三味甘露對大鼠肝纖維化的改善作用及機制 Δ

陳秀梅 ，王英杰 ，趙成周 ，李 真 ，張文惠平 ，羅唐君 ，劉 鑫 ，孫勝男 （.青海大學醫學部藥學系，西寧 8006；.青海大學藏醫學院，西寧 8006）

肝纖維化是肝臟受到慢性或反復損傷后，在炎癥的刺激下引起的可逆性病理改變，是發展為肝硬化及肝癌的早期階段。肝纖維化主要由病毒性肝炎、自身免疫性疾病、脂肪肝和酒精肝等引起，主要表現為細胞外基質（extracellular matrix，ECM）過度沉積與增生[1]。炎癥是肝纖維化發展的主要因素，可大幅度加快纖維化進程[2]。因此，減少ECM 的沉積，抑制炎癥因子的釋放，是抗肝纖維化研究的重點。

三味甘露是藏醫臨床常用于治療肝臟疾病的藥物。該方最初來源于《集賢十萬頌》，由土木香Inula heleniumLinn. 、寒水石（水煮）和異葉青蘭Dracocephalum heterophyllumBenth 組成。其中，土木香富含倍半萜內酯類，具有良好的抗炎活性，還有抗腫瘤、驅蟲、鎮痛、保肝及降糖等多重活性[3]。寒水石主要成分為碳酸鈣，另含有少量鎂、錳、鐵和微量鋅、銅等成分，在藏醫藥臨床上主要用于治療消化不良引起的胃病和肝膽疾病[4]。異葉青蘭富含黃酮、生物堿、萜類、揮發油等活性成分，具有顯著的抗炎、抗氧化、保護心血管、護肝等藥理作用[5]。近年來，許多藏醫藥專家將三味甘露用于酒精性肝損傷、慢性肝炎、肝纖維化與肝硬化等肝病治療之中，臨床效果顯著[6]，但是其作用機制尚不清楚。本研究以四氯化碳（CCl4）誘導大鼠肝纖維化模型，考察三味甘露對肝纖維化大鼠的改善作用及機制，旨在為肝纖維化的治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Infinite M200 Pro型酶標儀（瑞士Tecan公司）；BE-9008型微孔板孵育振蕩器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；PA53型熒光顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

三味甘露（青藥制備字Z20200689001，批號20220415）購自青海省藏醫院藥房；水飛薊賓膠囊（國藥準字H20040299，批號16041601，規格35 mg）購自天津天士力圣特制藥有限公司；CCl4（批號20220422）購自天津市富宇精細化工有限公司；玉米胚芽油（批號20220509）購自山東西王食品有限公司；氨基甲酸乙酯（批號C15354509）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；蘇木素-伊紅（HE）、Masson、Sirus Red 染色試劑盒（批號分別為20220918、20220811、20220824）均購自北京索萊寶科技有限公司；丙氨酸轉氨酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate transaminase，AST）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（批號分別為ER02ZJDX2075、ER00VHH29083）均購自美國Elabscience 公司；透明質酸（hyaluronic acid，HA）、層粘連蛋白（laminin，LN）、Ⅲ型前膠原（procollagen type Ⅲ，PCⅢ）和Ⅳ型膠原（collagen type Ⅳ，COL-Ⅳ）ELISA 試劑盒（批號分別為20230309、20230309、20230721 和20230721）均購自南京建成生物工程研究所；白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-1β ELISA 試劑盒（批號均為202307）均購自江蘇酶標生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

SPF 級SD 雄性大鼠，體重（200±20）g，購自西安交通大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號為SCXK（陜）2018-001。大鼠在青海大學藥學系實驗動物房喂養，每天給予標準飼料，自由進食與飲水。本研究動物實驗經青海大學醫學院醫學科學研究倫理委員會審查批準（倫理號2023-029）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

將60只SD大鼠隨機選取10只作為正常組，余下大鼠按2 mL/kg 腹腔注射50%CCl4-玉米油溶液誘導肝纖維化模型，每周2次。造模給藥第6周開始，除去造模死亡的5只大鼠，將剩余大鼠隨機分為模型組、水飛薊賓組（陽性對照）和三味甘露低、中、高劑量組，每組9只，造模同時給予藥物治療。水飛薊賓組大鼠灌胃水飛薊賓50 mg/kg（溶劑為生理鹽水，給藥劑量參考相關文獻[7]設置），三味甘露低、中、高劑量組大鼠分別灌胃80、250、800 mg/kg三味甘露（溶劑為生理鹽水，低劑量為臨床等效劑量，參考《新藥臨床前研究的劑量設計要點》和《藥理實驗方法學》及2022年青海省實驗動物從業人員培訓的建議，以3.16倍遞增并取整），正常組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水。所有大鼠每天給藥1次，共4周。

2.2 樣本采集

記錄各組大鼠實驗期間的日常情況。第9周實驗結束時，每組隨機選取6只大鼠（剩余大鼠用于后續組學測序，另文發表），取材前1 d大鼠禁食不禁水，實驗中使用20%氨基甲酸乙酯溶液麻醉大鼠，稱重后腹主動脈取血，并分離肝臟、脾臟。血液靜置1 h后，離心取上清液，待測。肝臟和脾臟在4 ℃預冷生理鹽水中漂洗2～3遍，濾紙吸干后稱重。然后取各組大鼠肝臟左葉同一部位，用4%多聚甲醛溶液固定，剩余組織以液氮速凍后置于－80 ℃冰箱保存，待測。

2.3 臟器指數計算

根據肝臟、脾臟質量與大鼠體重，計算臟器指數。臟器指數＝臟器質量/體重×100%。

2.4 肝組織病理形態學觀察

取固定在4%多聚甲醛溶液中的肝組織，制成病理切片后，分別進行HE 染色、Masson 染色和Sirus Red 染色，熒光顯微鏡下觀察大鼠肝組織病理形態學變化。

2.5 肝功能、肝纖維化及炎癥因子指標測定

采用ELISA 法檢測。取“2.2”項下血清樣品和速凍肝組織，按試劑盒說明書方法測定血清中AST、ALT、PCⅢ、COL-Ⅳ、IL-6、IL-1β、TNF-α 含量和肝組織中LN、HA含量。

2.6 統計學方法

用SPSS 21.0軟件對實驗數據進行統計學處理。實驗數據用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊性，組間比較采用LSD-t檢驗；若方差不齊，組間比較則采用DunnettT3檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 大鼠日常情況

正常組大鼠日常狀態良好，體重增長穩定，毛發光潔；模型組大鼠體重增長緩慢，食欲下降，糞便稀溏且毛發粗糙無光澤；與模型組相比，三味甘露各劑量組和水飛薊賓組大鼠體重增長略快，毛發光澤有所改善。

3.2 三味甘露對大鼠臟器指數的影響

與正常組相比，模型組大鼠的肝、脾臟指數均顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，三味甘露各劑量組和水飛薊賓組大鼠的肝、脾臟指數均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組大鼠臟器指數比較（±s，n＝6）

表1 各組大鼠臟器指數比較（±s，n＝6）

a：與正常組相比，P＜0.01；b：與模型組相比，P＜0.05；c：與模型組相比，P＜0.01。

組別正常組模型組三味甘露低劑量組三味甘露中劑量組三味甘露高劑量組水飛薊賓組肝臟指數3.13±0.15 4.25±0.23a 3.74±0.41b 3.70±0.05b 3.50±0.17c 3.36±0.39b脾臟指數0.16±0.02 0.29±0.08a 0.23±0.04b 0.22±0.03c 0.24±0.04b 0.20±0.03c

3.3 三味甘露對大鼠肝組織的病理學變化的影響

3.3.1 HE染色結果

正常組大鼠具有結構完整的肝小葉，肝細胞分布整齊有序，以中央靜脈為中心，向周圍散開呈放射狀，未見有關壞死或炎癥浸潤，無纖維化表現。模型組大鼠肝細胞壞死，表現為大面積的炎癥細胞浸潤，匯管區及靜脈周圍可見大量纖維組織增生并形成纖維橋接。與模型組相比，三味甘露各劑量組大鼠中央靜脈區附近炎癥細胞均不同程度減少，肝索排列較為整齊、清晰，纖維組織增生也不同程度減輕；水飛薊賓組大鼠炎癥細胞浸潤現象減輕，肝細胞排列有序，未見脂肪空泡，靜脈周圍及靜脈間有少量纖維增生，纖維化緩解。結果見圖1。

黑色箭頭：炎癥細胞浸潤；藍色箭頭：纖維橋接；黃色箭頭：脂肪變性；紅色箭頭：肝細胞壞死，胞核碎裂。圖1 各組大鼠肝組織HE染色顯微鏡圖

3.3.2 Masson染色結果

正常組大鼠肝臟未見纖維結締增生，僅有少許藍色膠原纖維。模型組大鼠肝臟匯管區有大量膠原纖維沉積，膠原纖維明顯增多且增粗，形成明顯纖維化間隔，大鼠肝組織纖維化嚴重。與模型組相比，三味甘露低劑量組大鼠肝組織可見少量脂肪空洞，膠原纖維表達量有所減少；三味甘露中、高劑量組和水飛薊賓組大鼠肝組織中偶見脂肪空泡，膠原纖維表達量均明顯減少，肝纖維化程度均減輕，且以三味甘露高劑量組改善最為明顯。結果見圖2。

箭頭：膠原纖維沉積部位。圖2 各組大鼠肝組織Masson染色顯微鏡圖

3.3.3 Sirus Red染色結果

正常組大鼠肝組織僅有少許散在的纖維。模型組大鼠肝組織可見大面積紅色膠原纖維沉積，縱橫交錯。與模型組相比，三味甘露低劑量組大鼠肝組織可見紅色膠原纖維沉積有所減少；三味甘露中、高劑量組和水飛薊賓組大鼠肝組織紅色膠原纖維沉積均明顯減少，且三味甘露高劑量組改善效果與水飛薊賓組相近。結果見圖3。

箭頭：膠原沉積部位。圖3 各組大鼠肝組織Sirus Red染色顯微鏡圖

3.4 三味甘露對大鼠血清中AST和ALT含量的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清中AST和ALT含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，三味甘露各劑量組和水飛薊賓組大鼠血清中AST 和ALT 含量均顯著降低（P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠血清中AST和ALT含量比較（±s，n＝6，U/L）

表2 各組大鼠血清中AST和ALT含量比較（±s，n＝6，U/L）

a：與正常組相比，P＜0.01；b：與模型組相比，P＜0.01。

組別正常組模型組三味甘露低劑量組三味甘露中劑量組三味甘露高劑量組水飛薊賓組ALT/（U/L）11.97±2.96 37.06±3.56a 28.20±1.75b 25.07±1.19b 23.00±2.92b 24.76±3.83b AST/（U/L）46.10±11.09 103.70±32.04a 60.28±24.36b 59.23±17.47b 56.46±17.87b 52.16±12.02b

3.5 三味甘露對大鼠肝纖維化指標的影響

與正常組相比，模型組大鼠肝組織中LN和HA含量及血清中PC Ⅲ和COL-Ⅳ含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，三味甘露各劑量組和水飛薊賓組大鼠肝組織中LN 和HA 含量及血清中PC Ⅲ和COL-Ⅳ含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表3。

表3 各組大鼠肝纖維化指標比較（±s，n＝6，ng/mL）

表3 各組大鼠肝纖維化指標比較（±s，n＝6，ng/mL）

a：與正常組相比，P＜0.01；b：與模型組相比，P＜0.01；c：與模型組相比，P＜0.05。

組別正常組模型組三味甘露低劑量組三味甘露中劑量組三味甘露高劑量組水飛薊賓組肝組織LN 7.71±3.57 17.55±6.87a 11.31±2.82b 10.82±4.16b 9.83±3.56b 8.33±2.46b HA 7.40±2.09 10.89±2.43a 8.46±1.17c 8.31±1.77c 7.76±1.67b 7.84±1.26b血清PC Ⅲ17.00±3.63 54.98±10.16a 37.59±7.29b 32.59±8.98b 19.67±5.21b 18.13±5.29b COL-Ⅳ205.78±17.18 402.94±49.35a 313.71±32.55b 257.35±68.49b 248.75±40.41b 236.69±40.75b

3.6 三味甘露對大鼠血清炎癥因子的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α 和IL-1β 的含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，三味甘露各劑量組和水飛薊賓組大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-1β 含量均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。結果見表4。

表4 各組大鼠血清炎癥因子含量比較（±s，n＝6，pg/mL）

表4 各組大鼠血清炎癥因子含量比較（±s，n＝6，pg/mL）

a：與正常組相比，P＜0.01；b：與模型組相比，P＜0.01；c：與模型組相比，P＜0.05。

組別正常組模型組三味甘露低劑量組三味甘露中劑量組三味甘露高劑量組水飛薊賓組IL-6 48.53±2.22 70.71±3.84a 59.25±2.85b 56.10±5.35c 52.28±3.15b 54.16±1.60b IL-1β 580.66±45.46 806.91±4.16a 700.83±25.29b 687.76±41.80b 671.45±26.90b 681.33±30.36b TNF-α 397.66±26.11 551.07±23.14a 490.98±19.06b 483.15±21.78b 475.90±23.67b 471.79±25.70b

4 討論

肝纖維化在藏醫中屬于“木布病”范疇，屬于熱性肝病，以肝、血熱為主的消化系統疾病，可分為“培赤型”“隆赤型”和“培隆型”[8]，治療原則主要是以清熱為主，解毒為輔，清除肝膽及胃熱癥和肝血瘀阻等。藏藥配方主要是通過疾病的病因和屬性，將“六味”“八性”及“十七效”結合，藏醫理論認為寒性藥治療熱病，熱性藥治療寒病。三味甘露是藏醫臨床常用方劑，其中，異葉青蘭味甘、性寒，主治胃病及肝熱??；寒水石味甘、性寒，主治培根及嚓瓦；藏木香味甘、苦、辛，性溫，治療隆病及培根熱病[9]。三味甘露配伍特點是以“寒”性藥為主，具有清瀉肝熱、活血化瘀等功效，在藏醫臨床上常用于治療肝臟疾病，改善肝炎、肝纖維化和肝硬化的程度。

CCl4腹腔注射是構建肝纖維化動物模型的經典方法，主要用于探索肝纖維化的發病機制及藥物篩選，其機制可能是CCl4進入機體內引起脂質過氧化，產生大量炎癥因子，引起炎癥反應和氧化應激反應，導致ECM堆積，通過反復刺激使肝細胞壞死，逐漸形成肝纖維化[10]。本研究使用CCl4構建大鼠肝纖維化模型，經HE 染色、Masson 染色和Sirius red 染色，對肝組織形態學觀察發現典型纖維化癥狀。經三味甘露治療后，大鼠肝細胞清晰度、細胞完整性有所改善，中央靜脈區附近炎癥細胞明顯減少，纖維組織增生減輕，膠原纖維表達量明顯減少，表明三味甘露對肝纖維化改善明顯。

傳統醫學認為，人體內五臟一體，外部炎癥導致內犯脾胃、脾失健運，脾胃虛則肝木乘之，病程久則脾胃受損、肝脾不和，從而導致消化不良、吸收不振、體重下降[11]。本研究中，造模后大鼠食欲降低、體重增長緩慢。經三味甘露治療后，大鼠食欲增強，體重增長，毛發光澤有所改善，表明三味甘露有效緩解了肝脾損傷，改善大鼠消化吸收功能。肝纖維化會導致肝臟和脾臟體積變化，隨著纖維化程度加重，肝臟和脾臟質量增加。中醫上運用肝主疏泄、脾主運化的理論“調和肝脾”，治療肝纖維化。本研究結果顯示，給予三味甘露治療后，大鼠肝脾指數明顯下降，表明三味甘露對于肝臟和脾臟具有一定保護作用。

AST 和ALT 是評判肝功能的重要指標。當肝臟受到損傷時，肝細胞中的轉氨酶進入到血液中，導致血清中AST和ALT含量升高[12]。本研究發現，給予三味甘露治療后，肝纖維化大鼠血清中AST和ALT含量均顯著降低，表明三味甘露能通過改變肝實質細胞膜通透性來改善肝功能，起到保肝、護肝作用。

HA、LN、PC Ⅲ和COL-Ⅳ是肝纖維化的4 個標志物，是ECM的主要成分。在健康肝臟中，ECM的合成降解處于動態平衡；肝臟受到損傷時，HA、LN、PC Ⅲ和COL-Ⅳ含量升高，大量ECM 沉積，纖維結締組織增多，在長期慢性炎癥刺激和成纖維效應細胞過度激活狀態下，ECM大量增加，長此以往最終導致肝纖維化發生[13]。本研究結果顯示，給予三味甘露治療后，肝纖維化大鼠的LN、HA、PC Ⅲ和COL-Ⅳ含量均顯著降低，說明三味甘露能夠抑制ECM沉積，緩解肝纖維化進程。

炎癥損傷是眾多病因引起肝損傷向肝纖維化發展的不可或缺的中間環節。其中，系統性炎癥細胞因子TNF-α 可以誘導促炎細胞因子IL-6 和IL-1β 產生，三者刺激肝星狀細胞促纖維化效應，可加速肝纖維化發展[14]。本研究結果顯示，給予三味甘露治療后，肝纖維化大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-1β含量均顯著降低，表明三味甘露可能通過抑制炎癥因子釋放、減輕炎癥反應，進而緩解肝纖維化的發展。

綜上所述，三味甘露能夠通過抑制膠原纖維生成，降低轉氨酶、HA、LN、PC Ⅲ和COL-Ⅳ含量，減輕炎癥反應，從而緩解CCl4誘導的大鼠肝纖維化進程。

（致謝：青海省藏醫院萬瑪拉旦、興?？h藏醫院彭毛東周、海南州藏醫院尕藏等藏醫藥臨床專家）