KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1 基因聯合檢測在結直腸癌中的表達

杜勁 齊妍 曾妍 邱瑾 王吉林 莊斯慧 黃政華

結直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是臨床最常見的消化道惡性腫瘤，相關數據顯示，中國的結直腸癌發病率處于較高的水平，在所有的癌癥中發病率位居第五，且呈逐年上漲的趨勢［1］。近年來，CRC 的潛在基因改變被大量發現，精準預測患者預后，不僅有利于制定醫療方案，同時也有利于提高患者生存情況和生活質量［2-3］。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）單克隆抗體的發明使臨床CRC 治療邁入個體化靶向精準治療的時代，但是在臨床治療中，僅有少部分CRC 患者對抗EGFR 靶向藥物敏感［4-5］。KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK為CRC 患者抗EGFR治療療效的有效預測分子。其在CRC 患者中均具有不同程度的突變比例。對KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK等基因突變狀況的檢測對于提高CRC 患者治療效果及預測其預后具有重要作用。本研究 主要探 究KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1基因突變與CRC 患者臨床病理特征存在的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取CRC 患者200 例作為研究對象，收集所選取研究對象的臨床資料。并收集其CRC 手術切除或穿刺活檢標本提取DNA。納入標準：①所有患者均通過病理證實為CRC；②術前均未接受放、化療及免疫治療；③均接受根治性切除手術；④患者對本次研究知情同意。排除標準：①有明顯的系統性炎癥或感染；②存在血液系統疾病、高熱；③合并腸穿孔、腸梗阻或其它惡性疾病。本研究符合倫理委員會批準。

1.2 檢測方法

收集所選取CRC 患者手術切除或穿刺活檢標本提取DNA，采用人類癌癥多基因突變聯合檢測試劑盒檢測KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1基因突變狀態，嚴格按照試劑盒操作說明書進行，主要步驟為文庫構建→雜交捕獲→上機測序，以檢測結果為準。

1.3 臨床資料收集及隨訪

收集所選取CRC 研究對象的臨床資料包括年齡、性別、腫瘤TNM 分期、組織學分類、分化程度等臨床病例資料。所有患者均在門診執行常規隨訪：第一年每3～6 個月隨訪一次，接下來毎6 個月隨訪一次，通過影像學檢查了解腫瘤復發情況，并最后通過病理學檢測確診?？偵鏁r間為由首次確診日期到死亡日期或存活的患者至末次隨訪日期。無瘤生存時間為由手術日期到疾病復發日期或無復發的患者至末次隨訪日期。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行數據分析。計數資料采用n（%）表示，行χ2檢驗。計量資料采用（）表示，兩組間比較采用t檢驗。KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1基因突變間的相關性采用Spearman 等級相關分析。繪制ROC 曲線分析相關指標單一檢測及聯合檢測的診斷價值，同時采用Kaplan-Meier 生存曲線和Log-rank 法比較兩組患者的生存率，Cox 回歸綜合生存分析影響患者預后的危險因素。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1 突變基因分別在不同CRC 患者臨床病理特征中的比較

KRAS、BRAF基因突變率與pTNM 分期有關（P＜0.05），NRAS、PIK3CA、NTRK1基因突變與患者的性別、年齡、CRC 組織學分級、淋巴結轉移、pTNM 分期比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1 基因突變與CRC 患者臨床病理特征的關系［n（%）］Table 1 Relationship between KRAS，NRAS，BRAF，PIK3CA，NTRK1 gene mutations and clinical pathological characteristics of CRC patients［n（%）］

2.2 KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1 基因突變的相關性

200 例CRC 患者KRAS 與BRAF 基因突變存在負相關性（r=-0.157，P=0.027），其余基因間突變均無相關性（P＞0.05）。見表2。

表2 KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1 基因突變的相關性Table 2 Correlation of Mutations in KRAS，NRAS，BRAF，PIK3CA，and NTRK1 Genes

2.3 KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1 基因檢測對CRC 復發情況的預測價值

KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1單一基因檢測與多基因聯合檢測對CRC 復發情況均具有一定價值，但多基因聯合檢測價值更高，其中KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA與NTRK1基因聯合檢測對CRC 復發情況的診斷準確性最高（AUC=0.797），但KRAS、BRAF、PIK3CA與NTRK1聯合檢測靈敏度最高（0.861），PIK3CA單一檢測特異度最高（0.969）。

2.4 KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1 基因突變與CRC 患者預后間的關系

KRAS突變患者第3 年和第5 年總生存率及無瘤生存率最高，總生存率中其次為NRAS基因突變患者；無瘤生存率中PIK3CA基因突變者最高。見表3。

表3 KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1 基因突變與CRC 患者預后間的關系Table 3 Relationship between KRAS，NRAS，BRAF，PIK3CA，NTRK1 gene mutations and prognosis in CRC patients

2.5 CRC 患者總生存時間的危險因素分析

單因素分析結果顯示，年齡＞60 歲，KRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1基因突變為影響CRC 患者總生存時間的危險因素（P＜0.05）。多因素分析結果顯示，年齡＞60 歲，KRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1基因突變為影響CRC 患者總生存時間的獨立預測因子（P＜0.05）。見表4。

表4 單因素和多因素Cox 回歸綜合生存分析Table 4 Comprehensive survival analysis of univariate and multivariate Cox regression

3 討論

目前個體化精準治療在CRC 治療中備受重視。其中基因檢測指導下的靶向藥物聯合治療是CRC 治療的熱門方向之一［6-7］。該方法采用不同的靶向藥物阻斷CRC 調控通路的不同位點，在臨床試驗過程中獲得了很好的療效［8-9］。KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1等基因是現階段CRC 預后預測較熱門的分子標志物。KRAS與NRAS均為EGFR 下游信號轉導通路的重要調控基因。當KRAS與NRAS發生突變時將激活RAS 蛋白，進而激活MAPK下游信號因子，使抗EGFR 治療療效降低或喪失。大約有60%的轉移性CRC 患者攜帶對抗EGFR單克隆抗體耐藥的KRAS或NRAS突變，這嚴重影響患者的治療效果，使預后不良［10-11］。而BRAF為KRAS下游分子，同樣參與MAPK 信號通路的調控，在CRC 的突變率為10%～25%，是早期及晚期復發性非高度微衛星不穩定腫瘤的強力不良預后指標［12］。PIK3CA屬于PI3K-Akt信號通路，是關鍵的原癌基因，當PIK3CA突變會引起PI3K酶處于持續激活狀態，增強細胞內信號的傳導，導致整個通路的紊亂，促進結直腸癌干細胞的存活和增殖，導致細胞抵抗化療藥物。

確定CRC 患者各突變基因與臨床特征的關系，有助于針對不同患者制定個體化精準治療方案，提高患者治療效果。本研究中，KRAS、BRAF基因突變與pTNM 分期有關，與患者的性別、年齡、CRC 組織學分級、淋巴結轉移、血清CEA 及CA199 水平無明顯相關，NRAS、PIK3CA、NTRK1基因突變與患者的性別、年齡、CRC 組織學分級、淋巴結轉移、pTNM 分期、血清CEA 及CA199 水平等均無明顯相關。同時本研究對各基因突變的相關性進行研究，結果顯示KRAS與BRAF基因突變存在一定的相關性，其余基因間突變均無相關性。該結果表明，KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1等基因的突變相互獨立，雖有部分患者基因檢測結果存在兩個或多個基因突變，但各基因間突變存在各自獨立的致病機制并不存在關聯。本研究結果顯示KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1單一基因檢測與多基因聯合檢測對CRC 復發情況均具有一定價值，但多基因聯合檢測 價值更高，其中KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1基因聯合檢測對CRC 復發情況的診斷準確性最高，但KRAS、BRAF、PIK3CA與NTRK1聯合檢測靈敏度最高，PIK3CA單一檢測特異度最高，各院可根據具體需求對CRC 患者進行基因檢測。

綜上所 述，CRC 患 者KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、NTRK1基因突變無明顯相關性，但各基因單一或聯合檢測對對CRC 復發情況具有一定價值，且各基因突變患者的生存時間減少，可作為患者預后評估的重要指標。