非心源性腦梗死患者miR-124、miR-210 表達與頸動脈狹窄的關系

曹秋菊 張利娟 李圓圓

腦梗死是腦部血液供應障礙、血管閉塞致局部腦組織缺血缺氧而引起的一種神經功能缺失表現，也稱缺血性腦卒中。腦梗死在臨床多表現為突發性的昏倒、意識喪失，語言智力障礙等［1］。根據腦梗死發病原因可分為心源性和非心源性，心源性往往自身具有心血管疾病，臨床常予以預防手段；而非心源性患者因無明顯誘因易被忽視，常以急性腦梗死為主，對患者的生命威脅更大。頸動脈粥樣硬化斑塊脫落是非心源性腦梗死的常見原因，頸動脈狹窄程度也與腦梗死病變程度密切相關，且頸動脈狹窄的患者腦梗死復發率也較高［2］，故認為對非心源性腦梗死患者頸動脈狹窄情況進行評估對其臨床診療具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類由20～25 個核苷酸組成的小分子單鏈RNA，其在細胞內具有多種重要的調節作用［3］。miR-124，miR-210具有調控血管生成、介導細胞氧化應激的作用，在血管類疾病和代謝性疾病中具有重要地位［4-5］。本研究將探討非心源性腦梗死患者miR-124、miR-210表達與頸動脈狹窄的關系，以期為臨床診療補充循證依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究獲取院方倫理委員會通過，選取2021年1 月至2022 年12 月成都醫學院第二附屬醫院·核工業四一六醫院收治的124 例非心源性腦梗死患者作為觀察對象，根據是否存在頸動脈狹窄分為狹窄組（n=64）和無狹窄組（n=60）。納入標準：①符合非心源性腦梗死標準［6］，且經MRI 影像學確診；②狹窄組患者均經頸動脈超聲確診存在斑塊或有內膜增厚［7］；③患者家屬對研究內容了解并同意入組。排除標準：①合并心血管疾??；②合并惡性腫瘤；③精神疾病或意識障礙；④臨床資料缺失者。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-124、miR-210表達水平檢測

均于入院時抽取患者靜脈血3 mL，采用Ficollhypzue 細胞分離液（美國phannacia 公司）分離出外周血單個核細胞。采用Trizol 試劑（上海雙達生物技術有限公司）抽提單核細胞中總RNA，計算RNA的濃度和純度。按TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit 逆轉錄試劑盒說明書（北京伊塔生物科技有限公司）以RNA 為模板進行逆轉錄獲得cDNA 并置于4℃保存。實時熒光定量法進行血清miR-124、miR-210相對表達量測定，以U6為內參，2-ΔΔCT法表示表達水平，反應體系為20 μL。miR-124反應條件為：95℃15 s，60℃60 s，85℃15 s，60℃15 s，設置40 個循環。miR-210反應條件為：95℃15 min、94℃20 s、60℃34 s，設置40 個循環。引物序列：U6：上游引物序列：5′-TGCGGGTGCTCCGCTT-3′，下游引物序列：5′-CAGTGCAGGGTCCGA-3′；miR-124：上游引物序列：5′-GATACTCATAAGGCAC GCGG-3′；下游引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGAG GT-3′。miR-210：上游引物序列：5′-CGTGTGAGAGCGGCTGAAA-3′；下游引物序列：5′-TATGGTTGTTCTTCTCGTCTCCTTCTC-3′。

1.2.2 血清超敏C 反應蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）檢測

抽取患者空腹靜脈血3 mL，分離血清（3 500 r/min，10 min，離心半徑8 cm），提取上清液，采用ELISA 法檢測Hcy、hs-CRP 水平（試劑盒：上海酶研生物科技有限公司）。

1.2.3 頸動脈狹窄程度分級［7］

輕度狹窄為＜30%；中度狹窄為30%～70%（包含30%）；重度狹窄為70%及以上。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行處理并分析，計量資料經檢驗后滿足正態分布以（）表示，兩組間行t檢驗，多組間用方差分析；計數資料用n（%）表示，行χ2檢驗；采用Pearson 相關性分析相關指標，采用Spearman 相關性分析不同狹窄程度與血清miR-124、miR-210的相關性，以P＜0.05 時為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較

兩組一般資料（年齡、性別、BMI、基礎疾病、家族遺傳史、吸煙史、飲酒史）比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料比較［（），n（%）］Table 1 Comparison of general data between the two groups［（），n（%）］

表1 兩組一般資料比較［（），n（%）］Table 1 Comparison of general data between the two groups［（），n（%）］

2.2 兩組血清miR-124、miR-210 表達水平比較

狹窄組血清miR-124、miR-210表達水平均低于無狹窄組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組血清miR-124、miR-210 表達水平比較（）Table 2 Comparison on expression levels of serum miR-124 and miR-210 between the two groups（）

表2 兩組血清miR-124、miR-210 表達水平比較（）Table 2 Comparison on expression levels of serum miR-124 and miR-210 between the two groups（）

2.3 兩組血清hs-CRP、Hcy 水平比較

狹窄組血清hs-CRP、Hcy 水平高于無狹窄組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組血清hs-CRP、Hcy 水平比較［（），mg/L］Table 3 Comparison of serum hs-CRP and Hcy levels between the two groups［（），mg/L］

表3 兩組血清hs-CRP、Hcy 水平比較［（），mg/L］Table 3 Comparison of serum hs-CRP and Hcy levels between the two groups［（），mg/L］

2.4 不同頸動脈狹窄程度患者血清miR-124、miR-210 表達水平比較

重度狹窄組患者的血清miR-124、miR-210表達水平均低于輕度和中度狹窄組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 不同頸動脈狹窄程度患者血清miR-124、miR-210表達水平比較（）Table 4 Comparison on expression levels of serum miR-124 and miR-210 in patients with different severity of carotid stenosis（）

表4 不同頸動脈狹窄程度患者血清miR-124、miR-210表達水平比較（）Table 4 Comparison on expression levels of serum miR-124 and miR-210 in patients with different severity of carotid stenosis（）

注：與輕度狹窄組比較，aP＜0.05；與中度狹窄組比較，bP＜0.05。

2.5 不同頸動脈狹窄程度患者血清hs-CRP、Hcy水平比較

hs-CRP、Hcy 水平：重度狹窄組＞中度狹窄組＞輕度狹窄組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 不同頸動脈狹窄程度患者血清hs-CRP、Hcy 水平比較［（），mg/L］Table 5 Comparison of serum hs-CRP and Hcy levels in patients with different severity of carotid stenosis［（），mg/L］

表5 不同頸動脈狹窄程度患者血清hs-CRP、Hcy 水平比較［（），mg/L］Table 5 Comparison of serum hs-CRP and Hcy levels in patients with different severity of carotid stenosis［（），mg/L］

注：與輕度狹窄組比較，aP＜0.05；與中度狹窄組比較，bP＜0.05。

2.6 血清指標間及與頸動脈狹窄程度的相關性

hs-CRP、Hcy 水平與頸動脈狹窄程度均呈正相關（P＜0.05），miR-124、miR-210與hs-CRP、Hcy水平、頸動脈狹窄程度均呈負相關（P＜0.05）。見表6。

表6 血清指標間及與頸動脈狹窄程度相關性Table 6 Correlation among serum indexes and their correlation with carotid stenosis

3 討論

頸動脈粥樣硬化斑塊脫落是非心源性腦梗死常見病因，頸動脈狹窄程度與病變程度及復發風險有關，故對頸動脈狹窄程度進行評估具有重要意義。

既往有研究顯示［8］，在由頸內動脈狹窄導致的急性冠狀動脈綜合征（ACS）或缺血性腦卒中中，miRs是潛在的重要診斷和預后生物標志物。本研究結果顯示，狹窄組患者血清miR-124、miR-210表達水平均低于無狹窄組，說明miR-124與miR-210可能與頸動脈狹窄發生有關。分析其原因可能是，miR-124可有效增加抗調亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl）表達，促進M2 表型小膠質細胞/巨噬細胞生成，具有減輕神經炎性反應、抑制神經元調亡、減少缺血性腦損傷的作用，在神經血管重塑中具有重要地位［9］，當其水平降低，說明腦缺血癥狀嚴重，可能與狹窄形成有關。既往也有研究［10］提出，miR-124是真核生物中保守的非編碼RNA，是調控基因表達的關鍵途徑，在中樞神經功能調節和腦發育中具有重要地位。miR-210是一種缺氧激活因子，可在缺氧環境中促進新生血管生成，改善機體缺血缺氧狀態。一項動物實驗［11］表明，miR-210可促進腦缺血后血管新生，與腦梗死的疾病進展有關。在頸動脈狹窄形成初期，腦供血處于微缺氧狀態，此時miR-210水平仍處于較高水平狀態，但出現嚴重腦出血時，血管堵塞嚴重，此時機體呈現低氧狀態，miR-210受低氧誘導因子的誘導轉錄，水平降低，促進頸動脈狹窄發展。本研究結果與既往研究部分相似［12-14］。

炎性反應和氧化應激是動脈粥樣硬化斑塊形成的病理基礎。本研究結果顯示，狹窄組hs-CRP、Hcy 水平高于非狹窄組。分析其原因是，hs-CRP是機體炎性反應標志物，可激活多種補體系統，合成和釋放炎性介質，生成氧化自由基分子，損害血管內皮細胞，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成，形成動脈狹窄。Hcy 屬于氨基酸的一種，正常情況下在機體內濃度水平較低，而當Hcy 代謝異常時，可引起機體糖脂代謝紊亂，導致機體脂質物堆積，促進動脈粥樣硬化斑塊形成；Hcy 還可促進低密度脂蛋白進行自我氧化，形成氧化修飾低密度脂蛋白，被巨噬細胞攝取轉變為泡沫細胞而損害血管內皮細胞功能［15］，進一步加速動脈粥樣硬化，形成頸動脈狹窄。既往亦多有研究證實hs-CRP、Hcy 水平增高與腦梗死患者頸動脈狹窄的關系［16-17］。進一步研究說明miR-124、miR-210可能通過調控hs-CRP、Hcy 促進頸動脈狹窄形成，提示血清miR-124、miR-210表達水平可成為評估頸動脈狹窄的輔助性指標，為臨床診療提供指導。

綜上所述，miR-124、miR-210可能參與頸動脈狹窄的形成，其表達水平檢測或可作為評估非心源性腦梗死頸動脈狹窄程度的輔助性指標。