miR-10b介導NKG2D調節腦膠質瘤細胞免疫效應的實驗研究

袁崗 巨虎 肖宗宇 李文輝 曹立新 惠超杰 （青海大學附屬醫院神經外科，西寧 810001）

腦膠質瘤是最常見的神經上皮性腫瘤之一，平均每10萬人中有10～20人患病，其發病率占全身惡性腫瘤的1%～3%，晚期患者的五年生存率不足5%［1］。目前臨床上主要通過手術切除并輔以放化療等手段對該病進行治療，但這些傳統治療方法均在不同程度上存在治愈率低、復發率高、預后差等問題［2］。因此尋找其他輔助治療方案以延長患者生存期，改善預后是目前亟待解決的難題。自然殺傷細胞激活受體（NK cell activated receptor，NKG2D）是一種主要表達于NK細胞、CD8+T細胞以及γδ T細胞等免疫效應細胞表面的活化性受體［3］。NKG2D受體可識別一系列親和力不同、結構多樣的配體，包括主要組織相容性復合物Ⅰ鏈相關基因A/B（major histocompatibility complex classⅠchain-related gene A/B，MICA/B）以及6種UL16結合蛋白（UL16 binding protein 1～6，ULBP1～6）。NKG2D通過與位于靶細胞表面的配體結合活化NK細胞使其分泌細胞因子并發揮殺傷作用。當機體細胞發生惡性病變時會反應性增加其表面MICA等配體的表達，從而誘發NK等免疫效應細胞對腫瘤細胞的攻擊［4］。微小核糖核酸-10b（micro ribonucleic acid 10b，miR-10b）是位于2號染色體短臂3區的miR-10家族的主要成員，被發現在多種惡性腫瘤組織中促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移［5］。有報道指出，miR-10b在人正常腦組織中表達水平較低，而在膠質瘤組織中呈高表達水平，其表達水平與腫瘤的病理分級呈正相關，且miR-10b高表達患者的預后差、生存時間短，但miR-10b在腦膠質瘤的細胞免疫效應和作用機制尚不清楚［6］。本研究利用體外實驗探究miR-10b介導NKG2D對腦膠質瘤的細胞免疫效應和作用機制，為深入研究miR-10b對腦膠質瘤的細胞免疫效應和作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人腦膠質瘤細胞U251（北京協和細胞資源中心，批號：191226）；外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）由健康志愿者提供，經青海大學附屬醫院倫理委員會審批通過，倫理審批號：院倫審2021第15號。

1.1.2 藥物與試劑 RPMI164完全培養基（北京雅安達生物技術有限公司，批號：C11875500BT）；TRIzol試劑（上海聯邁生物工程有限公司，批號：LM-81027）；逆轉錄試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰?，批號：KL-TERT-Ra）；免疫磁珠分選（magneticactivated cell sorting，MACS）試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號：CZ020）；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）溶液（上海創賽科技有限公司，批號：PM10053）；NC inhibitor、miR-10b mimics、miR-10b inhibitor均由美國Cellecta公司設計合成；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）（德國Miltenyi Biotec公司，批號：130-096-158）；鼠抗人NKG2D、MICA、ULBP2和ULBP3，免疫球蛋白G1（immunoglobulin G1，IgG1）抗體（美國Invitrogen公司，批號：191002、191224、200415、200323、191117）；陰性對照（NC inhibitor）、miR-10b模擬物（miR-10b mimics）、miR-10b抑制劑（miR-10b inhibitor）均由美國Cellecta公司設計合成；實時逆轉錄酶聚合酶鏈反應（RTqPCR）引物均由（克拉瑪爾）上海譜振生物科技有限公司設計合成。

1.1.3 儀器 Galaxy 48 R型CO2培養箱（德國Eppendorf公司）；Axioscope 5型普通光學顯微鏡（德國Zeiss公司）；LumascopeTM620型綠色熒光顯微鏡（美國Etaluma公司）；S1000TMDual 48 Well型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國Bio-Rad公司）；NovoCyte型流式細胞儀（美國Agilent Technologies公司）；SuPerMax 3100型多功能酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）；HSC-2015L型高速冷凍離心機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 人腦膠質瘤細胞U251的培養、傳代和分組 將人腦膠質瘤細胞U251培養于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素RPMI1640完全培養基中，置于37 ℃、5%CO2的培養箱內。每2～3 d傳代1次，獲得處于對數生長期的細胞，按照1.0×105個/ml制備細胞懸液，并設置對照組、過表達組、低表達組、空白組，每組6個復孔。對照組、過表達組、低表達組分別采用脂質體轉染法轉染陰性對照（NC inhibitor）、miR-10b模擬物（miR-10b mimics）、miR-10b抑制劑（miR-10b inhibitor），NC inhibitor正向5'-TCGATCGTAAGCACGC-3'，反向5'-CATGTCAGTACGTACG-3'；miR-10b mimics正向5'-GTCGTACGTACGAATGCA-3'，反向5'-CCTAGACGTAAGTCAGAC-3'；miR-10b inhibitor正向5'-CGTACGTACGATCAGTA-3'，反向5'-TACGTACGATAACGTAG-3'?？瞻捉M予以等量無菌生理鹽水。繼續培養24 h后換培養液，分別在普通光學顯微鏡和綠色熒光顯微鏡下拍照計數，計算各組細胞轉染效率，轉染效率（%）=綠色熒光鏡下發光細胞數/普通光鏡下細胞數×100%。

1.2.2 RT-qPCR檢測miR-10b表達 采用TRIzol試劑分別抽提各組細胞總RNA，利用逆轉錄試劑盒逆轉錄合成互補脫氧核糖核酸（cDNA），以cDNA為模板進行RT-qPCR擴增。miR-10b正向引物5'-TTAGCGTCAGTACCCGTA-3'，負向引物5'-CGTACGTACGTACGTACG-3'，產物長度260 bp；β-actin正向引物5'-GGCGTACGAATAGATA-3'，反向引物5'-ATTCGATGCATGATCC-3'，產物長度298 bp。PCR循環參數：95 ℃ 15 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，重復40個循環。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-10b相對表達量，ΔΔCt=實驗組（Ct樣本-Ct內參）-對照組（Ct樣本-Ct內參）。

1.2.3 健康志愿者外周血NK細胞的分離、培養、鑒定 采用密度梯度區帶離心法分離1例健康志愿者的PBMC，通過MACS法分選NK細胞，將得到的NK細胞培養于含10%FBS的RPMI1640培養基（含IL-2 1 000 U/ml，青霉素和鏈霉素各100 U/ml）中，按照2×105個/cm2細胞密度接種于細胞培養瓶中，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h后即為效應細胞，流式細胞儀檢測NK細胞表面標志物CD56。

1.2.4 MTT法檢測不同效靶比時NK細胞殺傷活性 將效靶比分別為10∶1、20∶1、50∶1和100∶1的NK細胞和人腦膠質瘤細胞U251加入96孔板，以10%TritonX-100破壞靶細胞為最大釋放，以RPMI-1640維持液代替效應（或靶）細胞為自然釋放，同時設置效應細胞（NK細胞）孔和靶細胞（人腦膠質瘤細胞U251）孔作為對照孔，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養4 h后每孔加入10 μl 5 mg/ml MTT溶液繼續培養4 h，棄去上清液，每孔加50 μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，10 min內上多功能酶標儀（492 nm）檢測各孔吸光度（optical density，OD）值。NK細胞殺傷活性（%）=（實驗組OD值-靶細胞自然釋放組OD值-效應細胞自然釋放組OD值）/（靶細胞最大釋放組OD值-靶細胞自然釋放組OD值）×100%。

1.2.5 檢測各組NK細胞表面NKG2D表達 取NK細胞殺傷活性最高時的效靶比的NK細胞和人腦膠質瘤細胞U251混合液，以3 000 r/min（離心半徑6 cm）轉速離心10 min，用PBS沖洗3次，按每1×106個NK細胞1 μg抗體量加入鼠抗人NKG2D抗體，對照管加入鼠抗人抗體IgG1。4 ℃下標記30 min，流式細胞儀檢測NK細胞表面NKG2D表達情況。

1.2.6 檢測組人腦膠質瘤細胞U251表面MICA、ULBP2、ULBP3表達 取處于對數生長期的人腦膠質瘤細胞U251，3 000 r/min（離心半徑6 cm）離心10 min，PBS沖洗3次，按每1×106個人腦膠質瘤細胞U251分別加入1 μg鼠抗人MICA、ULBP2和ULBP3抗體，對照管加入鼠抗人抗體IgG1。4 ℃條件下標記30 min，流式細胞儀檢測各組NK細胞表面MICA、ULBP2、ULBP3表達情況。

1.3 統計學分析 采用SPSS26.0軟件進行統計學檢驗，以單因素方差分析多樣本計量資料±s，每兩樣本差異采用SNK-q檢驗分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞轉染效率 各組細胞轉染效率均在85%以上，其中對照組、過表達組、低表達組轉染效率分別為（93.55±2.05）%、（95.67±3.14）%、（94.18±3.26）%。見圖1。

圖1 各組細胞轉染效率圖（×100）Fig.1 Transfection efficiency diagram of each group （×100）

2.2 RT-qPCR檢測miR-10b表達 與對照組和空白組相比，過表達組miR-10b表達升高，低表達組miR-10b表達降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），且對照組與空白組相比miR-10b表達差異無統計學意義（P＞0.05，見表1）。

表1 各組細胞miR-10b表達分析（±s，n=6）Tab.1 Analysis of miR-10b expression in each group （±s，n=6）

表1 各組細胞miR-10b表達分析（±s，n=6）Tab.1 Analysis of miR-10b expression in each group （±s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs blank group；3）P＜0.05 vs over-expressed group.

Groups Control Blank Over-expressed Low-expressed miR-10b 1.05±0.17 1.10±0.15 1.67±0.281）2）0.52±0.091）2）3）38.457＜0.001 F P

2.3 NK細胞鑒定結果 NK細胞的表型檢測顯示，CD56陽性和CD56dim陽性T細胞各占98.68%和94.74%。見圖2。

圖2 NK細胞的表型檢測Fig.2 Phenotype detection of NK cells

2.4 NK細胞殺傷活性結果 與對照組、空白組相比，過表達組不同效靶比NK細胞殺傷活性均降低，低表達組不同效靶比NK細胞殺傷活性均增高，差異均有統計學意義（P＜0.05），各組NK細胞殺傷活性均隨效靶比升高而升高，組內比較差異均有統計學意義（P＜0.05），且對照組與空白組相同效靶比的NK細胞殺傷活性比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 NK細胞殺傷活性比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of NK cells killing activity （±s，n=6）

表2 NK細胞殺傷活性比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of NK cells killing activity （±s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs blank group；3）P＜0.05 vs over-expressed group；4）P＜0.05 vs target ratio 10∶1；5）P＜0.05 vs target ratio 20∶1；6）P＜0.05 vs target ratio 50∶1.

Groups Control Blank Over-expressed Low-expressed Killing activity/%Target ratio 10∶1 Target ratio 20∶1 Target ratio 50∶1 Target ratio 100∶1 51.87±8.644）5）6）51.08±8.554）5）6）33.48±5.051）2）4）5）6）73.35±10.141）2）3）4）5）6）23.150＜0.001 F P 15.56±2.28 14.75±2.30 10.08±1.761）2）22.97±3.931）2）3）23.501＜0.001 24.35±4.044）22.17±3.894）15.05±2.261）2）4）36.16±5.771）2）3）4）26.420＜0.001 35.26±5.414）5）34.05±5.624）5）22.36±3.931）2）4）5）52.26±8.081）2）3）4）5）25.697＜0.001

2.5 各組NK細胞表面NKG2D表達 與對照組和空白組相比，過表達組NK細胞表面NKG2D表達降低，低表達組NK細胞表面NKG2D表達增高，差異均有統計學意義（P＜0.05），且對照組與空白組比較NK細胞表面NKG2D表達差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖3、表3。

表3 各組NK細胞表面NKG2D表達（±s，n=6，%）Tab.3 Expression of NKG2D on surface of NK cells in each group （±s，n=6，%）

表3 各組NK細胞表面NKG2D表達（±s，n=6，%）Tab.3 Expression of NKG2D on surface of NK cells in each group （±s，n=6，%）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs blank group；3）P＜0.05 vs over-expressed group.

Groups Control Blank Over-expressed Low-expressed NKG2D 67.62±10.64 65.85±10.93 44.26±7.741）2）98.85±15.421）2）3）22.850＜0.001 F P

2.6 各組人腦膠質瘤細胞U251表面MICA、ULBP2、ULBP3表達 與對照組和空白組相比，過表達組人腦膠質瘤細胞U251表面MICA、ULBP2、ULBP3表達均降低，低表達組人腦膠質瘤細胞U251表面MICA、ULBP2、ULBP3表達均增高，差異均有統計學意義（P＜0.05），且對照組與空白組比較人腦膠質瘤細胞U251表面MICA、ULBP2、ULBP3表達差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖4、表4。

表4 各組人腦膠質瘤細胞U251表面MICA、ULBP2、ULBP3表達（±s， n=6，%）Tab.4 Expressions of MICA， ULBP2 and ULBP3 on surface of human glioma cells U251 in each group（±s，n=6，%）

表4 各組人腦膠質瘤細胞U251表面MICA、ULBP2、ULBP3表達（±s， n=6，%）Tab.4 Expressions of MICA， ULBP2 and ULBP3 on surface of human glioma cells U251 in each group（±s，n=6，%）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs blank group；3）P＜0.05 vs over-expressed group.

Groups Control Blank Overexpressed Lowexpressed MICA 55.62±9.14 53.67±8.84 34.13±5.221）2）ULBP2 57.06±9.35 55.16±8.92 37.43±5.311）2）UMBP3 51.18±8.34 54.40±8.72 34.53±5.151）2）75.87±11.541）2）3）22.680＜0.001 F P 79.45±10.871）2）3）26.922＜0.001 82.87±12.151）2）3）24.516＜0.001

圖4 各組人腦膠質瘤細胞U251表面MICA、ULBP2、ULBP3表達Fig.4 Expressions of MICA， ULBP2 and ULBP3 on surface of human glioma cells U251 in each group

3 討論

腦膠質瘤的發生發展是一個原癌基因和抑癌基因共同參與的多因素協同作用的過程，其具體發病機制尚不十分清晰。由于腦膠質瘤與腦組織無明顯界限，傳統的手術治療難以完全切除，且血腦屏障對化療藥物滲透的限制作用使腦膠質瘤對化療敏感性僅為中度，使得手術結合化療治療的模式具有復發率高、預后差等問題［7］，因此尋求更加有效的治療方法已成為腦膠質瘤治療迫切需要解決的問題。

本研究中，各組細胞轉染效率均在85%以上，說明成功轉染人腦膠質瘤細胞U251。與對照組和空白組相比，過表達組miR-10b表達升高、NK細胞表面NKG2D表達和NK細胞殺傷活性降低，低表達組miR-10b表達降低、NK細胞表面NKG2D表達和NK細胞殺傷活性升高，且各組NK細胞殺傷活性均隨效靶比升高而升高，推測miR-10b過表達是通過抑制NKG2D的表達降低NK細胞殺傷活性，而miR-10b低表達則是通過促進NKG2D的表達提高NK細胞殺傷活性。有報道指出，miR-10b在90%以上的腦膠質瘤細胞中呈高表達，且miR-10b高表達患者存在生存期短、預后差的問題，本研究結果與上述研究相一致［6］。NK細胞是機體重要的天然免疫細胞，在機體抗病毒感染及抗腫瘤過程中發揮免疫監視作用，被醫學界認為是人體免疫的第一道防線。NK細胞不依賴于抗原的激活即具備對腫瘤細胞的殺傷作用，其不僅能有效監視并控制腫瘤的發生，而且對抑制腫瘤轉移發揮重要作用［8］。NK細胞的殺傷活性與其表面的殺傷受體的表達密切相關，殺傷受體又分為殺傷活化受體和殺傷抑制受體［9］。NKG2D是NK細胞表面的主要殺傷活化受體，NKG2D的高表達能夠誘導增加NK細胞的殺傷活性［10］。有研究顯示，在垂體瘤患者中，由于NK細胞表面NKG2D表達受到抑制，導致NK細胞的殺傷活性明顯降低［11］。

本研究中，與對照組、空白組相比，過表達組人腦膠質瘤細胞U251表面MICA、ULBP2、ULBP3表達均降低，低表達組人腦膠質瘤細胞U251表面MICA、ULBP2、ULBP3表達均升高，說明miR-10b過表達能明顯降低人腦膠質瘤U251表面MICA、ULBP2和ULBP3的表達，miR-10b低表達會提高人腦膠質瘤細胞U251表面MICA、ULBP2、ULBP3的表達。人NKG2D配體主要分為MIC和ULBP家族2大類，MIC包括MICA和MICB，ULBP家族包括ULBP1-6共6個成員［12］。MIC多表達于上皮性腫瘤細胞表面，在正常組織細胞中幾乎不表達，其表達水平的高低直接關系到NK細胞的抗腫瘤活性［13］。MICA是NKG2D受體的一種殺傷活化性配體，MICA的高表達同時能夠上調NK細胞表面NKG2D的表達［14］。有報道指出NKG2D/MICA介導的免疫監視功能可激活NK細胞對腫瘤細胞的殺傷效應［15］。ULBP表達較廣泛，在多種細胞、組織和腫瘤均有表達［16］。病毒尤其是巨細胞病毒能夠下調腫瘤特異主要組織相容性復合物Ⅰ（major histocompatibility complex classⅠ，MHC-Ⅰ）的表達，誘導NK細胞表面的NKG2D受體與病毒感染細胞表面的ULBP結合，使NK細胞表面的活化分子表達顯著上調，并刺激NK細胞產生干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、巨噬細胞炎癥蛋白-1β（macrophage inflammatory protein-1β，MIP-1β）等細胞因子，提高NK細胞對靶細胞的殺傷活性［17］。有研究發現，在人腦膠質瘤細胞表面MICA、ULBP2和ULBP3存在高表達，且NKG2D通過與人腦膠質瘤細胞表面的MICA、ULBP2和ULBP3結合激活NK細胞的殺傷活化效應［18］，本研究結果與上述報道相一致，但本研究在上述研究基礎上進一步探討了miR-10b對人腦膠質瘤細胞免疫效應的調節作用及其機制。

綜上所述，抑制miR-10b能明顯增加人腦膠質瘤U251表面MICA、ULBP2和ULBP3的表達和NK細胞表面NKG2D表達從而提高NK的細胞殺傷活性，增強人腦膠質瘤細胞的免疫效應。本研究進一步闡釋了miR-10b對人腦膠質瘤細胞免疫效應的調節作用及其機制，為臨床治療人腦膠質瘤藥物的研發提供了理論依據。