自建微流控-芯片法檢測布魯氏菌的性能驗證及評價

董占柱 陳昊 孫欣 包春喜 李英智 牛藝卿 李翔 郝明媛 杜彥丹★

布魯氏菌?。˙rucellosis，（簡稱布?。┦怯杉毎麅燃纳牟剪斒暇˙rucella，（簡稱布氏菌））引起的一種人獸共患傳染性疾?。?］。人感染布氏菌后，臨床表現以發熱、關節疼痛、乏力為主；動物感染布氏菌主要表現為流產、生殖器官病變和死胎［2-3］。目前布氏菌的主要檢測方法包括血細菌分離培養鑒定（簡稱血培養）、血清學和分子生物學方法。血培養是布病診斷的“金標準”，但耗時長，檢出率低，且存在一定的實驗室獲得性感染的風險［4-6］?；⒓t平板凝集試驗（Rose-Bengal Plate Agglutination Test，RBPT））和血清試管凝集試驗（Standard Tube Agglutination Test，SAT））是診斷布病的重要檢測方法，但其受諸多干擾因素影響特異性不高、敏感性差，存在較大程度的假陽性概率［7-8］。熒光探針RT-PCR 存在著假陰性率較高的缺陷［9］。而微流控-芯片法（Microfluidic chip，MC）具有快速、高靈敏、高通量、低消耗，特異性好等特點［10］，可彌補現有檢測技術短板，該技術的臨床應用將對布魯氏菌病的診治起到關鍵指導作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源

陽性標本為內蒙古林業總醫院檢驗科收集的經BACTEC FX 血培養儀鑒定為布氏菌陽性菌株，陰性標本為本院收集的無布氏菌疫苗接種史、RBPT 陰性及血培養布氏菌陰性健康體檢者血清。用于敏感性及特異性驗證的136 例血清標本收集于2021 年5 月至2022 年8 月就診于內蒙古林業總醫院、呼倫貝爾市人民醫院、呼倫貝爾市傳染病醫院，長期生活于牧區且有發熱、關節疼痛、乏力等臨床癥狀患者。所有標本均凍存于-80℃冰箱。研究對象均鑒署臨床研究知情同意書。本文已通過內蒙林業總醫院倫理審查委員會審查。

1.2 儀器與試劑

核酸提取、擴增與芯片雜交采用北京博暉核酸芯片檢測儀（BHF-VI），BACTEC FX 全自動細菌培養系統購自碧迪公司。布氏菌微流控-芯片檢測試劑為本實驗室自主構建并委托北京博暉集成為檢測芯片試劑盒，企業參考品購自北京睿博興科。

1.3 方法

自建部分內容詳見李翔、董占柱等［10］發表的《微流控芯片技術在布魯氏菌檢測中的應用》。本文參照CNAS-GL039：2019《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》［11］、《實驗室自建分子診斷項目基本要求專家共識》［12］、《布魯菌病診療專家共識》［13］相關要求僅對自建微流控-芯片法檢測布魯氏菌的性能部分進行探討。用于驗證的臨床標本及企業參考品等均按照自建試劑盒步驟進行操作：①將前期處理好的標本，手動使用移液器取100 μL 加入微流控-芯片加樣孔，關閉儀器艙門。②運行檢測程序：布氏菌DNA 核酸提取、PCR 擴增、反向斑點雜交、CCD 掃描分析實驗結果、結果判定。

1.3.1 符合率驗證

選取本院微生物室-80℃凍存的布氏菌血培養陽性菌株20 例進行復蘇、傳代，挑取單個克隆菌落，使用PBS 稀釋液制成0.5 MCF 菌懸液，取100 μL菌懸液以陰性血清為基質梯度稀釋至約1.50×103CFU/mL 作為待驗證的陽性標本；選取本院收集的健康體檢者血清20 例為待驗證的陰性標本，每例標本重復檢測3 次，與“金標準”血培養進行比較，計算檢測結果陽性符合率、陰性符合率和總符合率；評價標準：總符合率＞90%。

1.3.2 重復性驗證

選取濃度分別是1.50×108CFU/mL、500 CFU/mL 的布氏菌陽性標本。每天檢測1 個分析批，每分析標本檢測1 次，連續檢測20 天，兩名檢測人員應用兩臺核酸芯片檢測儀、兩個批次試劑交叉檢測方式進行；評價標準：布氏菌陽性標本檢出率＞90%。

1.3.3 檢出限驗證

將包含自建試劑所檢測布氏菌核酸序列的企業參考品（濃度1.00×105copies/mL）用無RNA 酶的DEPC 水梯度稀釋100 倍至自建試劑盒檢出限濃度1 000 copies/mL，批內重復檢測20 次；評價標準：布氏菌企業參考品陽性檢出率≥95%。

1.3.4 交叉反應驗證

選取與布氏菌血清有交叉凝集現象的菌株及病原體：EB 病毒核酸（濃度1.00×106copies/mL），人巨細胞病毒核酸（濃度1.00×105copies/mL）；肺炎鏈球菌標準菌株、大腸桿菌標準菌株、金黃色葡萄球菌標準菌株、肺炎克雷伯菌標準菌株、快長分枝桿菌標準菌株用PBS 稀釋液制成0.5MCF 菌懸液，取100 μL菌懸液以陰性血清為基質梯度稀釋至1.50×105CFU/mL，以此濃度為待驗證的標本，各標本批內重復檢測3 次；評價標準：布氏菌檢測結果應為陰性。

1.3.5 抗干擾能力驗證

結合血液標本常見內源性干擾物質及臨床用藥干擾情況，制成混有30%血液、0.9 mg/mL 黏蛋白、0.3 mg/mL 多西環素、3 mg/mL 鏈霉素、1.2 mg/mL 復方新諾明、2.25 mg/mL 環丙沙星、6 mg/mL頭孢曲松、4.5 mg/L 妥布霉素、15 mg/L 慶大霉素、30 mg/L 利福平干擾物質的弱陽性（濃度500 CFU/mL）布氏菌懸液，對照組加入等量體積的生理鹽水。各標本分析批內重復檢測3 次，評價標準：弱陽性布氏菌標本檢測結果仍為弱陽性。

1.3.6 臨床敏感性及特異性驗證

用微流控-芯片法對136 例血液標本進行檢測，每例標本重復檢測3 批次，結合臨床診斷及已有文獻報道數據，分析微流控-芯片法的敏感性驗證及特異性可接受度。

1.4 統計學處理

采用Excel 2019 和jamovi 2.3.21 進行數據處理，計數資料采用n（%）表示。

2 結果

2.1 符合率驗證

20 例陽性標本中微流控-芯片法3 次重復檢測結果均陽性，20 例陰性標本3 次重復檢測均陰性。陽性符合率100%，陰性符合100%，總符合率100%，滿足評價標準，驗證通過。見表1。

表1 符合率實驗結果Table 1 Coincidence rate test results

注：陽性符合率=60/（60+0）×100%=100%；陰性符合率=60/（60+0）×100%=100%；總符合率=（60+60）/（60+0+0+60）×100%=100%

2.2 重復性驗證

高、低濃度兩例陽性標本20 批次重復檢測結果均陽性，檢出率100%，滿足評價標準，驗證通過。

2.3 檢出限驗證

1 000 copies/mL 企業參考品20 次重復檢測結果均陽性，檢出率100%，滿足評價標準，驗證通過。

2.4 交叉反應驗證

用于交叉反應驗證的各病原體3 次重復檢測結果布氏菌核酸均陰性，與布氏菌無交反應，滿足評價標準，驗證通過。見表2。

表2 交叉反應實驗結果Table 2 Cross-reaction test results

2.5 抗干擾能力驗證

混有相應濃度干擾物質的布氏菌弱陽性標本3 次重復檢測結果均陽性，滿足評價標準，驗證通過。見表3。

表3 抗干擾實驗結果Table 3 Anti-interference ability test results

2.6 敏感性及特異性驗證

結合患者臨床表現及實驗室檢查（SAT 滴度≥1∶100++），136 例血清標本中臨床診斷為布病89例；SAT 滴度＜1∶100++，不排除布病47 例。89 例診斷為布病的標本微流控-芯片法3 次重復檢測結果檢出80 例布氏菌核酸陽性，9 例陰性。47 例SAT滴度＜1∶100++的標本微流控-芯片法3 次重復檢測共檢出布氏菌核酸陽性2 例，陰性45 例。檢測敏感性與特異性分別為89.88%和95.74%，能夠滿足輔助臨床診斷的需求。

3 討論

由于感染布氏菌1～2 周左右機體開始產生抗體或者抗體處于低水平，布病血清學方法在窗口期檢測的陽性率不高［14］，不能區分慢性和急性布病患者，而微流控-芯片核酸檢測在布病早期的診斷中受窗口期期影響較小，機體感染布氏菌初期即可進行核酸檢測，對于布病的及時檢出、及時治療及疫情防控具有重要意義。47 例SAT 滴度＜1∶100++標本微流控-芯片法3 次重復檢測中第1次檢出1 例陽性；第2、3 次重復檢測結果一致均檢出2 例陽性且涵蓋第1 次的陽性標本結果，標本中布氏菌載量處于檢出限濃度附近或是標本檢測前離心不徹底可能是導致該結果出現的主要原因，SAT 陰性標本中微流控-芯片法能夠檢出布氏菌DNA，表明其敏感性優于SAT，這與Elena Navarro等［15］人報道的分子檢測技術在布氏菌感染診斷中的敏感性高于SAT 較為一致。血培養適合于布氏菌病的分離和鑒定，但該方法的敏感性較低，依賴于布氏菌的種類、疾病的階段、培養基的類型等［16］。熒光探針RT-PCR 經過多年的發展已被用于布病原體檢測和臨床輔助診斷中，但用于診斷布病的商業核酸擴增檢測產品仍然有限［17］，而且已發表的評估商業和自制分子檢測不同性能的比較研究仍然很少。

綜上所述，本實驗室自建微流控-芯片法在布氏菌感染檢測中的符合率、重復性、檢出限、抗干擾能力、交叉反應指標均滿足指南及專家共識要求，敏感性及特異性與于艷妮等［18］人報道的分子檢測技術在布氏菌感染診斷中的敏感性和特異性分別為95.7%和92.2%接近，推薦用于臨床標本的檢測。