鳶尾黃素通過調節TLR4/MyD88/NF-κB信號通路改善血管性癡呆大鼠認知缺陷

丁旭 鄧祥敏 殷紫 劉旭 譚東明 尹紅英 （.江蘇護理職業學院中醫藥學院，淮安 3005； .江蘇護理職業學院附屬淮安市淮陰醫院腫瘤科，淮安 300）

血管性癡呆（vascular dementia，VD）又稱腦梗后癡呆，指大腦因缺血、缺氧等原因造成神經功能異常，引發機體記憶、認知功能及行為障礙的神經系統疾?。?］。VD發病原因眾多，是老年癡呆常見病因之一，主要與腦血管因素有關。VD患病率越來越高，且趨于年輕化，臨床主要表現為認知障礙，且隨時間推移逐漸加重，嚴重時影響患者生活和社交［2-3］。VD發病機制尚不明確，迄今為止未發現可有效改善認知障礙癥狀的抗精神病藥物。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）作為病原體主要受體，可激活機體固有免疫應答，在天然免疫應答中起關鍵作用［4］。核因子κB（nuclear factor-κB，NFκB）是B細胞中存在的主要核轉錄因子，參與調控多種炎癥細胞因子、免疫應答等多種生物學過程。髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是TLR信號通路關鍵連接蛋白，可激活NFκB，參與炎癥反應，在多種非髓樣組織中表達［5］。多項研究均表明TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在免疫及炎癥機制中發揮作用［6］。研究顯示芹菜素可能通過抑制NF-κB表達改善動脈粥樣硬化大鼠病情發展［7］。射干是一種常見中藥材，具有清熱解毒、化痰散結功效。鳶尾黃素是存在于中藥材射干中具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等藥物活性的異黃酮類化合物。研究顯示鳶尾黃素可減輕糖尿病腎病大鼠腎臟損傷，發揮腎功能保護作用，可能通過調節NF-κB途徑發揮作用，但尚無研究報道鳶尾黃素在VD中的作用［8］。本研究旨在分析鳶尾黃素對VD大鼠認知缺陷的影響，并初步探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 鳶尾黃素購于北京華威銳科化工有限公司（純度＞98%）；吡拉西坦片購于百正藥業股份有限公司（批準文號：國藥準字H4102-2772，規格：0.4 g×100片）；戊巴比妥鈉購于上海氟德化工有限公司；動物用青霉素鈉購于寧海源泰獸藥有限公司；小動物磁共振成像儀購于上海玉研科學儀器有限公司；MT-200 Morris水迷宮購于北京友誠嘉業生物科技有限公司；腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、高親和力受體酪氨酸激酶（phosphorylated tyrosine kinase receptor b，TrkB）、磷酸化TrkB（p-TrkB）、TLR4、MyD88、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB p65和β-actin抗體及相應二抗購于美國ABsci公司。

1.1.2 實驗動物 SPF級健康Wistar大鼠72只，6～8周齡，體質量（280±18） g，雌雄各半，購自揚州大學，許可證號：SCXK（蘇）2017-0007。所有大鼠均飼養于標準環境，光照/黑暗各12 h，溫度（25±5） ℃，濕度45%，自由飲水采食，適應性喂養7 d后構建VD大鼠模型。本研究經淮安市第一人民醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 建模和分組［9］將72只大鼠隨機分為假手術組、模型組、鳶尾黃素低、中、高劑量組和陽性對照組，每組12只。所有大鼠建模前禁食1 d后稱重。所有大鼠采用戊巴比妥鈉麻醉后于鎖骨上緣至頜下局部區域消毒，剔毛備皮。模型大鼠沿正中線切開，分離雙側頸總動脈，采用雙側頸動脈結扎法建立VD模型。假手術組大鼠僅分離雙側頸總動脈后縫合。整個手術過程取暖保證大鼠體溫，確保存活率。以造模大鼠新物體偏愛系數降低為造模成功標準［10］。除去建模過程中死亡大鼠，保證每組應有數量。

1.2.2 給藥方式 術后2周，鳶尾黃素低、中、高劑量組分別灌胃25、50、100 mg/kg鳶尾黃素，陽性對照組大鼠灌胃324 mg/kg吡拉西坦。假手術組和模型組大鼠灌胃等劑量生理鹽水，1次/d，連續28 d。

1.2.3 Morris水迷宮實驗 灌胃給藥結束后，各組大鼠進行Morris水迷宮實驗，1～5 d每天上午進行認知功能檢測：空間探索實驗及定位航行試驗。測量目標區域停留時間及穿越平臺次數，檢測大鼠學習記憶能力。

1.2.4 樣本采集 麻醉大鼠，采用微透析探針采集大鼠海馬組織間液35 μl，-80 ℃保存，用于大鼠海馬組織間液神經遞質水平檢測。大鼠麻醉后手術剝離腦組織并分離雙側海馬組織，-80 ℃保存，用于大鼠海馬組織BDNF、TrkB水平檢測。

1.2.5 高效液相色譜-電化學檢測大鼠海馬組織間液神經遞質水平 高效液相色譜-電化學檢測海馬組織間液去甲腎上腺素（noradrenaline，NE）、多巴胺（dopamine，DA）、5-羥色胺（serotonin，5-HT）和5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindole acetic acid，5-HIAA）水平。

1.2.6 RT-qPCR檢測大鼠海馬組織BDNF、TrkB表達 取海馬組織，Trizol法提取大鼠海馬組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度。按TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription kit逆轉錄試劑盒說明以RNA為模板進行逆轉錄獲得cDNA并于4 ℃保存，置于RT-PCR儀進行PCR擴增，反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃ 退火35 s，65 ℃延伸 30 s，擴增35個循環。以β-actin為內參，引物序列BDNF F：5′-AGGGGCATAGACAATCG-3′，R：5′-TTCCCCTTGATAATGGTC-3′；TrkB F：5′-AGTCGTCGAGACATGTC-3′，R：5′-CTGAAGACGACTGTTG-3′；β-actin F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2-ΔΔCt方法統計BDNF和TrkB mRNA相對表達。

1.2.7 Western blot檢測海馬組織蛋白表達 取出海馬組織，加入RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。沸水浴中煮沸10 min，電泳后轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入一抗（1∶5 000）4 ℃孵育過夜。次日PBS洗滌3次，加入相應二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，ECL發光液進行顯色，內參選擇β-actin。

1.3 統計學處理 使用SPSS22.0軟件分析數據。計量資料±s行t檢驗比較兩組間差異，單因素方差分析多組間差異。檢驗水準為α=0.05，雙側P＜0.05為差異有統計學意義。所有數據均采用Graph Pad Prism 8.0軟件繪圖。

2 結果

2.1 各組大鼠逃避潛伏期比較 模型組大鼠1～5 d逃避潛伏期均長于假手術組（P＜0.05）。與模型組相比，鳶尾黃素中、高劑量組和陽性對照組大鼠1～5 d逃避潛伏期均下降（P＜0.05）。模型組和鳶尾黃素低劑量組大鼠1～5 d逃避潛伏期差異無統計學意義（P＞0.05）。鳶尾黃素高劑量組和陽性對照組大鼠1～5 d逃避潛伏期差異無統計學意義（P＞0.05，表1）。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較（±s，n=12，s）Tab.1 Comparison of escape latency in each group （±s， n=12，s）

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較（±s，n=12，s）Tab.1 Comparison of escape latency in each group （±s， n=12，s）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05.

Groups1 d2 d3 d4 d5 d am operation72.56±15.5239.07±10.0626.70±10.5316.77±5.2110.84±3.48 Model94.47±15.901）74.58±11.381）51.82±9.761）41.91±7.851）31.98±6.631）23.56±7.33 19.03±4.032）15.13±2.972）13.99±2.042）Sh Low-dose tectorigenin Medium-dose tectorigenin High-dose tectorigenin Positive control 83.22±19.63 76.84±18.002）74.98±16.612）73.41±16.012）60.56±17.54 53.94±15.182）49.11±16.662）44.37±11.952）41.40±12.05 34.77±8.422）31.73±10.042）29.65±8.912）31.84±10.79 28.54±8.222）25.72±6.432）22.55±5.462）

2.2 各組大鼠目標區域停留時間、穿越平臺次數模型組大鼠目標區域停留時間和穿越平臺次數小于假手術組（P＜0.05）。與模型組相比，鳶尾黃素中、高劑量組和陽性對照組大鼠目標區域停留時間和穿越平臺次數增加（P＜0.05）。模型組和鳶尾黃素低劑量組目標區域停留時間和穿越平臺次數差異無統計學意義（P＞0.05）。鳶尾黃素高劑量組和陽性對照組目標區域停留時間和穿越平臺次數差異無統計學意義（P＞0.05，表2）。

表2 各組大鼠目標區域停留時間和穿越平臺次數比較（±s，n=12）Tab.2 Comparison on stay time in target area and times of crossing platform in each group （±s，n=12）

表2 各組大鼠目標區域停留時間和穿越平臺次數比較（±s，n=12）Tab.2 Comparison on stay time in target area and times of crossing platform in each group （±s，n=12）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05.

Times of crossing platform/times 6.43±1.57 2.48±1.451）3.87±1.37 4.85±1.322）5.19±1.712）5.47±1.652）Groups Sham operation Model Low-dose tectorigenin Medium-dose tectorigenin High-dose tectorigenin Positive control Stay time in target area/s 39.52±7.61 19.31±6.711）27.45±6.92 29.38±6.892）33.63±6.712）35.42±6.742）

2.3 各組大鼠海馬組織間液NE、DA、5-HT和5-HIAA水平比較 模型組大鼠海馬組織間液NE、DA、5-HT和5-HIAA水平均低于假手術組（P＜0.05）；與模型組相比，鳶尾黃素中、高劑量組和陽性對照組大鼠海馬組織間液NE、DA、5-HT和5-HIAA水平均升高（P＜0.05）；模型組和鳶尾黃素低劑量組大鼠海馬組織間液神經遞質水平差異無統計學意義（P＞0.05）。鳶尾黃素高劑量組和陽性對照組大鼠海馬組織間液神經遞質水平差異無統計學意義（P＞0.05，表3）。

表3 各組大鼠海馬組織間液神經遞質水平比較（±s，n=12）Tab.3 Comparison on levels of neurotransmitters in hippocampus interstitial fluid in each group （±s，n=12）

表3 各組大鼠海馬組織間液神經遞質水平比較（±s，n=12）Tab.3 Comparison on levels of neurotransmitters in hippocampus interstitial fluid in each group （±s，n=12）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05.

5-HIAA/（ng·ml-1）28.39±3.64 15.67±2.271）17.45±2.82 22.99±2.752）25.00±3.492）27.67±3.552）Groups Sham operation Model Low-dose tectorigenin Medium-dose tectorigenin High-dose tectorigenin Positive control NE/（ng·ml-1）41.76±6.79 23.23±4.211）24.96±3.73 31.51±3.822）34.84±4.282）36.96±6.552）DA/（ng·μl-1）38.20±3.13 15.43±1.661）28.94±3.54 31.24±3.482）35.46±4.412）36.74±2.462）5-HT/（ng·ml-1）60.41±6.13 34.88±4.341）37.11±3.38 43.66±3.242）50.77±3.712）58.29±2.402）

2.4 各組大鼠海馬區組織BDNF、TrkB mRNA水平比較 模型組大鼠海馬區組織BDNF、TrkB mRNA水平明顯低于假手術組（P＜0.05）；鳶尾黃素中、高劑量組和陽性對照組大鼠海馬區組織BDNF、TrkB mRNA水平明顯高于模型組（P＜0.05）。模型組和鳶尾黃素低劑量組大鼠海馬區組織BDNF、TrkB mRNA水平差異無統計學意義（P＞0.05）。鳶尾黃素高劑量組和陽性對照組大鼠海馬區組織BDNF、TrkB mRNA水平差異無統計學意義（P＞0.05，表4）。

表4 各組大鼠海馬組織BDNF、TrkB mRNA水平比較（±s，n=12）Tab.4 Comparison on mRNA levels of BDNF and TrkB in hippocampus in each group （±s，n=12）

表4 各組大鼠海馬組織BDNF、TrkB mRNA水平比較（±s，n=12）Tab.4 Comparison on mRNA levels of BDNF and TrkB in hippocampus in each group （±s，n=12）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05.

TrkB mRNA level 1.30±0.27 0.35±0.151）0.49±0.21 0.92±0.212）1.15±0.312）1.23±0.262）Groups Sham operation Model Low-dose tectorigenin Medium-dose tectorigenin High-dose tectorigenin Positive control BDNF mRNA level 2.41±0.42 0.51±0.181）0.66±0.27 1.46±0.352）1.78±0.362）2.12±0.372）

2.5 各組大鼠海馬組織BDNF、TrkB 蛋白水平比較 模型組大鼠海馬組織BDNF、p-TrkB /TrkB蛋白水平明顯低于假手術組（P＜0.05）；鳶尾黃素中、高劑量組和陽性對照組大鼠海馬組織BDNF、p-TrkB/TrkB蛋白水平明顯高于模型組（P＜0.05）。模型組和鳶尾黃素低劑量組大鼠海馬組織BDNF、p-TrkB/TrkB蛋白水平差異無統計學意義（P＞0.05）。鳶尾黃素高劑量組和陽性對照組大鼠海馬組織BDNF、p-TrkB/TrkB蛋白水平差異無統計學意義（P＞0.05，表5、圖1）。

圖1 各組大鼠海馬組織BDNF、TrkB 蛋白水平比較Fig.1 Comparison on BDNF and TrkB proteins levels in hippocampus in each group

表5 各組大鼠海馬組織BDNF、TrkB蛋白水平比較（±s，n=12）Tab.5 Comparison on BDNF and TrkB proteins levels in hippocampus in each group （±s，n=12）

表5 各組大鼠海馬組織BDNF、TrkB蛋白水平比較（±s，n=12）Tab.5 Comparison on BDNF and TrkB proteins levels in hippocampus in each group （±s，n=12）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05.

p-TrkB/TrkB 1.18±0.37 0.28±0.091）0.38±0.18 0.72±0.252）0.86±0.362）1.02±0.332）Groups Sham operation Model Low-dose tectorigenin Medium-dose tectorigenin High-dose tectorigenin Positive control BDNF 1.29±0.49 0.28±0.101）0.33±0.14 0.90±0.372）1.13±0.442）1.18±0.512）

2.6 各組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平比較 模型組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平明顯高于假手術組（P＜0.05）；與模型組相比，鳶尾黃素中、高劑量組和陽性對照組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。模型組和鳶尾黃素低劑量組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平差異無統計學意義（P＞0.05）。鳶尾黃素高劑量組和陽性對照組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平差異無統計學意義（P＞0.05，表6、圖2）。

圖2 各組大鼠TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平Fig.2 TLR4，MyD88 and p-NF-κB p65/NF-κB p65 protein levels in hippocampus in each group

表6 各組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NFκB p65 蛋白水平比較（±s，n=12）Tab.6 Comparison on of TLR4， MyD88 and p-NF-κB p65/NF-κB p65 proteins levels in hippocampus in each group （±s，n=12）

表6 各組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NFκB p65 蛋白水平比較（±s，n=12）Tab.6 Comparison on of TLR4， MyD88 and p-NF-κB p65/NF-κB p65 proteins levels in hippocampus in each group （±s，n=12）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05.

p-NF-κB p65/NF-κB p65 Groups TLR4 MyD88 0.10±0.02 0.45±0.131）0.41±0.11 0.20±0.072）0.15±0.032）0.12±0.032）Sham operation Model Low-dose tectorigenin Medium-dose tectorigenin High-dose tectorigenin Positive control 0.09±0.02 0.30±0.051）0.27±0.06 0.17±0.042）0.14±0.032）0.11±0.032）0.09±0.03 0.41±0.061）0.38±0.06 0.18±0.042）0.13±0.022）0.11±0.032）

3 討論

VD是腦血管病變所致智力障礙，與多種危險因素有關。盡管該病具有早期可預防性，但患病率和致死率常年居高不下［11-12］。本研究發現VD模型大鼠記憶能力明顯受損，經不同劑量鳶尾黃素干預后，大鼠空間學習記憶能力提高，說明鳶尾黃素在Morris水迷宮實驗中提高了VD模型大鼠學習記憶能力，對大腦神經有保護作用，有望成為改善認知缺陷的潛在治療藥物。

本研究中，模型組大鼠海馬組織間液NE、DA、5-HT和5-HIAA水平明顯低于假手術組，經不同劑量鳶尾黃素干預后，大鼠海馬組織間液NE、DA、5-HT和5-HIAA水平明顯升高。神經遞質是大腦中樞中存在的一類活性化學物質，主要抑制大腦清醒興奮，控制肌肉收縮、命令指令［13-14］。NE神經元是最主要的交感神經突觸遞質，參與中樞系統記憶學習［15］；DA屬于兒茶酚胺類物質，用于傳遞脈沖，調控神經系統［16］；5-HT是一種單胺神經遞質，屬于抑制性神經遞質，其水平變化與人體記憶、睡眠及情緒有關［17］。研究顯示益腎調氣法可提高VD大鼠右側海馬、前額葉皮質5-HT、NE、DA含量，改善大鼠學習記憶能力［18］。本研究顯示，鳶尾黃素干預VD大鼠可提高海馬組織間液NE、DA、5-HT和5-HIAA水平，說明鳶尾黃素可改善VD大鼠大腦海馬區域神經遞質減少情況，提高記憶能力。

海馬結構主司大腦記憶和認知，其結構破壞可影響大腦記憶功能，嚴重時可誘發VD。本研究中，模型組大鼠海馬組織BDNF、TrkB mRNA和蛋白水平明顯低于假手術組；VD模型大鼠給予不同劑量鳶尾黃素干預后，海馬組織BDNF、TrkB mRNA和蛋白水平明顯升高。BDNF主要存在于大腦皮質、海馬體，是一種具有生物學功能的神經營養因子，支持大腦缺血后中樞和周圍神經元存活［19］。已有研究證實BDNF與神經存活、學習、記憶、突觸活動等行為有關，通過與受體TrkB結合改善大腦學習記憶功能［20］。大腦細胞因缺氧、缺血等因素受損傷時，腦組織BDNF、TrkB水平顯著下降，學習記憶衰減。研究顯示VD大鼠海馬區組織BDNF、TrkB蛋白表達明顯下降，經滋腎活血方干預后提高VD大鼠海馬組織BDNF、TrkB蛋白表達，改善VD大鼠學習記憶能力［21］。本研究表明，鳶尾黃素干預VD模型大鼠可提高BDNF、TrkB表達，有效刺激下游因子，修復受損海馬神經元，最終提高VD大鼠學習、記憶能力。

本研究中，VD模型大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平較假手術組大鼠明顯升高，經不同濃度鳶尾黃素干預28 d，大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平較VD模型大鼠明顯下調，且鳶尾黃素高劑量組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平下降最為顯著。NF-κB是一種能調節多種炎癥反應的核轉錄因子，能夠介導多種炎癥介質和生長因子轉錄和表達［22-23］。MyD88是TLR4通路重要的銜接分子，NF-κB作為重要的多向性核轉錄因子，位于TLR4通路下游中心位置參與免疫應答［24］。研究顯示肌肽可通過抑制NF-κB信號通路提高對VD大鼠的神經保護作用［25］。本研究表明VD模型大鼠腦組織海馬區TLR4/MyD88/NFκB信號通路被激活，鳶尾黃素干預后TLR4/MyD88/NF-κB信號通路明顯受抑制。

綜上，本研究證實鳶尾黃素可能通過調節TLR4/MyD88/NF-κB信號通路改善VD大鼠認知功能障礙，為腦健康領域研究提供了依據，但仍存在不足，鳶尾黃素能否通過調控其他信號通路改善VD大鼠認知缺陷尚未進行深入研究，也是今后研究方向。