一步法在泌尿生殖系統感染病原體核酸檢測中的臨床應用評價

黃國妮 顏申姬 程靜 謝閏萍

泌尿生殖系統感染包括生殖道、泌尿道和性傳播的流行性傳染病，已成為公共衛生系統中最常見的傳染病之一［1-2］。感染病原體常見的包括沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，CT）、解脲支原體（Ureaplasma urealyticum，UU）、淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhea，NG）、人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）、單純皰疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）和陰道毛滴蟲等［3］?？梢鸲喾N泌尿生殖系統疾病，超過99%的宮頸癌和超過90%的肛門癌是由HPV 陽性引起的［4］。CT 和NG都可能會引起輸卵管損傷，不僅可能引起盆腔炎和女性不孕，還會增加異位妊娠和流產、早產的風險［5］。新生兒如果從陽性的母體中感染HSV，可能會累及中樞神經系統并造成嚴重后果［6］。隨著分子診斷技術的發展，近年來分子診斷產品實現了大規模的生產和應用。聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）兼具特異性強和靈敏度高等優點，逐漸成為泌尿生殖系統感染疾病診斷的主要檢測手段之一，尤其適用于感染的早期診斷和無癥狀感染者的檢測［7］。

PCR 包括三個主要步驟：核酸提取純化、核酸擴增和核酸檢測。核酸提取是最基礎的步驟之一，并且是許多分子診斷實驗的先決條件，提取的核酸的質量和完整性將直接影響后續實驗檢測的結果［8］。傳統的煮沸法是目前臨床上應用較為廣泛的提取方法，但是需要經過反復離心和加熱等繁瑣步驟，同時加熱的過程中極易產生氣溶膠，導致樣品間污染產生假陽性結果［9］。近年來一步法提取試劑在市場上逐漸得到應用推廣，通過釋放劑和少量樣品直接反應即可獲得適用于擴增的核酸成分，在速度、經濟和效率等方面均具有巨大的優勢［10］。作為一種較新穎的提取方法，目前關于一步法用于泌尿生殖系統感染臨床樣本檢測的研究相對較少，本研究將探討其用于泌尿生殖系統感染病原體核酸檢測的可行性，為一步法實現廣泛的臨床應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2021 年3 月至2021 年8 月期間到深圳市寶安區人民醫院門診就診的200 例泌尿生殖道感染患者作為本次研究對象，其中男性95 例，女性105 例，年齡在20～66 歲之間。納入標準：所有患者根據臨床表現均被確診為泌尿生殖系統感染；首次就診；對本研究知情同意。排除標準：納入患者就診前2 周有抗生素使用史；嚴重器質性功能異常者；合并其他陰道疾病者；認知功能障礙者；拒絕參與本研究者。采集樣本包括宮頸分泌物和尿道分泌物，所有采集過程均按無菌操作進行。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 試劑

一步法樣本釋放劑由湖南圣湘生物科技有限公司購入，煮沸法核酸提取試劑和病原體基因檢測試劑均由中山大學達安基因股份有限公司提供。

1.2.2 儀器

實時熒光定量PCR 分析儀（Cobas z480，德國Roche）、高速冷凍離心機（Centrifuge 5430R，德國Eppendorf）、Bioer 恒溫金屬浴。

1.3 實驗方法

1.3.1 病原體陽性率統計

本院2021 年1 月至2021 年3 月泌尿生殖系統感染患者的病原體感染情況。見表1。

表1 1 225 例泌尿生殖系統感染患者熒光定量PCR檢測結果（n，%）Table 1 Test results of PCR in 1 225 patients with urogenital infection（n，%）

1.3.2 核酸提取

在采集到的樣本中加入1 mL 生理鹽水，充分振蕩混勻樣本。①一步法：吸取200 μL 樣本至0.5 mL 離心管中，12 000 r/min、離心半徑6 cm 離心5 min 后去上清，加入50 μL 核酸釋放劑充分振蕩混勻后靜置10 min，獲得一步法核酸模板待測。②煮沸法：吸取200 μL 樣本至0.5 mL 離心管中，12 000 r/min、離心半徑6 cm 離心5 min 后去上清，加入50 μL DNA 提取液充分振蕩混勻，放入100℃恒溫儀中處理10 min，12 000 r/min、離心半徑6 cm 離心5 min 后獲得煮沸法模板待測。

1.3.3 一致性實驗

按照試劑盒說明書的操作要求，分別將上述經處理的核酸模板和PCR 反應液混勻，按設定的程序上機擴增，對擴增后的結果按說明書要求進行判讀。比較兩種提取方法所得陽性檢出率的一致性。

1.3.4 靈敏度實驗

分別選取三種檢測項目中的陽性樣本進行10-1～10-4的梯度稀釋，獲得不同濃度的陽性樣本分別使用一步法和煮沸法進行核酸提取后進行PCR擴增，各樣本均重復測量3 次，比較兩種提取方法的提取靈敏度。

1.3.5 抗干擾性實驗

留取健康人血性分泌物樣本（外觀紅褐色或紅色，通過病原體核酸檢測結果均為陰性）10 例，振蕩混勻后備用；健康人黏性分泌物樣本（外觀渾濁或膠凍狀，通過病原體核酸檢測結果均為陰性）10 例，振蕩混勻后備用。選取三種檢測項目中陽性樣本各一例，每例均分為3 管為一組，每組分別加入生理鹽水、血性樣本和黏性樣本進行10 倍稀釋。分別使用一步法和煮沸法對以上3 組樣本進行核酸提取和擴增，各樣本均重復測量3 次。運用公式：干擾偏移%=（干擾值-對照值）/對照值×100% 作為干擾實驗的判斷標準。

1.3.6 精密度實驗

分別選取三種檢測項目中高濃度及低濃度陽性樣本各兩例，由同一檢測人員分別使用一步法和煮沸法平行重復做5 次核酸提取，連續進行5 天，進行PCR 擴增后記錄相應陽性結果的Ct 值，計算變異系數CV 值，比較兩組提取方法的提取重復性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行數據分析，圖表使用GraphPad Prism 8.0 軟件繪制。計數資料以n（%）表示。一致性實驗結果分析使用kappa 檢驗，Kappa 值≥0.75 時一致性良好，0.4 ≤Kappa ＜0.75時一致性一般，Kappa ＜0.4 則表示兩者一致性差。

2 結果

2.1 兩種提取方法的一致性比對

200 例泌尿生殖道感染患者樣本用兩種提取方法提取擴增后結果見表2，一步法和煮沸法對CT、UU 和高危HPV 的陽性率分別為9.5%、39.5%、7.5%和10.5%、38.5%、8.0%，有5 例樣本出現結果不符，對陽性率一致性進行Kappa 檢驗，Kappa 值為0.949，一致性良好。

表2 兩種提取方法的檢測結果比較［n（%）］Table 2 Test results of the two extraction methods［n（%）］

2.2 兩種提取方法的靈敏度比對

在1∶103的稀釋濃度范圍內，兩種提取方法均可以檢測出相應的陽性結果；對選取的高危HPV陽性樣本兩種提取方法可檢測出最高1∶105的稀釋濃度。見圖1。

圖1 兩種提取方法的提取靈敏度比較Figure 1 Comparison of sensitivity between the two extraction methods

2.3 兩種提取方法的抗干擾能力比對

兩種提取方法的干擾偏移均在10%以內。見表3。

表3 兩種提取方法的抗干擾結果比較Table 3 Comparison of anti-interference ability between the two extraction methods

2.4 兩種提取方法的精密度比對

兩種提取方法的批內和批間精密度結果見圖2。結果顯示一步法的批內精密度在2.17%～4.86%之間，批間精密度在2.70%～4.77%之間；煮沸法的批內精密度3.94%～4.35%之間，批間精密度在3.50%～4.91%之間，兩種提取方法的CV 值均在5%以內。

圖2 兩種提取方法的精密度結果Figure 2 Comparison of repeatability between the two extraction methods

3 討論

PCR 包括三個主要步驟：核酸提取純化、擴增和檢測。目前臨床上有多種用于核酸提取的方法：柱式法，操作復雜需要重復離心且采用特殊濾膜成本較高等原因，雖提取純度較高但在臨床上難以推廣應用。磁珠法，以磁珠吸附的方式進行核酸提取，自動化核酸提取儀的生產和應用實現了臨床上大批量樣本的操作要求，目前市面上自動化核酸提取儀提取時間為18～45 分鐘，提取較費時，同時對儀器設備的要求較高限制了其在基層醫院的推廣和應用。煮沸法是目前臨床上應用比例較高的提取方法，需要重復離心加熱等繁瑣步驟，加熱的過程中極易產生氣溶膠，導致樣品間污染。一步法將待測樣本和樣本釋放劑混合均勻，反應時間僅需10 分鐘左右無需加熱，與傳統煮沸法相比具有更快速、操作更簡單的方法學優勢［11］。本研究通過一步法與傳統煮沸法在泌尿生殖系統感染病原體核酸檢測中的一致性、靈敏度、抗干擾能力和重復性進行了對比，驗證一步法用于泌尿生殖系統病原體核酸檢測的可行性。

一致性實驗結果顯示200 例樣本中僅出現了有5 例不符樣本，對這5 例不符樣本進行測序結果顯示，2 例一步法陽性煮沸法陰性測序結果2 例樣本均為陽性，這兩例樣本均為弱陽性樣本（Ct 值37.5～38.73），表明一步法具有更優異的提取效率；3 例煮沸法陽性一步法陰性測序結果為2 例陰性、1 例陽性，推測煮沸法導致此2 例假陽性結果的可能原因是煮沸法加熱離心的步驟易出現氣溶膠污染導致假陽性結果?？傮w而言，兩種提取方法的kappa 檢驗結果具有較高的一致性。

臨床樣本中干擾PCR 檢測結果的因素主要有膽紅素、血紅蛋白、免疫球蛋白、肝素等。在分泌物中常見的干擾樣本類型為血性分泌物和黏性分泌物；血性分泌物中含有的血紅蛋白和黏液標本中含有的黏蛋白和多糖等成分均會抑制DNA 聚合酶的活性，對PCR 結果造成影響［12-13］。本實驗中兩種提取方法均對血性分泌物和黏性分泌物具有一定的抗干擾能力。

靈敏度實驗和重復性實驗結果顯示這兩種提取方法比較無顯著性差異。一步法的提取過程只需要簡單的操作步驟即可獲得與傳統煮沸法相同甚至靈敏度更高的實驗結果，節省了相應的儀器耗材和時間成本，更重要的是可以節約檢驗時間使患者和臨床更快速獲得檢驗報告減少等待時間，具有極大的臨床應用價值。

目前關于一步法的臨床應用研究國內外亦有相應的文獻報道，張運洪等［14］通過實驗結果認為一步法缺少核酸提取的過程，對弱陽性的新型冠狀病毒容易出現漏檢的風險，不適用于新型冠狀病毒核酸檢測。表明一步提取法具有其方法學優勢的同時亦有其方法學缺陷，應用于臨床不同的檢測項目前需要先對其適用性進行方法學評價，本研究認為一步法在泌尿生殖系統病原體感染核酸檢測項目中具有非常好的臨床應用能力。