基于ERK介導C-Myc/PD-L1協同作用探討參芪抑瘤方聯合順鉑對H22肝癌荷瘤小鼠的抑瘤機制

楊玉萍 段永強 白敏 馮鑫 周楠 曹力仁 李亞榮 馬蘭

（甘肅中醫藥大學，甘肅省實驗動物行業技術中心，蘭州 730000）

原發性肝癌（primary liver cancer，PLC）是我國常見的惡性腫瘤之一，其病死率高居國內惡性腫瘤第二位［1］。肝癌治療方法雖日趨成熟，但臨床大多選用放化療治療手段，在抑制腫瘤生長的同時不可避免地損傷了免疫系統，而腫瘤免疫治療能夠提高機體免疫功能，破壞腫瘤細胞［2-4］。程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）及其配體（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）是免疫治療當中較為關鍵的蛋白，是一種膜蛋白，其分泌至腫瘤細胞膜表面后與T細胞表面的PD-1相結合后抑制機體的免疫應答，促進腫瘤的發生和轉移［5-6］。此外，原癌基因C-Myc可以直接與PD-L1基因的啟動子結合，從轉錄水平促進PD-L1表達，從而破壞機體免疫穩態，抑制自身免疫的發展，誘導腫瘤的發生，促進細胞增殖、分化，是正常細胞轉化為腫瘤細胞的中心環節［7-8］。C-Myc是MAPK/ERK通路的下游關鍵分子，PD-L1與C-Myc具有相協性［9］。目前從MAPK/ERK通路介導的C-Myc/PD-L1協同作用對腫瘤的抑制作用尚無文獻研究。因此，本研究通過觀察不同劑量的參芪抑瘤方聯合順鉑靶向干預MAPK/ERK通路對H22肝癌荷瘤小鼠組織中C-Myc與PD-L1基因表達影響，探討參芪抑瘤方聯合順鉑對H22肝癌荷瘤小鼠的抑瘤作用及分子機制，為參芪抑瘤方的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細胞 SPF級雄性昆明小鼠，由甘肅中醫藥大學SPF級動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（甘）2020-0009。本實驗經甘肅中醫藥大學動物實驗倫理委員會審批（倫理審查批準號：2021-205），70日齡，體質量18～22 g。H22肝癌細胞株，購自武漢普諾賽生命科技有限公司（BRF1A0KT 3Q）。

1.1.2 藥物 參芪抑瘤方：黃芪30 g、當歸20 g、山慈菇10 g、土貝母10 g、苦參15 g、八月札30 g、莪術10 g、半枝蓮20 g、白術18 g、枳殼12 g、人參15 g，購自甘肅中醫藥大學附屬醫院藥房。注射用順鉑（OKO554B03）購自甘肅中醫藥大學附屬醫院。

1.1.3 試劑與儀器 RIPA裂解液（Cat#R0010）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（Cat#PC0020）、4×蛋白質上樣緩沖液（P1016）、蛋白磷酸酶抑制劑（CatP126 D）購自北京索萊寶科技有限公司；p-ERKV2（GTX24819）、C-Myc（GTX31308）、PD-L1（GTX1034-36）、β-actin（YM3028）；ECL化學發光超敏顯色試劑盒（57105010）；EGF ELISA試劑盒（2202M03），IFN-γ ELISA試劑盒（2202M16）；總RNA提取試劑盒（W9414）；逆轉錄試劑盒（G7106010）；實時qPCR Mix（H9114010）。電泳儀（041BR69450）、VE-180型垂直板電泳裝置（153BR111209）、酶標儀（iMark）、梯度PCR儀（T100）購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；GeLView 6000plus凝膠成像系統購自廣州博鷺騰生物科技有限公司；實時熒光定量PCR儀（CG-05）購自杭州晶格科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 復制H22肝癌荷瘤小鼠模型 取H22肝癌細胞株解凍，復蘇H22肝癌細胞，細胞復蘇后，將細胞濃度調至1×107個/ml，每只昆明小鼠腹腔接種0.2 ml。腹腔傳至第3代，抽取淡黃色腹水，進行細胞計數，選取最佳細胞濃度3×106個/ml，每只0.1 ml接種于小鼠右前肢腋窩皮下。接種第5～7天小鼠右前肢腋窩下可觸及黃豆大小腫塊提示模型復制成功［10］，可進行后續實驗。

1.2.2 小鼠分組及干預 60只SPF級雄性昆明小鼠，采用隨機數字表法取10只小鼠作為空白組，其50只小鼠復制H22肝癌荷瘤小鼠模型，模型復制成功后將模型小鼠隨機分為模型組、順鉑組、參芪抑瘤方低、中、高劑量聯合順鉑組（低、中、高劑量聯合組）。順鉑和參芪抑瘤方給藥均按照人與動物體質量進行折算［11］，順鉑給藥量為2.5×10-3g/（kg·3 d）。低、中、高劑量聯合組分別在順鉑正常給藥的基礎上聯用不同劑量［13.515 g/（kg·d）、27.030 g/（kg·d）、54.060 g/（kg·d）］參芪抑瘤方湯劑灌胃?？瞻捉M與模型組均給予相同體積生理鹽水灌胃及腹腔注射，連續干預13 d，末次給藥24 h后，用戊巴比妥鈉（0.2 ml/只）麻醉處死小鼠，取材待檢。

1.2.3 腫瘤抑制率及臟器指數測定 在無菌環境下摘取腫瘤組織、胸腺及脾臟，濾紙吸干組織表面多余水分，稱重記錄。抑瘤率（IR）（%）=［模型組瘤質量（g）-用藥組瘤質量（g）］/模型組瘤質量（g）×100%］；器官指數=器官質量（mg）/小鼠體質量（g）［12］。

1.2.4 HE染色觀察各組小鼠腫瘤組織病理變化將部分腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片脫蠟，再用蘇木精和伊紅染色，脫水封片。采用顯微鏡在400倍光鏡下觀察各組小鼠腫瘤組織病理變化。

1.2.5 ELISA試劑盒檢測腫瘤組織中EGF、IFN-γ含量 稱取0.1 g腫瘤組織，加入0.9 ml PBS（pH=7.2～7.4）緩沖液，充分研磨，制成組織勻漿液，3 000 r/min 離心20 min，收集上清。嚴格按照小鼠EGF、IFN-γ ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.2.6 免疫組化法檢測腫瘤組織中p-ERK1/2、C-Myc、PD-L1蛋白表達 石蠟切片脫蠟至水，抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，孵育一抗、二抗，DBA顯色等過程后，脫水封片。顯微鏡調至200倍鏡下觀察，細胞核和（或）細胞質為棕黃色者為陽性。采用Image J 8.0軟件分析量化。

1.2.7 Western blot檢測腫瘤組織中p-ERK1/2、C-Myc和PD-L1蛋白表達 稱取0.1 g腫瘤組織剪碎，加入蛋白裂解液，離心取上清。BCA蛋白定量后變性，通過SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，封閉2 h后，加入一抗4 ℃孵育過夜，1×TBST洗膜，二抗（1∶20 000）室溫孵育1 h。采用1×TBST洗滌后，加入ECL發光溶液并用凝膠成像儀曝光。采用Image J 8.0分析蛋白條帶灰度值。

1.2.8 RT-PCR檢測腫瘤組織中ERK、C-Myc和PD-L1基因表達 稱取0.1 g腫瘤組織，使用RNA提取試劑盒進行提取，超微光學分光光度計測量總RNA濃度。根據逆轉錄試劑盒說明書，將提取的總RNA反轉錄成cDNA。GAPDH為內參基因，每組相同基因設4個重復，根據RT-PCR擴充試劑盒說明擴增靶基因，并計算每個mRNA的相對表達。引物由上海百賽生物技術股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統計學分析 實驗數據均用±s表示，采用SPSS24.0軟件進行計量數據處理，根據方差齊性檢驗結果，各組間的比較采用單因素方差分析，P＜0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 參芪抑瘤方聯合順鉑對H22肝癌荷瘤小鼠腫瘤組織病理學變化的影響 HE染色結果顯示，模型組腫瘤組織細胞排列緊密有規則，細胞核完整且核深染，核大漿少，細胞核之間分界清楚，未見明顯細胞壞死；順鉑組及低、中、高劑量聯合組腫瘤組織細胞排列疏松且不規則，細胞核固縮、破裂，界限模糊，細胞數目減少，出現不同程度的片狀壞死面積，上述腫瘤壞死灶高劑量聯合組最顯著。見圖1。

圖1 各組小鼠腫瘤組織病理學變化（HE，×400）Fig.1 Histopathological changes of tumor in each group（HE，×400）

2.2 參芪抑瘤方聯合順鉑對H22肝癌荷瘤小鼠體質量變化及腫瘤抑制率的影響 與空白組相比，模型組小鼠平均體質量降低（P＜0.05）；與模型組相比，各治療組小鼠平均體質量均升高（P＜0.05）、瘤體積均減?。≒＜0.05）、瘤質量均降低（P＜0.05）；與順鉑組相比，高劑量聯合組小鼠瘤體積減?。≒＜0.05）；中、高劑量聯合組小鼠平均體質量升高（P＜0.05）、平均瘤質量降低（P＜0.05）。低、中、高劑量聯合組及順鉑組抑瘤率分別為46.62%、53.97%、61.25%、43.15%。見圖2。

圖2 各組小鼠體質量、瘤質量及抑瘤率變化Fig.2 Changes of body weight， tumor weight and tumor inhibition rate in each group

2.3 參芪抑瘤方聯合順鉑對H22肝癌荷瘤小鼠脾臟、胸腺指數的影響 與空白組小鼠相比，模型組小鼠脾臟指數、胸腺指數均下降（P＜0.05）；與模型組相比，順鉑組小鼠脾臟指數、胸腺指數均下降，但差異無統計學意義（P＞0.05），而中、高劑量聯合組小鼠脾臟指數、胸腺指數均升高（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠脾臟指數和胸腺指數的變化（±s）Tab.2 Changes of spleen index and thymus index in each group （±s）

表2 各組小鼠脾臟指數和胸腺指數的變化（±s）Tab.2 Changes of spleen index and thymus index in each group （±s）

Note：Compared with blank group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with cisplatin group， 3）P＜0.05.

Thymus index/（mg·g-1）Groups Spleen index/（mg·g-1）2.51±0.93 0.79±0.291）1.29±0.85 1.53±0.532）3）1.75±0.902）3）0.70±0.40 Blank Model Combination with low-dose Combination with medium-dose Combination with high-dose Cisplatin 8.59±2.02 4.00±2.691）5.31±2.45 6.94±3.082）3）7.20±3.312）3）3.45±1.71

2.4 參芪抑瘤方聯合順鉑對H22肝癌荷瘤小鼠腫瘤組織中EGF、IFN-γ含量的影響 與模型組相比，各治療組小鼠腫瘤組織勻漿液中EGF和IFN-γ含量均降低（P＜0.05）；與順鉑組相比，中、高劑量聯合組小鼠瘤組織中EGF和IFN-γ含量均降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠腫瘤組織中EGF和IFN-γ水平的變化（±s，n=6）Tab.3 Changes of EGF and IFN-γ levels in tumor tissues of mice in each group （±s，n=6）

表3 各組小鼠腫瘤組織中EGF和IFN-γ水平的變化（±s，n=6）Tab.3 Changes of EGF and IFN-γ levels in tumor tissues of mice in each group （±s，n=6）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.05； compared with cisplatin group， 2）P＜0.05.

IFN-γ/（pg·ml-1）110.66±15.97 89.85±6.501）75.35±8.081）2）71.79±22.881）2）93.73±8.721）Groups Model Combination with low-dose Combination with medium-dose Combination with high-dose Cisplatin EGF/（pg·ml-1）83.51±8.88 63.139±0.991）54.95±10.601）2）52.89±9.761）2）68.96±4.871）

2.5 免疫組化法檢測腫瘤組織中p-ERK1/2、C-Myc、PD-L1蛋白表達結果 p-ERK1/2、C-Myc蛋白陽性表達于細胞漿和（或）細胞核，PD-L1蛋白陽性表達于細胞質或細胞膜，染色為棕黃色。免疫組化結果顯示，模型組p-ERK1/2、C-Myc、PD-L1蛋白陽性表達率最高，切片黃染占比面積較大，各用藥組蛋白陽性表達率逐漸降低（P＜0.05）；與順鉑組相比，聯合用藥組蛋白陽性表達率降低（P＜0.05），且中、高劑量聯合組蛋白陽性表達率顯著降低（P＜0.01），見圖3。

圖3 腫瘤組織中免疫組化p-ERK1/2、PD-L1、C-Myc表達Fig.3 Immunohistochemical p-ERK1/2，PD-L1，C-Myc expressions in tumor tissue

2.6 參芪抑瘤方聯合順鉑對H22肝癌荷瘤小鼠腫瘤組織中ERK、C-Myc、PD-L1 mRNA表達的影響RT-PCR檢測結果顯示，與模型組相比，各治療組小鼠腫瘤組織中ERK、C-Myc、PD-L1 mRNA表達均降低（P＜0.05）；與順鉑組相比，中、高劑量聯合組小鼠瘤組織中ERK、C-Myc、PD-L1 mRNA表達均明顯降低，且呈劑量依賴性變化（P＜0.05），見表4。

表4 各組小鼠腫瘤組織中ERK、C-Myc、PD-L1 mRNA的表達（±s，n=4）Tab.4 mRNA expressions of ERK， C-Myc and PD-L1 in tumor tissues of mice in each group （±s，n=4）

表4 各組小鼠腫瘤組織中ERK、C-Myc、PD-L1 mRNA的表達（±s，n=4）Tab.4 mRNA expressions of ERK， C-Myc and PD-L1 in tumor tissues of mice in each group （±s，n=4）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.05； compared with cisplatin group， 2）P＜0.05.

Groups Model Combination with low-dose Combination with medium-dose Combination with high-dose Cisplatin ERK/GAPDH 1.00±0.00 C-Myc/GAPDH 1.00±0.00 PD-L1/GAPDH 1.00±0.00 0.60±0.221）0.63±0.091）0.67±0.171）0.43±0.101）2）0.46±0.091）2）0.42±0.071）2）0.23±0.061）2）0.78±0.121）0.31±0.101）2）0.68±0.211）0.30±0.071）2）0.65±0.141）

2.7 參芪抑瘤方聯合順鉑對H22肝癌荷瘤小鼠腫瘤組織中p-ERK1/2、C-Myc、PD-L1蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，與模型組相比，各治療組小鼠腫瘤組織中p-ERK1/2、C-Myc、PD-L1蛋白表達均降低（P＜0.05）；與順鉑組相比，中、高劑量聯合組小鼠瘤組織中p-ERK1/2、C-Myc、PD-L1蛋白表達均明顯降低，且呈劑量依賴性變化（P＜0.05）。見圖4、表5。

圖4 各組小鼠腫瘤組織中p-ERK1/2、C-Myc、PD-L1蛋白表達Fig.4 Protein expressions of p-ERK1/2， C-Myc and PDL1 in tumor tissues of mice in each group

表5 各組小鼠腫瘤組織中p-ERK1/2、C-Myc、PD-L1蛋白表達（±s，n=3）Tab.5 Protein expressions of p-ERK1/2，C-Myc and PDL1 in tumor tissues of mice in each group （±s，n=3）

表5 各組小鼠腫瘤組織中p-ERK1/2、C-Myc、PD-L1蛋白表達（±s，n=3）Tab.5 Protein expressions of p-ERK1/2，C-Myc and PDL1 in tumor tissues of mice in each group （±s，n=3）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.05； compared with cisplatin group， 2）P＜0.05.

Groups Model Combination with low-dose Combination with medium-dose Combination with high-dose Cisplatin p-ERK1/2/β-actin 2.14±0.05 1.72±0.211）C-Myc/β-actin 1.31±0.10 0.79±0.111）PD-L1/β-actin 1.44±0.14 0.94±0.091）1.34±0.261）2）0.50±0.051）2）0.74±0.201）2）0.49±0.031）2）1.00±0.131）0.86±0.181）2）1.80±0.181）0.32±0.021）2）0.82±0.071）

3 討論

中醫認為肝癌的發生病機多為本虛標實，虛、瘀、痰、毒為病理基礎。正氣虧虛，邪毒外擾，形成氣滯、血瘀、濕熱、痰毒等虛實夾雜之證。目前運用中醫藥輔助治療肝癌被廣泛關注，中藥不僅能改善患者的臨床癥狀，而且能減輕患者化療后的不良反應，增強機體免疫，提高生活質量，延長生存時間。

《金匱要略·婦人妊娠病脈證并治》第二十篇中載：“妊娠，小便難，飲食如故，當歸貝母苦參丸主之”。吳紅彥教授結合臨床探究此段文意，認識到腫瘤的核心病機與當歸貝母苦參丸主治之證有諸多相似之處，只不過腫瘤患者的虛象和瘀象更加明顯。故此，吳教授在當歸貝母苦參丸的基礎上加減化裁，創立了治療腫瘤疾病的常用方——參芪抑瘤方。此方由黃芪、當歸、貝母、苦參、山慈菇等藥組成，方中重用黃芪補肺健脾，扶正益氣；貝母入肝經，化痰散結；苦參清熱燥濕解毒；當歸補血活血；山慈菇清熱化痰、軟解散結，諸藥相配，攻補兼施，共奏補氣活血，扶正祛邪，解毒散結之功。

免疫系統在機體中占據著不可或缺的地位，其功能的紊亂導致多種疾病的發生，尤其與腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移等方面密切相關，雖機體的免疫系統能產生抗腫瘤免疫應答效應，但免疫功能的紊亂能使腫瘤逃避免疫細胞的監視及攻擊而發生免疫逃逸［13］。PD-1/PD-L1通路的激活是腫瘤發生免疫逃逸的重要機制之一，腫瘤細胞膜上的PD-L1與T細胞上的PD-1結合，破壞T細胞的功能而阻止有效的腫瘤免疫反應［14］。而表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和IFN-γ的表達可激活MAPK/ERK通路，同時誘導細胞膜上PD-L1表達上調，促進腫瘤細胞增殖，抑制其凋亡［15］。ERK1/2是MAPK信號通路中研究最為透徹的通路之一，活化ERK入核，啟動相應的轉錄因子C-Myc表達［16］。研究表明，C-Myc在腫瘤組織中的過度表達，能促進腫瘤的發生發展［17］。此外，C-Myc可以直接與細胞膜上的PD-L1結合，并在腫瘤組織中高表達，誘導腫瘤發生免疫逃逸。PD-1/PD-L1的抑制劑在腫瘤治療中應用廣泛，且在臨床上取得了一定的療效，其抑制劑會影響自身免疫與免疫之間的平衡，增強免疫系統活性，攻擊腫瘤細胞［18］，但由于個體差異性，機體產生了耐藥性反應以及一些免疫相關不良反應，腹瀉、結腸炎、皮疹、肝功能異常、關節痛等較為常見［19］。中藥復方在抗腫瘤免疫治療中應用廣泛，尤其是在調節免疫平衡，抑制腫瘤的免疫逃逸，降低西藥毒性，減弱機體耐藥性等方面優勢顯著，但是其具體機制尚不明晰。

因此，本實驗復制H22肝癌荷瘤小鼠模型，應用參芪抑瘤方聯合順鉑靶向干預ERK通路來調控肝癌小鼠瘤組織中C-Myc、PD-L1表達。結果表明，與模型組、順鉑組相比，參芪抑瘤方聯合順鉑可以有效抑制腫瘤的生長，增加腫瘤壞死面積，提高小鼠脾臟指數、胸腺指數，降低腫瘤組織中EGF和IFN-γ表達，同時也降低腫瘤組織中p-ERK1/2、C-Myc、PD-L1蛋白表達和ERK、C-Myc、PD-L1 mRNA表達水平，高劑量聯合組治療效果顯著（P＜0.01），并呈劑量依賴性表達。以上研究表明，參芪抑瘤方聯合順鉑能有效抑制H22肝癌荷瘤小鼠的腫瘤生長，抑制ERK信號通路激活，下調p-ERK1/2、C-Myc、PD-L1蛋白表達和ERK、C-Myc、PD-L1 mRNA表達水平，提高抗腫瘤免疫應答。

綜上所述，參芪抑瘤方聯合順鉑能有效抑制H22肝癌荷瘤小鼠的腫瘤生長，其機制可能是通過抑制ERK信號通路激活，下調C-Myc與PD-L1蛋白表達，同時也抑制了EGF和IFN-γ誘導的PD-L1 mRNA和蛋白表達。本實驗為參芪抑瘤方聯合順鉑治療肝癌提供實驗依據。