黃芪多糖通過減輕免疫炎癥抑制病毒性肝炎小鼠肝損傷

陳辰 胡麗霞 （武漢市第一醫院，武漢 430000）

病毒性肝炎是指由肝炎病毒感染引起的肝臟病變，是臨床上常見的傳染病。流行病學資料顯示，我國常見的病毒性肝炎病毒類型有甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎病毒，其中乙型肝炎病毒最為常見，其發病率約為81.54/100 000，病死率約為0.05/100 000［1］。另有資料指出，病毒性肝炎是肝癌的危險因素，其中慢性乙型肝炎患者罹患肝癌的概率約是健康人群的200倍，可見其危害極為嚴重［2］。目前臨床上針對病毒性肝炎患者主要采用抗病毒、免疫調節、保肝、控制并發癥等方案治療，但仍有部分患者效果不佳［3-4］。黃芪多糖是中藥材黃芪的有效成分，可調節機體免疫，且具有抗病毒、抗炎等作用，且有研究證實黃芪多糖注射液可保護乙肝患者的肝功能，但其具體作用機制有待深入探討［5］。核苷酸結合寡聚化結構域1（NOD1）是一類胞漿內受體，對細胞內的病原體有特異性的識別作用，當細胞內侵入病原體后NOD1表達升高，可激活其下游的受體相互作用蛋白2（RIP2），進而上調核轉錄因子-κB p65（NF-κB p65），促進NF-κB p65磷酸化（p-NF-κB p65）參與免疫炎癥反應，并誘導組織損害［6-7］。有研究證實在病毒性肝炎發生及發展過程中NOD1/RIP2/NF-κB通路被激活，而阻斷該通路信號傳導有助于減輕免疫炎癥反應，抵抗肝損傷［8］。然而黃芪多糖是否可通過該途徑保護病毒性肝炎的肝組織結構和肝功能尚不清楚。為探討該問題，本研究取60只雌性C3H/HeJ小鼠建立病毒性肝炎模型開展動物實驗，旨在為黃芪多糖在病毒性肝炎患者中的推廣使用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與細胞 60只雌性C3H/HeJ小鼠，無特定病原體級，6～8周齡，體質量（21±2） g，購自中國科學院上海實驗動物中心，許可證號：SCXK（滬）2020-0001，飼養于小鼠標準代謝籠中，溫度21～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h光照/12 h黑暗，自由進食、飲水，適應性喂養1周。L2細胞株（貨號：G10561）購自中國上海拜利生物科技有限公司。本研究經武漢大學實驗動物中心倫理委員會審批通過,審批號：WDRM動(福)第20200607號。

1.1.2 藥物與試劑 黃芪多糖凍干（北京愛迪森生物科技公司，批號：2006134）；胸腺肽-α1（上海豐壽生物科技公司，批號：2004128）；3型鼠肝炎病毒（MHV-3）（上海雅吉公司，貨號：14-36430）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、甲基纖維素、二甲苯溶液、細胞裂解液（美國Sigma公司，批號：200413、200711、200116、200518）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（Solarbio中國公司，批號：2007135）；結晶紫染色試劑盒、鼠血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）檢測試劑盒、鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-8檢測試劑盒（上海歌凡生物，批號：2003169、2004155、2003128、2006196、2007102、2005119、2005203）；最小必需培養基-2（MEM-2）（美國Cellgro公司，貨號：G1002159）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司，貨號：15896075）；逆轉錄試劑盒（美國Qiagen公司，貨號：208132）；NOD1、RIP2、NF-κB p65與內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物序列（參照Gene bank信息，利用Primer5.0軟件設計，委托深圳晶美生物科技有限公司合成并驗證）；二甲喹啉法（BCA）蛋白定量試劑盒（美國Sigma公司，批號：200716）；兔抗鼠NOD1、RIP2、NF-κB p65、p-NF-κB p65單克隆抗體工作液，羊抗兔NOD1、RIP2、NF-κB p65、p-NF-κB p65多克隆抗體工作液（Abcam中國公司，批號：RS02507A、RS02611C、RS02718A、RS02756A、RM02619B、RM02723B、RM02804A、RM03108C）。

1.1.3 儀器 RM5220型小鼠標準代謝籠（上海玉研生物科技）；OptiMair型超凈工作臺（新加坡易思高）；TP-114型電子天平（美國Denver公司）；AllegraX-5型臺式離心機（美國Beckman coulter公司）；MDF-U32V型超低溫冰箱（日本Sanyo公司）；IN55型CO2培養箱（德國Memmert公司）；TONE96型聚合酶鏈反應（PCR）儀（德國Jena公司）；NSW-20PHC型光學顯微鏡（日本Carton公司）；AU480型全自動生化分析儀（美國Beckman coulter公司）；Trans-Blot Turbo型轉膜儀、PowerPacTM型凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 建模、分組與給藥方法 將60只雌性C3H/HeJ小鼠，采用隨機數字表法分為建模組（50只）和正常組（10只）。建模組采用MHV-3腹腔注射建立病毒性肝炎小鼠模型［9］，取0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）對MHV-3進行稀釋，純化后取10 pfu/200 μl腹腔注射，每只200 μl，正常組同步腹腔注射等量無菌PBS。2周后建模組和正常組中各隨機取1只小鼠斷頭法處死，迅速剝離肝組織，HE染色觀察肝組織病理改變；檢測肝組織病毒空斑數［10］，計數病毒空斑（同1.2.3）。驗證建模成功后，將建模組存活小鼠采用隨機數字表法分為模型組、胸腺肽組、黃芪多糖低、中、高劑量組。胸腺肽組腹腔注射胸腺肽-α1 10 μg，黃芪多糖低、中、高劑量組腹腔注射100、200、400 mg/kg黃芪多糖凍干溶于1 ml/100 g體質量的生理鹽水中腹腔注射（相當于臨床等效劑量、2倍臨床等效劑量、4倍臨床等效劑量），模型組和正常組予以等量生理鹽水腹腔注射，各組均每天給藥1次，連續1個月。

1.2.2 肝臟指數、肝功能指標及炎癥因子水平檢測 各組小鼠均于干預后采用斷頭法處死，電子天平稱取體質量和肝臟質量，肝臟指數（%）=體質量/肝臟質量×100%。另摘取小鼠眼球取外周血，3 500 r/min離心，取上清液采用全自動生化分析儀測定各組肝功能指標（ALT、AST、TBIL）和炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-8）水平。

1.2.3 肝組織HE染色和病毒滴度檢測 剝離各組小鼠肝組織，用10%甲醛固定，石蠟包埋，連續4 μm切片，烤片，二甲苯15 min脫蠟2次，梯度乙醇水化（無水乙醇、95%、85%、75%乙醇各3 min），蒸餾水水化3 min。蘇木素染色10 min，流水沖洗后鹽酸乙醇分化，流水藍化，伊紅復染1 min，梯度乙醇脫水（75%、85%、95%乙醇和無水乙醇各1 min），二甲苯透明后封固，觀察肝組織病理變化。檢測肝組織病毒空斑數［10］，取肝組織勻漿，用MEM-2培養基梯度稀釋上清液做滴度分析，另于24孔板內培養基培養L2細胞至匯合率達90%。將L2細胞陳舊培養基棄去，用PBS洗滌，將50 μl稀釋好的肝臟組織上清液均勻鋪于細胞層，室溫下無菌操作臺內每10～15 min混合1次，共3次，促使細胞與病毒充分接觸。將2%甲基纖維素取出與培養液等體積比例混合，500 μl/孔細胞均勻鋪在被病毒感染的細胞層，待其凝固后轉移細胞培養板至CO2培養箱中37 ℃ 16～20 h，取出細胞并將上層甲基纖維素-培養層挑出，結晶紫染色，5 min后自來水沖洗，計數病毒空斑。

1.2.4 肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達 采用實時逆轉錄PCR法檢測肝組織上述基因表達。將肝組織液氮研磨，加入1 ml 預冷Trizol試劑混勻后提取RNA，調整濃度為0.5 μg/μl，合成互補的DNA。設計并合成PCR反應引物，其中NOD1正向引物：5'-GAACTCGAGAATGAAATGAAATTAAATATGG-3'，反向引物：5'-GAACCGCGGACTCATTCATTCAGGGAAACTGG-3'，預計產物長度186 bp；RIP2：正向引物：5'-CTGAATATCCTGATGTTGCTTGGC-3'，反向引物：5'-TTGCTACTTCGTGACTGTGAGAG-3'，預計產物長度198 bp；NF-κB p65：正向引物：5'-AGTTGAGGGGACTTCCCAGG-3'，反向引物：5'-CCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3'，預計產物長度210 bp；GAPDH：正向引物：5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，反向引物：5'-ACGCCTGCTTCACCACCTT-3'，預計產物長度140 bp。擴增反應：94 ℃5 min，40次循環，94 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s，54 ℃ 10 min。設置陰性對照，即加入不含擴增基因的模板PCR反應。60 ℃測定熒光值繪制熔解曲線，2-ΔΔCt計算。

1.2.5 肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達及p-NF-κB p65水平 采用免疫印跡法檢測肝組織上述蛋白表達及p-NF-κB p65水平。取100 mg肝臟組織勻漿后加入細胞裂解液1 ml，提取總蛋白后定量。凝膠分離50 μg蛋白的抽提物，電泳后將其轉膜，并于洗膜后加入兔抗鼠單克隆抗體（稀釋比例1∶1 000），4 ℃過夜。再次洗膜后加入酶標記的羊抗兔多克隆抗體工作液（稀釋比例1∶2 500），37 ℃ 2 h。再次洗膜后壓片，以Quantity one軟件分析目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值，計算二者的比值；免疫組化法檢測肝組織上述蛋白表達及p-NF-κB p65水平，取100 mg肝臟組織，經0.1 mol/L甲醛溶液浸泡24 h固定。石蠟包埋、修整，梯度濃度乙醇脫水（70%乙醇溶液6 h→80%乙醇溶液6 h→95%乙醇溶液Ⅰ12 h→95%乙醇溶液Ⅱ 12 h→100%乙醇Ⅰ1.5 h→100%乙醇Ⅱ 1.5 h）。檸檬酸0.1 g+檸檬酸三鈉0.75 g+200 ml蒸餾水對組織塊進行抗原熱修復，連續切片（層厚4 μm），65 ℃、24 h烤片。二甲苯15 min 3次，乙醇水化，沖洗5 min，3%過氧化氫溶液孵育（室溫15 min）。37 ℃封閉孵育0.5 h，滴加一抗，沖洗5 min 3次，滴加二抗（1∶2 000），沖洗5 min×3次。二氨基聯苯胺顯色，蘇木精復染，樹膠封片。Image J軟件分析各蛋白的積分光密度（IOD）。

1.3 統計學方法 采用SPSS24.0軟件進行統計學分析，計量資料符合正態分布，采用±s描述，并用單因素方差分析和SNK-q檢驗，兩樣本比較采用成組t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模型驗證及各組樣本量、結局情況 正常組和建模組小鼠肝組織HE染色顯示，正常組肝細胞索以中央靜脈為中心向四周放射，肝小葉結構清晰，肝細胞聯系緊密且核大、核圓，核仁明顯，胞質豐富，匯管區結構清晰；建模組肝細胞明顯腫脹，且有水樣變性，胞質疏松，有散在點狀壞死和淋巴細胞浸潤，見圖1。

圖1 正常組與建模組小鼠肝組織病理改變（HE染色，×200）Fig.1 Pathological changes of liver tissue in normal group and modeling group （HE staining， ×200）

正常組小鼠肝組織病毒空斑數為0，建模組為4.20×104個/g），差異有統計學意義（t=148.975，P＜0.001）。根據HE染色和肝組織病毒空斑數對比結果證實建模組模型建立成功，其中正常組余9只小鼠，建模組有49只存活小鼠，將其采用隨機數字表分為模型組（10只）、胸腺肽組（9只）、黃芪多糖低、中、高劑量組（各10只），給藥期間均無小鼠死亡。

2.2 干預后各組小鼠肝臟指數、血清ALT、AST和TBIL水平比較 干預后各組小鼠肝臟指數、血清ALT、AST和TBIL水平比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；與正常組比較，模型組肝臟指數、血清ALT、AST和TBIL水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，胸腺肽組、黃芪多糖各劑量組肝臟指數、血清ALT、AST和TBIL水平均降低（P＜0.05）；與胸腺肽組比較，黃芪多糖低劑量組肝臟指數、血清ALT、AST和TBIL水平均升高（P＜0.05），黃芪多糖高劑量組肝臟指數、血清ALT、AST和TBIL水平均降低（P＜0.05），見表1。

表1 干預后各組小鼠肝臟指數、血清ALT、AST和TBIL水平比較（±s）Tab.1 Comparison of liver indexes， serum ALT， AST and TBIL levels of mice in each group after intervention （±s）

表1 干預后各組小鼠肝臟指數、血清ALT、AST和TBIL水平比較（±s）Tab.1 Comparison of liver indexes， serum ALT， AST and TBIL levels of mice in each group after intervention （±s）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05；compared with thymosin group， 3）P＜0.05.

TBIL/（μmol·L-1）31.22±6.01 104.25±22.711）64.25±15.402）88.46±20.352）3）62.37±13.282）52.55±10.472）3）34.752＜0.001 Groups Normal （n=9）Model （n=10）Thymosin （n=9）Astragalus polysaccharide low dose （n=10）Astragalus polysaccharide middle dose （n=10）Astragalus polysaccharide high dose （n=10）F P Liver index/%3.55±0.50 5.63±0.891）4.01±0.522）4.32±0.642）3）3.97±0.562）3.71±0.532）3）13.298＜0.001 ALT/（U·L-1）19.25±3.16 178.59±24.671）81.69±17.542）111.22±21.022）3）83.20±16.322）50.17±9.382）3）29.315＜0.001 AST/（U·L-1）87.05±17.20 165.21±24.351）102.04±20.252）140.30±21.782）3）101.91±19.792）93.18±19.602）3）40.068＜0.001

2.3 干預后各組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平比較 干預后各組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；與正常組比較，模型組血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，胸腺肽組、黃芪多糖各劑量組血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平均降低（P＜0.05）；與胸腺肽組比較，黃芪多糖低劑量組血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平均升高（P＜0.05），黃芪多糖高劑量組血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平均降低（P＜0.05），見表2。

表2 干預后各組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平比較（±s）Tab.2 Serum TNF-α， IL-1β and IL-8 levels of mice in each group after intervention （±s）

表2 干預后各組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平比較（±s）Tab.2 Serum TNF-α， IL-1β and IL-8 levels of mice in each group after intervention （±s）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with thymosin group， 3）P＜0.05.

IL-8/（mg·L-1）25.45±5.33 786.97±104.551）325.15±60.082）502.13±85.422）3）327.85±61.572）104.86±20.092）3）69.189＜0.001 Groups Normal （n=9）Model （n=10）Thymosin（n=9）Astragalus polysaccharide low dose （n=10）Astragalus polysaccharide middle dose （n=10）Astragalus polysaccharide high dose （n=10）F P TNF-α/（ng·L-1）16.83±3.02 51.52±10.381）34.25±6.822）42.04±7.632）3）32.96±7.012）24.67±5.222）3）31.675＜0.001 IL-1β/（ng·L-1）9.02±1.79 20.30±4.581）14.02±3.042）16.31±3.752）3）13.98±3.012）11.22±2.752）3）42.453＜0.001

2.4 干預后各組小鼠肝組織病理改變比較 干預后正常組小鼠肝組織HE染色表現同2.1；模型組肝細胞有嚴重水腫，且可見大量點狀壞死灶，有嚴重肝索排列紊亂、肝竇擠壓變窄、炎癥浸潤等表現；黃芪多糖低劑量組肝細胞有明顯水腫，有部分點狀壞死灶，肝索排列紊亂、肝竇擠壓變窄等表現；黃芪多糖中劑量組和胸腺肽組肝細胞有水腫，可見少部分點狀壞死灶，有輕微肝索排列紊亂、肝竇擠壓變窄等表現；黃芪多糖高劑量組少部分肝細胞水腫，極少壞死，肝細胞基本聯系緊密且胞質豐富，見圖2。

圖2 干預后各組小鼠肝組織病理改變（HE染色，×200）Fig.2 Pathological changes of liver tissue of mice in each group after intervention （HE staining， ×200）

2.5 干預后各組小鼠肝組織病毒空斑數比較 干預后各組小鼠肝組織病毒空斑數比較差異有統計學意義（P＜0.05）；與正常組比較，模型組肝組織病毒空斑數增多（P＜0.05）；與模型組比較，胸腺肽組、黃芪多糖劑量組肝組織病毒空斑數均降低（P＜0.05）；與胸腺肽組比較，黃芪多糖低劑量組肝組織病毒空斑數增多（P＜0.05），黃芪多糖高劑量組肝組織病毒空斑數減少（P＜0.05），見表3。

表3 干預后各組小鼠肝組織病毒空斑數比較（±s，1×104個/g）Tab.3 Comparison of viral plaque number in liver tissue of mice in each group after intervention （±s，1×104/g）

表3 干預后各組小鼠肝組織病毒空斑數比較（±s，1×104個/g）Tab.3 Comparison of viral plaque number in liver tissue of mice in each group after intervention （±s，1×104/g）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05；compared with thymosin group， 3）P＜0.05.

Groups Virus plaque number Normal （n=9）Model （n=10）Thymosin （n=9）Astragalus polysaccharide low dose （n=10）Astragalus polysaccharide middle dose （n=10）Astragalus polysaccharide high dose （n=10）0 7.10±1.251）3.01±0.542）4.63±0.722）3）2.96±0.522）2.18±0.372）3）47.865＜0.001 F P

2.6 干預后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達比較 干預后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；與正常組比較，模型組肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達均升高（P＜0.05）；與模型組比較，胸腺肽組、黃芪多糖劑量組肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達均降低（P＜0.05）；與胸腺肽組比較，黃芪多糖低劑量組肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達均升高（P＜0.05），黃芪多糖高劑量組肝組織NOD1、RIP2、NFκB p65 mRNA表達均降低（P＜0.05），見表4。

表4 干預后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達比較（±s）Tab.4 Comparison of mRNA expressions of NOD1，RIP2 and NF-κB p65 in liver tissues of mice in each group after intervention （xˉ±s）

表4 干預后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達比較（±s）Tab.4 Comparison of mRNA expressions of NOD1，RIP2 and NF-κB p65 in liver tissues of mice in each group after intervention （xˉ±s）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05；compared with thymosin group， 3）P＜0.05.

Groups Normal（n=9）Model （n=10）Thymosin （n=9）Astragalus polysaccharide low dose （n=10）Astragalus polysaccharide middle dose（n=10）Astragalus polysaccharide high dose （n=10）NOD1 0.47±0.06 1.38±0.241）0.71±0.122）0.97±0.152）3）RIP2 0.32±0.05 1.55±0.291）0.76±0.092）1.04±0.182）3）NF-κB p65 0.65±0.08 1.46±0.351）0.83±0.072）0.99±0.092）3）0.73±0.102）0.74±0.102）0.85±0.082）0.71±0.102）3）29.256＜0.001 F P 0.60±0.082）3）32.074＜0.001 0.59±0.082）3）29.653＜0.001

2.7 干預后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達、p-NF-κB p65水平比較 干預后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達、p-NF-κB p65水平比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；與正常組比較，模型組肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達、p-NF-κB p65水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，胸腺肽組、黃芪多糖劑量組肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達、p-NF-κB p65水平均降低（P＜0.05）；與胸腺肽組比較，黃芪多糖低劑量組肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達、p-NF-κB p65水平均升高（P＜0.05），黃芪多糖高劑量組肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達、p-NF-κB p65水平均降低（P＜0.05），見圖3、圖4、表5、表6。

表5 干預后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達、p-NF-κB p65水平比較（±s）Tab.5 Comparison of NOD1， RIP2 and NF-κB p65 protein expressions and p-NF-κB p65 levels in liver tissue of mice in each group after intervention （±s）

表5 干預后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達、p-NF-κB p65水平比較（±s）Tab.5 Comparison of NOD1， RIP2 and NF-κB p65 protein expressions and p-NF-κB p65 levels in liver tissue of mice in each group after intervention （±s）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05；compared with thymosin group， 3）P＜0.05.

Groups Normal （n=9）Model （n=10）Thymosin （n=9）Astragalus polysaccharide low dose （n=10）Astragalus polysaccharide middle dose （n=10）Astragalus polysaccharide high dose （n=10）NF-κB p65 p-NF-κB p65 0.09±0.03 0.98±0.141）0.34±0.052）0.56±0.092）3）0.32±0.042）0.18±0.032）3）35.433＜0.001 F P NOD1 0.85±0.17 1.69±0.301）1.08±0.172）1.24±0.202）3）1.06±0.152）0.97±0.122）3）30.383＜0.001 RIP2 0.50±0.08 1.36±0.241）0.81±0.132）0.99±0.172）3）0.80±0.112）0.68±0.072）3）37.602＜0.001 0.76±0.12 1.88±0.371）1.05±0.222）1.32±0.252）3）1.02±0.212）0.87±0.172）3）31.245＜0.001

表6 干預后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白、p-NF-κB p65水平IOD比較（±s）Tab.6 Comparison of IOD of NOD1， RIP2 and NF-κB p65 protein comparisons and p-NF-κB p65 levels in liver tissue of mice in each group after intervention （±s）

表6 干預后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白、p-NF-κB p65水平IOD比較（±s）Tab.6 Comparison of IOD of NOD1， RIP2 and NF-κB p65 protein comparisons and p-NF-κB p65 levels in liver tissue of mice in each group after intervention （±s）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05；compared with thymosin group， 3）P＜0.05.

p-NF-κB p65 Groups NOD1 RIP2 NF-κB p65 655.54±103.62 1 948.79±429.611）1 043.14±195.852）1 388.60±255.962）3）1 030.36±191.242）841.35±163.772）3）48.819＜0.001 Normal （n=9）Model （n=10）Thymosin （n=9）Astragalus polysaccharide low dose （n=10）Astragalus polysaccharide middle dose （n=10）Astragalus polysaccharide high dose （n=10）F P 1 852.86±315.47 3 796.54±642.831）2 420.53±428.792）2 798.66±504.972）3）2 436.78±435.892）2 169.78±518.772）3）41.527＜0.001 1 231.04±226.97 3 359.95±671.551）1 994.57±302.312）2 586.53±478.062）3）1 971.83±312.542）1 657.52±244.952）3）50.076＜0.001 897.52±143.00 2 218.53±547.051）1 239.51±196.992）1 557.64±301.352）3）1 247.68±201.522）1 026.37±189.662）3）44.784＜0.001

圖3 干預后各組小鼠肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65蛋白表達、p-NF-κB p65水平檢測Fig.3 Detection of NOD1， RIP2 and NF-κB p65 protein expressions and p-NF-κB p65 levels in liver tissues of mice in each group after intervention

圖4 干預后各組小鼠肝組織NOD1、NF-κB p65、RIP2蛋白及p-NF-κB p65水平檢測（免疫組化法，×100）Fig.4 Detection of NOD1 protein，NF-κB p65 protein，RIP2 protein and p-NF-κB p65 levels in liver tissue of mice in each group after intervention （immunohistochemical method， ×100）

3 討論

病毒性肝炎不僅可導致肝組織炎癥損傷，還可發展為肝硬化、肝功能衰竭甚至是肝細胞癌。然而目前常用的抗病毒藥物雖然能抑制或殺滅病毒、減輕對肝組織造成的損傷，但其效果仍有改進空間。黃芪多糖是中藥材黃芪提取物的主要成分，具有抗病毒、調節機體免疫、保護肝臟等作用［11-12］，因此本研究重點探討該藥物對病毒性肝炎小鼠的作用及分子機制。

當病毒侵入機體后，巨噬細胞與樹突狀細胞等可快速識別病原微生物并吞噬、消滅，并且同時可產生干擾素及相關的細胞因子，將病毒信息加工處理后傳遞給淋巴細胞，進而激活免疫應答，增強對病毒的抵抗作用［13］。然而在病毒感染情況下免疫細胞可產生干擾素和炎癥細胞因子，包括TNF-α、IL-1β和IL-8等促炎癥因子，誘發炎癥反應，若免疫激活狀態失控則可產生大量的干擾素和炎癥細胞因子，導致炎癥性組織損害。有報道指出，在病毒性肝炎小鼠可見肝組織炎癥浸潤和點狀壞死灶，且肝細胞有腫脹、變性表現［14］，本研究結果與該報道相符，證實病毒感染可導致肝組織炎癥損傷，也提示抑制免疫炎癥反應是減輕病毒性肝炎肝損傷的重要途徑。

MHV-3腹腔注射是常用的病毒性肝炎建模方法，該病毒株穩定，毒力強，可引起小鼠病毒性肝炎炎癥損傷［15］。C3H/HeJ小鼠存在Toll樣受體4（TLR4）基因自發性突變，對脂多糖無反應［16］。而TLR4可與肝炎病毒相互作用引起組織炎癥，因此本研究選用MHV-3腹腔注射方法對C3H/HeJ雌鼠建立病毒性肝炎模型，且獲得了與吳婷等［17］學者一致的結果，為后續實驗的順利開展奠定了基礎。

本研究中干預后模型組小鼠肝臟指數、肝功能、炎癥因子水平和肝組織病毒空斑數均高于正常組，證實病毒性肝炎小鼠建模成功，肝組織中有大量MHV-3病毒，且可造成炎癥反應并引起肝功能損害，模型組肝組織病理較正常組嚴重改變，表明該建模方法可導致肝組織損害。此外，本研究中胸腺肽組和黃芪多糖劑量組肝臟指數、肝功能、炎癥因子水平和肝組織病毒空斑數均低于模型組，肝組織病理也較模型組減輕，且黃芪多糖高劑量組的效果與作用均最佳，可知胸腺肽和黃芪多糖均可保護病毒性肝炎小鼠的肝功能，減輕炎癥反應和肝組織病理改變，推測與肝組織中病毒感染和復制受到抑制有直接關系。黃芪多糖增強機體免疫力、抗病毒的作用已經得到既往報道的認可［18-20］。有研究指出，黃芪多糖可誘導產生干擾素，促進抗體形成，增強機體免疫功能［21］；另有報道表明，黃芪多糖主要是通過提高非特異性抗體水平增強機體免疫力從而發揮抗病毒作用，這表明黃芪多糖很可能通過抑制病毒性肝炎小鼠免疫激活導致的炎癥反應減輕肝組織損傷［22］。既往報道顯示，黃芪多糖可降低免疫性肝損傷小鼠血清炎癥因子TNF-α水平并改善肝功能指標，本研究與該報道相符［23］；另有研究顯示，黃芪多糖能夠通過調節免疫性肝損傷小鼠脾臟淋巴細胞表面CD28、CD80表達調節機體免疫功能［24］。本研究在此基礎上探討了黃芪多糖對病毒性肝炎小鼠可能的免疫效應調節機制，具有一定的創新性。另外胸腺肽屬于胸腺組織分泌的具有生理活性的多肽，也是目前常用的免疫調節劑，有報道證實胸腺肽-α1可調節機體免疫，并改善慢性乙型肝炎患者的肝功能，推測該藥物很可能通過調節機體免疫，抑制炎癥反應，進而減輕肝損傷發揮改善肝功能的作用［25］。故而本研究選用胸腺肽-α1作為陽性對照藥物。

病毒感染所致的免疫激活進而引發肝組織炎癥損傷是一個十分復雜的病理過程，其中NOD1/RIP2/NF-κB通路參與并發揮重要作用。NODs的寡聚化被認為是受體激活與信號傳遞的表現，無論是直接識別病毒感染或病毒感染間接導致的NOD1被激活均可引起免疫炎癥反應。煙曲霉菌感染可激活NOD1，進而引起氣管上皮和肺組織上皮炎癥浸潤與組織損害，本研究也發現MHV-3感染可導致肝組織NOD1表達上調。RIP2位于NOD1的下游，屬于一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，對半胱氨酸蛋白酶有募集作用，并且能夠與NF-κB通路相互介導，參與細胞變性、凋亡等［26-27］。有報道證實，敲除小鼠胚胎纖維原細胞中RIP2，NOD1激動劑并不能激活NF-κB，這就說明RIP2是NOD1和NF-κB的橋梁，也是NOD1信號通路中信息轉入的關鍵分子［28］。RIP2被激活后可對IκB激酶家族產生誘導作用，上調NF-κB表達，以NF-κB p65為代表的分子大量活化，p-NF-κB p65水平升高，啟動相關炎癥基因的表達，抵御致病微生物。然而NF-κB持續激活同時也會誘導機體釋放大量的TNF-α、IL-1β和IL-8等因子，導致組織炎癥浸潤和功能損傷，有研究證實NF-κB表達升高甚至可導致器官衰竭，且與炎癥反應有緊密關系［29］。因此在病毒性肝炎治療時抑制NOD1/RIP2/NF-κB通路的信號傳導有利于減輕免疫激活所致的炎癥反應引發的肝組織損傷。本研究結果中胸腺肽組和黃芪多糖劑量組肝組織NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA與蛋白表達，p-NF-κB p65水平均低于模型組，而模型組則均高于正常組，與上述分析一致，推測可能因為黃芪多糖是通過抑制NOD1/RIP2/NFκB通路減輕病毒性肝炎小鼠肝損傷的，且高劑量的黃芪多糖效果更理想，提示該藥物在此方面有理想的開發價值。

對C3H/HeJ雌鼠采用MHV-3腹腔注射法可建立病毒性肝炎模型，且可見肝組織病理改變和病毒侵害；胸腺肽和黃芪多糖均可降低肝臟指數，改善肝功能，減輕炎癥反應和肝損傷，減少病毒空斑數；胸腺肽和黃芪多糖可能通過抑制NOD1/RIP2/NF-κB通路減輕病毒性肝炎小鼠肝損傷；黃芪多糖的作用呈劑量依賴性，中劑量黃芪多糖作用與胸腺肽相當，而高劑量黃芪多糖作用更理想。