等。許多學者也發現了中藥學的作用和優勢，從中藥中篩選高效低毒性的單體中藥成分加入保存液中，以減輕移植物的IRI，如HX-1液中的丹參、川芎嗪，具有保護上皮細胞（預防肝竇上皮損傷）、抗氧化、阻滯Ca2+內流及改善微循環等作用。據報道，許多中藥成分具有提高肝臟抗氧化能力、調節細胞代謝和自噬、抑制凋亡、改善脂肪肝、減少炎癥等作用，從而減輕肝臟的IRI，降低術后移植物PNF 和移植物丟失的風險[32-33]?，F在臨床采納的邊緣供者中有很大一部分的肝臟脂肪變性程度嚴重，可加入某些有效的中藥成分來改善供肝的質量，解決邊緣供肝保存后質量急劇下降的問題，從而緩解供者短缺的情況。在未來，可以充分發揮中藥的優勢，嘗試將中藥中具有保肝作用的某些單體或化合物成分聯合應用于供肝的保存，可能是一種有前途、有價值的保存液研發候選方案。

3 供肝保存液的發展方向

3.1 靜態冷保存型保存液

靜態冷保存是將供肝浸泡在特殊溶液（如UW 液、HTK 液）中，然后再置于冰上（4 ℃）冷藏保存，是目前供肝保存的金標準。其優勢在于低溫能夠顯著降低細胞的能量代謝和酶類分解，維持供肝的能量儲備，緩解缺血、缺氧造成的損害。其次，各種保存液中含有維持細胞滲透壓、抗氧化、能量底物等成分，更好地維持了移植物的功能。冷藏的缺點在于低溫顯著降低了細胞膜鈉泵的活性導致細胞內Na+濃度升高，容易引起細胞水腫。此外，細胞在低溫下仍有持續緩慢的代謝活動，隨著冷缺血時間延長，細胞受到的IRI 越嚴重，這將會增加負面的移植結果（如增加移植物功能延遲恢復、PNF、早期同種異體移植物功能障礙等的發生率），尤其是邊緣供者[34]。而SCS 不能通過循環除去在細胞內的堆積殘余產物，也不能滿足細胞氧耗需求等問題。因此，SCS 需要進一步解決供肝IRI 的問題，如氧化應激、氧耗、鈉泵失活、離子紊亂等，這將依托于保存液發揮的作用和功能。目前，雖然令人期待的動態保存技術已經興起，但是SCS 依舊是當前臨床最廣泛的供肝保存方案。在未來滿足于SCS 的保存液需要解決如下問題：（1）低溫下細胞的水腫及耗氧問題；（2）補充低溫下細胞緩慢代謝所需要的能量底物；（3）清除細胞代謝產物的堆積，促進線粒體功能的恢復等。

3.2 動態保存型保存液

動態保存方案是將器官在體外采用特定的溶液進行持續的機械灌注，被認為是拯救邊緣供肝的有效途徑，越來越受到肝移植領域學者的重視。動態保存依據溫度設定分為常溫機械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）、亞低溫機械灌注（subnormothermic machine perfusion，SNMP）、低溫機械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）。其中，常溫灌注液是模仿了血液的環境和條件，包含攜帶氧氣的紅細胞和各種營養物質。亞低溫和低溫灌注液主要是以各類型的保存液和攜氧載體為主。動態保存方案雖起步較晚，但相對于SCS 技術已經顯示出了明顯的優勢，尤其是在擴大標準供者（expanded criteria donor，ECD）供肝、脂肪變性供肝及高齡供肝等邊緣供肝中的潛在價值。目前，動態保存方案缺乏統一的保存液采納標準，仍以傳統的低溫保存液（UW 液、HTK 液、Celsior 液等）及各種攜氧載體為主，而一種有效的攜氧載體可以使溶液富含氧氣，是動態保存液中的重要組成成分。研究顯示，細胞供給適當的氧濃度有利于對抗氧化損傷、維持ATP 水平和線粒體功能，延長供肝對熱缺血的耐受性，并降低缺血性膽管病的發生率，尤其是對于DCD 和ECD 供者[35]。近年來，越來越多的學者也傾向于氧合保存液領域的研究，并在實驗中取得了令人滿意的結果。然而，動態保存液的研發相對復雜，除了要滿足于SCS 的基本要求外，仍需要進一步研究闡明溶液的營養物質含量、氧耗需求、黏度、滲透壓配比等問題。未來動態保存方案將會替代傳統的SCS，為供肝提供更優的保存需求，而動態保存液的研發也具有極大的前景和價值。

3.3 動靜態聯合保存型保存液

供肝在復溫階段經歷的瞬時高溫會加重移植物的損傷，此時肝臟結構的完整性也最受影響。相比之下，肝臟在沖洗和低溫保存期間所造成的損傷大部分卻是輕微、可逆的。而這種熱再灌注引起的復溫損傷與冷藏后移植物功能恢復遲緩或短暫的功能缺陷相關，并導致術后移植物功能障礙的發生。據報道，無論在冷藏期間是否充分滿足了器官能量、代謝等方面需求，始終存在器官面臨熱灌注帶來的瞬時高溫的脆弱性，甚至是采用持續的HMP 也不能避免復溫損傷的發生。供肝的復溫損傷主要發生于溫度升高至10～20 ℃，此時細胞內線粒體發生適應性功能障礙，引起氧自由基堆積、線粒體轉變孔開放、凋亡的誘導和呼吸鏈解耦聯[36]。

近年來，一些學者提出了“控制性攜氧復溫”（controlled oxygenated rewarming，COR）的修復方法，能有效降低供肝的復溫損傷，促進移植物功能的恢復。COR 指器官在冷藏結束后采用短暫持續的機械灌注，從低溫開始，然后逐漸升高至室溫。這種溫和的修復方法能夠避免突然激活功能尚未完全恢復的細胞，緩慢地促進細胞及線粒體功能的恢復、改善能量狀態和減輕線粒體誘導的細胞凋亡[37]。目前，采用動靜態聯合保存方案較SCS 有效減輕了移植物損傷的發生，然而與該保存技術相適應保存液相關研究較少，保存方案的選擇仍以傳統的靜態保存液（HTK液、UW 液等）為主，接下來需要繼續闡明在供肝的氧合復溫階段，采用單純的靜態保存液是否存在復溫不足、能量底物過度損耗或短缺、耗氧增加、溶液黏度過低或過高等問題，這些仍值得我們進一步探索，也需要開發一種理想的保存液來減輕肝臟的IRI程度。

3.4 超冷保存型保存液

當供肝的保存環境低于0 ℃時，細胞的新陳代謝進一步降低，有利于維持供者的能量儲備和細胞穩態，延緩肝臟的退化。然而0 ℃以下會引起肝組織內冰的形成，冰對移植物的功能是極其有害的。到目前為止，還沒有實質性的方法能夠解決結冰器官在解凍后的功能恢復及損傷問題。近年來，一種新的器官保存方案——過冷保存的出現為供肝保存提供了另一選擇，它通過添加冷凍保護劑，使保存溶液的液相保持在0 ℃以下，達到完全避免組織內外冰晶的形成，防止結冰造成的細胞損傷[38]。更重要的是，目前該技術已經實現了保存人類肝臟同時避免組織內結冰的重要突破。過冷保存方案包括過冷儲存和機械灌注兩個階段，冷儲存結束后依靠短暫持續的機器灌注恢復肝臟的功能。一項研究顯示，過冷保存可以使肝臟在不凍結的情況下冷卻到6 ℃，并保持存活長達96 h[39]。因此，過冷保存明顯延長了供肝保存的時間，但是適用于該保存技術的保存液仍以傳統的靜態保存液及各種冷凍保護劑為主，需要改進或優化。冷凍保護劑是超冷保存液中的重要組成成分，需具備防止細胞內外結冰、穩定細胞膜、無肝細胞毒性等作用，亟須進一步開發更理想的抗冷凍成分。目前，對超冷保存液的研究相對較少，接下來還需要深入了解深低溫下的細胞內環境情況、亞細胞結構變化、滲透壓等問題，從而開發適用于過冷保存相關的保存液，搭配與之適應的保存液，提升供肝保存質量。

4 小結與展望

自20世紀以來，供肝的日益短缺促使人們積極尋找擴展肝源的新策略，包括使用ECD，然而這些“非最佳”的移植物通常肝功能儲備低，在冷藏期間容易發生IRI，面臨術后移植物功能延遲恢復和更低的存活率等風險。離體供肝保存是調節和再生移植物的重要途徑，有望在移植前改善供肝的質量，但是這些ECD 對保存有著嚴格的要求，選擇傳統的保存方案和技術已經難以滿足對其保存的要求。目前，盡管有動態保存、超冷保存技術的相繼出現，并提供了更好的移植物保存效果，遺憾的是尚未在臨床上推廣使用，而與之搭配的器官保存液也尚未形成共識，需要探索并闡明各種保存技術下供肝的細胞代謝、損傷機制及保存需求，開發與之適應的保存液以提升供肝的保存質量。在未來，我們需要開發新型的保存液，加快并推廣新型器官保存技術的使用，希望借助于保存能力的提升，提高邊緣供肝利用率，緩解供者緊缺的局面。