轉錄因子SP1調控MAP3K1表達影響糖尿病視網膜病變細胞凋亡和炎癥反應

黃丹 鄧芳祝 謝功澤 李巧蓮

（1.郴州市第四人民醫院眼科，郴州 423000；2.郴州市第一人民醫院北院眼科，郴州 423000）

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病主要并發癥，糖尿病仍是工作年齡人群視力喪失的主要原因［1-2］。研究表明糖尿病誘發的高血糖會增加冠心病、卒中和糖尿病微血管疾病等風險［3］。DR血管損傷的特征為血液-視網膜屏障破壞、毛細血管基底膜增厚和內皮細胞損傷引起的視網膜血流自動調節功能失調［4-5］。因此，人類視網膜微血管內皮細胞（human retinal microvascular endothelial cells，hRMECs）功能障礙的確切機制有待闡明，以便為DR患者制定有效治療策略。

特異性蛋白1（SP1）是一種普遍表達的核轉錄因子，屬于C2H2型鋅指蛋白家族成員，介導基因表達并響應各種細胞外和細胞內信號調節基因表達，包括參與細胞生長及分化、細胞凋亡、纖維化和炎癥［6］。敲低SP1可提高視網膜色素上皮細胞活力，降低高血糖或低氧條件下增加的細胞通透性和限制細胞遷移［7］。高血糖增加SP1在視網膜微血管中與MALAT1啟動子的結合以提升lncRNA MALAT1水平，lncRNA MALAT1通常與炎癥、血管生成和視網膜神經變性有關，在DR中發揮重要作用［8］。研究報道，DR中MAP3K1表達上調，激活NF-κB信號通路p65磷酸化，加劇視網膜微血管內皮細胞凋亡，加劇促炎因子釋放［9］。干擾MAP3K1表達可抑制細胞凋亡［10］。因此，本實驗旨在研究SP1對DR細胞凋亡和炎癥反應的影響及其分子機制是否與MAP3K1有關。

1 材料與方法

1.1 材料 hRMECs購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；內皮細胞培養基購自美國ScienCell公司；si-NC、si-SP1、oe-NC和oe-MAP3K1均購自上海吉瑪公司；LipofectamineTM2000購自北京科展生物科技有限公司；TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、RT-qPCR 試劑盒購自日本TaKaRa公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher scientific公司；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒購自上海酶聯生物公司；Anti-IgG和Anti-SP1購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 hRMECs在含10%胎牛血清的內皮細胞培養基中于37 ℃、5%CO2、適宜濕度下培養，每周更新培養基2～3次。hRMECs分為高葡萄糖（HG）組和正常葡萄糖（Control）組。HG組用30 mmol/L D-葡萄糖培養，Control組用5 mmol/L D-葡萄糖處理，均在37 ℃培養48 h（5%CO2）。

1.2.2 細胞轉染 HG組hRMECs使用LipofectamineTM2000試劑盒轉染或共轉染si-NC、si-SP1或oe-NC、oe-MAP3K1，將細胞分為si-NC組、si-SP1組、si-SP1+oe-NC組和si-SP1+oe-MAP3K1組，所有操作按照試劑盒說明書進行。轉染完成48 h后收集細胞，RT-qPCR檢測細胞mRNA表達，以確定是否轉染成功。

1.2.3 RT-qPCR檢測SP1和MAP3K1表達 TRIzol試劑提取總RNA，將其進行純化定量，逆轉錄試劑盒合成cDNA。參照RT-qPCR試劑盒操作步驟進行擴增，檢測SP1和MAP3K1表達。以GAPDH為內參，2-ΔΔCt分析其表達。SP1正向引物：5'-ACGCTTCACACGTTCGGATGAG-3'，反向引物：5'-TGACAGGTGGTCACTCCTCATG-3'；MAP3K1正向引物：5'-CCAGACCAGTATCTCAGGAGATG-3'，反向引物：5'-CCGCTAAACTGTGGCAAGGAGT-3'；GAPDH正向引物：5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'，反向引物：5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 轉染和HG共處理48 h后，收集hRMECs。根據制造商說明，使用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。室溫下用Annexin V-FITC黑暗培養20 min，加入碘化丙啶（PI），10 min后流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 ELISA檢測細胞TNF-α、IL-1β和IL-6含量各組細胞4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清。參照說明書，采用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.2.6 ChIP-qPCR 穩定生長的hRMECs中加入4%多聚甲醛室溫固定10 min，超聲處理2 h，將DNA剪成0.2～1.0 kb片段。4 ℃下13 000 r/min離心5 min收集上清。分別用陰性對照抗體Anti-IgG和目的蛋白特異性抗體Anti-SP1對細胞裂解物進行免疫沉淀過夜。qPCR分析沉淀物對MAP3K1啟動子的富集能力。

1.3 統計學分析 采用SPSS22.0軟件分析數據，數據以±s表示。兩組比較使用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HG處理的hRMECs中SP1和MAP3K1表達上調 與Control組相比較，HG處理的hRMECs中SP1和MAP3K1表達均升高（P＜0.05，表1）。

表1 Control組和HG處理的hRMECs中SP1和MAP3K1表達（±s，n=9）Tab.1 Expressions of SP1 and MAP3K1 in control group and HG-treated hRMECs （±s，n=9）

表1 Control組和HG處理的hRMECs中SP1和MAP3K1表達（±s，n=9）Tab.1 Expressions of SP1 and MAP3K1 in control group and HG-treated hRMECs （±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05.

MAP3K1 1.00±0.08 2.17±0.261）20.54 0.000 Groups Control HG t P SP1 1.00±0.06 1.89±0.211）16.79 0.000

2.2 敲低SP1抑制HG誘導的hRMECs凋亡 在HG誘導的hRMECs中使用干擾技術抑制SP1表達，細胞凋亡能力檢測顯示，與Control組相比，HG組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與HG組相比，HG+si-NC組細胞凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）；與HG+si-NC組相比，HG+si-SP1組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05，圖1）。表明敲低SP1可顯著抑制HG誘導的hRMECs凋亡。

圖1 各組細胞凋亡率比較Fig.1 Comparison of cell apoptosis rate in each group

2.3 敲低SP1抑制HG誘導的hRMECs炎癥反應檢測敲低SP1的HG誘導的hRMECs中炎癥反應，與Control組相比，HG組細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達明顯增加（P＜0.05）；與HG組相比，HG+si-NC組細胞TNF-α、IL-1β和IL-6差異無統計學意義（P＞0.05）；與HG+si-NC組相比，HG+si-SP1組炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯減少（P＜0.05，表2）。表明敲低SP1可抑制HG誘導的hRMECs炎癥反應。

表2 各組細胞TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較（±s，n=9）Tab.2 Comparison of TNF-α，IL-1β and IL-6 contents of cells in each group （±s，n=9）

表2 各組細胞TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較（±s，n=9）Tab.2 Comparison of TNF-α，IL-1β and IL-6 contents of cells in each group （±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with HG+si-NC group，2）P＜0.05.

IL-6 48.38±3.67 132.55±10.831）137.91±9.74 75.68±6.162）Groups Control HG HG+si-NC HG+si-SP1 TNF-α 35.76±2.87 162.35±12.191）168.43±14.77 69.51±5.252）IL-1β 17.63±1.38 68.28±5.141）72.81±6.14 35.46±2.742）

2.4 抑制SP1降低MAP3K1表達 JASPAR生物信息學網站分析顯示，SP1與MAP3K1啟動子存在結合位點（附圖1，www.immune99.com）。為確定SP1與MAP3K1的啟動子序列能夠結合，ChIP-qPCR實驗發現，在hRMECs中使用SP1特異性抗體沉淀的復合物中MAP3K1富集水平明顯高于Anti-IgG（P＜0.05，表3），抑制SP1表達后Anti-SP1對MAP3K1的富集水平明顯降低（P＜0.05，表4）。與HG+si-NC組相比，抑制SP1表達后MAP3K1表達明顯降低（P＜0.05，表5）。

表3 Anti-IgG和Anti-SP1對MAP3K1啟動子序列的富集能力（±s，n=9）Tab.3 Enrichment ability of Anti-IgG and Anti-SP1 for MAP3K1 promoter sequences （±s，n=9）

表3 Anti-IgG和Anti-SP1對MAP3K1啟動子序列的富集能力（±s，n=9）Tab.3 Enrichment ability of Anti-IgG and Anti-SP1 for MAP3K1 promoter sequences （±s，n=9）

Note：Compared with Anti-IgG group， 1）P＜0.05.

MAP3K1 promoter 1.00±0.14 8.39±0.631）35.83 0.000 Groups Anti-IgG Anti-SP1 t P

表4 Anti-SP1對MAP3K1啟動子序列的富集能力（±s，n=9）Tab.4 Enrichment ability of Anti-SP1 for MAP3K1 promoter sequences （±s，n=9）

表4 Anti-SP1對MAP3K1啟動子序列的富集能力（±s，n=9）Tab.4 Enrichment ability of Anti-SP1 for MAP3K1 promoter sequences （±s，n=9）

Note：Compared with HG+si-NC group，1）P＜0.05.

MAP3K1 promoter Groups 1.00±0.07 0.38±0.031）17.10 0.000 HG+si-NC HG+si-SP1 tP

表5 SP1敲低前后hRMECs中MAP3K1表達（±s，n=9）Tab.5 MAP3K1 expression in hRMECs before and after SP1 knockdown （±s，n=9）

表5 SP1敲低前后hRMECs中MAP3K1表達（±s，n=9）Tab.5 MAP3K1 expression in hRMECs before and after SP1 knockdown （±s，n=9）

Note：Compared with HG+si-NC group，1）P＜0.05.

MAP3K1 promoter Groups 1.00±0.11 0.57±0.041）14.51 0.000 HG+si-NC HG+si-SP1 t P

2.5 過表達MAP3K1逆轉si-SP1對HG誘導的hRMECs凋亡和炎癥反應的抑制作用 在敲低SP1抑制HG誘導的hRMECs中進一步過表達MAP3K1，與HG+si-SP1+oe-NC相比，HG+si-SP1+oe-MAP3K1組MAP3K1表達升高，細胞凋亡率升高，炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量增加（P＜0.05，圖2、表6）。表明SP1通過調控MAP3K1影響HG誘導的hRMECs凋亡和炎癥反應。

圖2 細胞凋亡率比較Fig.2 Comparison of cell apoptosis rate

表6 干擾MAP3K1表達逆轉si-SP1對hRMECs的作用（±s，n=9）Tab.6 Interference with MAP3K1 expression reverses effect of si-SP1 on hRMECs （±s，n=9）

表6 干擾MAP3K1表達逆轉si-SP1對hRMECs的作用（±s，n=9）Tab.6 Interference with MAP3K1 expression reverses effect of si-SP1 on hRMECs （±s，n=9）

Note：Compared with HG+si-SP1+oe-NC group， 1）P＜0.05.

Groups HG+si-SP1+oe-NC HG+si-SP1+oe-MAP3K1 MAP3K1 TNF-α IL-1β IL-6 1.00±0.12 72.51±5.25 31.46±2.74 65.68±5.76 2.02±0.261）117.43±6.771）55.81±3.341）103.91±8.041）t P 22.17 0.000 18.54 0.000 28.41 0.000 14.56 0.002

3 討論

全球糖尿病患者中DR總體患病率為35%，發病機制極為復雜［11］。隨著糖尿病成為全球流行病，DR作為其嚴重微血管并發癥之一，發病率也在上升［12-13］。視網膜內微血管異常增加了血管通透性和新血管形成，這些異常包括血管基底膜增厚、緊密連接失敗、周細胞喪失和無細胞毛細血管形成。因此，毛細血管閉塞和非灌注導致局部缺血并引發病理性血管生成［14］。血管生成涉及現有脈管系統的新血管生長，以響應非灌注和缺血后發生的血液/氧氣和營養物質供應減少［15］。DR的另一個重要分類是糖尿病性黃斑水腫，是一種積聚到神經視網膜中的液體導致視網膜異常增厚，且經常出現黃斑囊樣水腫，是DR患者視力喪失的最常見原因［16-17］。DR早期高血糖是引起視網膜病理變化的主要誘因，與誘導氧化應激、炎癥、增殖、新生血管等有關［18-19］。本研究已證明轉錄因子SP1參與DR炎癥反應和hRMECs凋亡，進一步過表達MAP3K1逆轉了si-SP1對HG誘導的hRMECs凋亡和炎癥反應的抑制作用。從機制上講，本研究表明SP1通過促進MAP3K1表達促進hRMECs凋亡及炎癥反應。

SP1是鋅指家族成員，與含GC-box的DNA結合。除SP1外，鋅指蛋白家族成員還包括SP2、SP3和SP4，具有相似的DNA結合特異性，在基因調控中發揮不同作用。其中SP1作為被廣泛研究的因子，已被證實可激活許多含GC-box的啟動子［20］。SP1能夠響應各種細胞外和細胞內信號調節多種基因表達，包括參與增殖、細胞周期、DNA修復和凋亡的基因［21］。研究發現SP1介導高血糖誘導的DR Robo4上調，影響細胞遷移、單層通透性和血管生成，表明SP1可能在DR微血管功能障礙中起重要作用［22］。此外，SP1的O-GlcNAc修飾介導高血糖時ICAM-1上調，導致視網膜損傷和炎癥反應［23］。本研究通過構建DR模型，發現SP1在此模型中高表達。隨后在hRMECs中干擾SP1表達，通過30 mmol/L D-葡萄糖誘導48 h，發現抑制SP1表達后，DR細胞凋亡率降低，炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量也降低，炎癥反應被抑制，表明在DR細胞中降低SP1表達減輕了hRMECs凋亡和炎癥反應。

為識別SP1的下游靶標mRNA，通過JASPAR生物信息學網站分析發現，SP1與MAP3K1啟動子區域存在結合位點。ChIP-qPCR實驗發現，SP1的特異性抗體可與MAP3K1結合，抑制SP1表達后MAP3K1表達明顯降低，證實SP1可調控MAP3K1表達。文獻報道，MAP3K1作為一種全長蛋白具有產生抗凋亡信號的潛力，MAP3K1上調發揮促凋亡作用［10］。此外，AL-SADI等［24］指出MAP3K1通過經典NF-κB通路與腸道炎癥密切關聯，刺激炎癥發生。抑制MAP3K1會減輕HG誘導的hRMECs凋亡和促炎因子釋放［9］。M2巨噬細胞可通過抑制MAPK通路FGFR2、MAP3K1、MRAS、BRAF和p-ERK表達，保護腎小球內皮細胞免受糖基化產物損害［25］。本研究顯示，MAP3K1在DR細胞模型中高表達，與XU等［9］結果一致。本實驗還發現進一步過表達MAP3K1逆轉了si-SP1對HG誘導的hRMECs凋亡和炎癥反應的抑制作用。

綜上，DR中，轉錄因子SP1通過促進MAP3K1表達，促進細胞凋亡及加劇促炎因子釋放。表明SP1參與DR進展，為DR提供了潛在治療靶點。