β-人絨毛膜促性腺激素快速高靈敏化學發光POC檢測方法的建立及評價

謝海宇 秦靜 張艷妮 劉俊杰 何小維 王羽

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣州 510641；2.廣州萬孚生物技術股份有限公司，廣州 510670；3.生物島實驗室（廣州再生醫學與健康廣東省實驗室），廣州 510005）

人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）由胎盤絨毛滋養層細胞分泌，是一種由α和β兩個不同亞基通過非共價鍵結合而成的高度糖基化異二聚體糖蛋白。胎盤絨毛滋養層包括單個核細胞絨毛滋養層內層和多核合體細胞滋養層外層。妊娠早期（4～5周）主要由內層細胞滋養層分泌產生HCG，妊娠6周后主要由外層合體細胞滋養層分泌產生［1-3］。幾乎所有滋養細胞腫瘤和多數生殖細胞腫瘤均會分泌HCG及其亞基，因此HCG及其亞基可作為診斷早孕和監測妊娠及相關疾病的可靠標志物［4-7］。臨床檢測通常將HCG的β亞基（β-HCG）作為檢測靶標，對β-HCG檢測方法的性能要求主要體現在兩方面：①靈敏度：妊娠早期血清β-HCG含量很低，一般僅有5～25 mU/ml，需高靈敏度的檢測方法［8-9］；②線性范圍：β-HCG水平在妊娠期間呈指數級增長，約每2～3 d增加1倍，第8～10周可達到3×104～2×105mU/ml，濃度超出檢測方法線性范圍可能由于鉤狀效應出現假低濃度，嚴重影響臨床醫生對病情的預判［10-12］。因此，發展一種靈敏度高、檢測范圍寬的β-HCG即時檢測（POCT）法對基層社區診斷早孕、監測妊娠及相關疾病等具有重要意義。

目前已發展了多種β-HCG檢測法，其中化學發光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）是一種將化學發光技術與免疫化學反應相結合的分析方法，因其靈敏度高、動態范圍寬、反應快速，且易于自動化廣泛用于臨床診斷［13-18］。傳統的全自動CLIA通常配備大型儀器且需要專業技術人員操作，限制了CLIA在基層社區醫療單位的推廣使用［19］?；鶎由鐓^的大規模篩查不僅需要微型、自動化的分析儀，還需要智能、簡單的操作系統。因此，妊娠及相關疾病的快速篩查迫切需要快速、簡便的全自動化學發光POC分析儀配套的檢測試劑［20-21］。本研究基于小型化學發光儀建立β-HCG快速高靈敏化學發光即時檢測方法（POC-CLIA），并對其檢測性能及臨床應用進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料 β-HCG單克隆抗體購自中國南京金斯瑞生物科技有限公司；β-HCG抗原購自中國南京艾得普生物科技有限公司；堿性磷酸酶（Alp）和牛血清白蛋白購自美國Roche公司；磁顆粒（Mps）購自日本JSR公司；化學發光底物（AMPPD）和其他化學發光試劑均由廣州萬孚生物技術股份有限公司提供；脫鹽柱購自上海Thermo Fisher Science；所有緩沖試劑和其他無機化學品均購自Sigma-Aldrich；商業試劑盒購自美國Abbott公司；臨床血清和血漿標本由廣州萬孚生物技術股份有限公司臨床實驗室提供；化學發光全自動小型化系統（Shine i2900）由廣州萬孚生物技術股份有限公司提供；對照試劑及儀器由美國Abbott公司提供（ARCHITECT i2000 SR化學發光檢測儀及配套β-HCG化學發光檢測試劑盒）。

1.2 方法

1.2.1 β-HCG抗體包被Mps 10 mg Tosyl Mps用0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH=9.5）洗滌3次進行活化，活化后將50 μl β-HCG抗體（4.4 mg/ml）加入333 μl硫酸銨緩沖液（3 mol/L，pH=9.5）和617 μl硼酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH=9.5）進行偶聯。37 ℃振蕩孵育16 h后分離上清，加入1 ml 0.5%BSA溶液（0.02 mol/L，pH=7.2）封閉Mps，37 ℃繼續孵育4 h后去上清，洗滌3次，獲得免疫磁珠（Mps-Ab）。將Mps-Ab重懸于含0.1%BSA的磷酸鹽緩沖液（0.02 mol/L，pH=7.2），4 ℃保存備用。

1.2.2 β-HCG抗體標記堿性磷酸酶（Alp） 將Alp和β-HCG抗體用超純水分別稀釋至2 mg/ml和4 mg/ml。600 μl Alp溶液與200 μl β-HCG抗體溶液輕輕混合，加入含1%戊二醛的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH=7.4） 37 ℃避光孵育4 h，加入100 μl單乙醇胺溶液（1 mol/L） 37 ℃孵育2 h，用脫鹽柱除去混合物中多余的顆粒。將得到的Alp標記的β-HCG抗體（Alp-Ab）轉移至試管，與等量甘油混合，-20 °C保存備用。

1.2.3 免疫檢測程序 全自動化學發光免疫分析儀使用過程：①樣品裝載：將血清或血漿樣品放入樣本位置；②試劑裝載：將裝有Alp-Ab、Mps-Ab、樣本處理液的試劑船放置到相應位置；③打開儀器并運行，啟動自動檢測程序。POCT-CLIA免疫反應采用一步夾心法：5 μl臨床樣品或校準品、50 μl Alp-Ab和50 μl Mps-Ab混合，37 ℃振蕩孵育5 min，形成夾心Mps-Ab-β-HCG-Alp-Ab免疫復合物，磁分離系統洗滌4 min去除游離組分，加入200 μl發光底物（AMPPD）反應4 min后檢測發光值。

1.2.4 β-HCG標準品配制及孵育時間和上樣體積確定 量取不同量β-HCG抗原溶于含0.5%BSA的Tris-HCl溶液，制成標準品S0～S9（0、8、28、80、224、379、650、1 950、5 500、10 924 mU/ml）。測試S1～S9標準品信噪比以及62例臨床血清樣本信號與濃度的相關性，確定孵育時間及上樣體積。

1.2.5 標準曲線建立 對標美國Abbott公司化學發光檢測試劑盒，按照溯源程序，由美國Abbott公司的ARCHITECT i2000 SR化學發光檢測儀標定出100例血清樣本濃度，血清樣本繼續校準廣州萬孚Shine i2900后即可標定出10個標準樣本濃度。檢測后將濃度與發光值進行四參數擬合獲得標準曲線。

1.2.6 最低檢測限 采用空白樣本S0重復測定20次，計算其發光值平均值CM1和標準差SD；測定S1樣本3次，計算發光值平均值CM2，對S0與S1的濃度-發光值結果進行兩點回歸擬合，得出擬合方程，將CM1+2SD結果代入擬合方程得出最低檢測限［22］。

1.2.7 精密度試驗 使用兩種不同濃度標準品（25.3 mU/ml和920.6 mU/ml）進行批內和批間分析。1 d內測試各濃度樣本6次計算批內精密度，連續6 d對各樣品進行2次測試獲得批間精密度。

1.2.8 準確度試驗 分別測試低濃度質控品（AL：25.3 mU/ml）和高濃度質控品（AH：463.6 mU/ml），各樣本測試3次，利用相對偏差評價POC-CLIA體系測定結果的準確性。

1.2.9 線性稀釋試驗 高濃度β-HCG血清樣本（1.092×104mU/ml）采用牛血清稀釋，按高濃度樣本∶血清=0∶1、1∶99、1∶9、1∶4、2∶3、3∶2、4∶1、1∶0稀釋，稀釋后濃度分別為0、109、1 092、2 184、4 368、6 551、8 736、10 920 mU/ml。將混合稀釋樣本實際測定的平均值與理論值進行線性回歸分析。

1.2.10 抗干擾試驗 血清樣本中添加一定量可在免疫檢測中引起干擾的常見組分（如膽紅素、三酰甘油、血紅蛋白），與未添加干擾物質的血清樣本進行對照測試。干擾表現為偏差值，偏差（%）=（實驗組濃度-對照組濃度）/對照組濃度×100%。

1.2.11 穩定性試驗 根據行業標準［23-25］，將Alp-Ab、Mps-Ab和樣本處理液各分為3份，37 ℃保存0 d、7 d和10 d，保存前后均測試血清樣本3次，計算測試結果與原始值偏差，偏差（%）=（熱加速后濃度-原始濃度）/原始濃度×100%。

1.2.12 鉤狀效應試驗 用標準品稀釋液將已知高濃度β-HCG陽性臨床樣本（2.6×105mU/ml）按臨床樣本∶稀釋液=11∶9、11∶5、12∶5、13∶5、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256進行系列稀釋。每個樣本分別測定3次，擬合其濃度和發光值曲線。

1.2.13 臨床應用評估 采用建立的POC-CLIA方法與商業試劑盒對照檢測100例臨床血清樣本，對兩種方法的結果進行Passings-Bablok相關性分析、Bland-Altman一致性分析以及配對t檢驗。采用EDTA-K2、肝素鋰和常規采血管收集20例不同人血液樣本，POC-CLIA進行β-HCG檢測，比較EDTA-K2血漿樣本、肝素鋰血漿樣本與血清樣本β-HCG檢測結果差異。

1.3 統計學處理 四參數和線性擬合采用Origin Pro 2021軟件進行；性能評價按美國臨床實驗室標準化協會標準EP文件進行，數據采用SPSS25.0軟件進行統計學分析（P＜0.05為差異有統計學意義）；Bland-Altman一致性分析和Passing-Bablok相關性分析采用Med Calc軟件進行。

2 結果

2.1 孵育時間與上樣體積確定 選擇抗原抗體反應時間為5 min、上樣量為5 μl。低段信噪比（S1/S0）為3.45，隨著濃度升高，信噪比逐步增大，中段信噪比（S5/S0）達到182.43，高段信噪比（S9/S0）高達7 086（圖1A）。不同β-HCG濃度臨床血清樣本與其對應信號值具有高度相關性（R2=0.989 8，圖1B）。因此，抗原抗體反應時間為5 min和樣本量5 μl滿足方法學要求。

圖1 孵育時間與上樣體積確定Fig.1 Incubation time and sample volume determination

2.2 β-HCG標準曲線建立 檢測β-HCG系列標準品，建立的標準曲線如圖2所示。標準曲線方程為：y=30 431 860+（4 743-30 431 860）/［1+（x/11 789）1.179］，R2=0.999 9。

圖2 POC-CLIA檢測β-HCG的標準曲線Fig.2 Standard curve of POC-CLIA for β-HCG detection

2.3 最低檢測限 建立的POC-CLIA最低β-HCG檢測限為0.71 mU/ml，滿足妊娠早期血清β-HCG檢測（5～25 mU/ml）要求。

2.4 精密度 批內和批間變異系數（CV）分別≤3.11%和≤5.58%（表2），優于行業標準要求（≤8%和≤15%），表明該方法的重現性和精密度良好。

表2 批內和批間變異系數Tab.2 Intra and inter CV

2.5 準確度 實際結果與標示值相對偏差均在±10%之內，表明所開發的POC-CLIA方法具有較高的準確性，具有臨床應用價值（表3）。

表3 準確度測試結果Tab.3 Results of accuracy tests

2.6 線性稀釋 稀釋后的β-HCG測定濃度與其理論濃度呈高度線性關系（r=0.999 0，k=0.974 5，圖3），證明該方法在0.710～1.092×104mU/ml工作范圍內具有較好的檢測準確性。

圖3 β-HCG線性范圍Fig.3 Linear range of β-HCG detection

2.7 抗干擾性 添加膽紅素（0.02 g/dl）、三酰甘油（4 g/dl）、血紅蛋白（0.8 g/dl）的臨床血清標本與未添加干擾物質的樣本檢測結果偏差在±10%之內，具有較好的抗干擾能力，特異性較好（表4）。

表4 β-HCG抗干擾能力評價Tab.4 Evaluation of resistant interference capability of β-HCG detection

2.8 穩定性 將Alp-Ab、Mps-Ab和樣本處理液熱加速處理7 d和10 d后檢測高、中、低3個樣本（表5），測試結果與原始值偏差在±10%之內，說明試劑具有良好的穩定性。

表5 試劑熱加速穩定性Tab.5 Reagents stability by accelerated testing

2.9 鉤狀效應 對鉤狀效應進行評價（圖4），信號在1.7×105mU/ml進入平臺期，而2.6×105mU/ml時仍未出現明顯下降，表明本試劑盒檢測高濃度樣本時具有很好的抗鉤狀效應能力。

圖4 鉤狀效應評估Fig.4 Evaluation of hook effect

2.10 臨床應用評估 使用本方法與商業試劑盒平行測試批量臨床樣本，Passing-Bablok相關性分析顯示兩種方法的相關系數為0.997 0（圖5A）；Bland-Altman一致性分析發現兩種方法的平均相對差值僅為4%（95%CI，圖5B）；配對t檢驗P值為0.327，差異無統計學意義。表明建立的POC-CLIA法與對照試劑盒檢測結果高度相關，檢測一致性良好，可用于臨床血清β-HCG定量檢測。同步檢測肝素鋰血漿樣本、EDTA-K2血漿樣本與血清樣本β-HCG發現，血漿樣本與血清樣本的檢測結果R2分別為0.999 0（圖6A）和0.998 7（圖6B），斜率k分別為0.918 0和0.998 7，表明血漿樣本與血清樣本檢測結果高度相關，可通用于血清及血漿β-HCG檢測。

圖5 商品化直接化學發光方法與POC-CLIA的Passing-Bablok（A）和Bland-Altman（B）分析Fig.5 Passing-Bablok （A） and Bland-Altman （B） analysis of commercial direct chemiluminescence and proposed method

圖6 肝素鋰血漿樣本（A）、EDTA-K2血漿樣本（B）與血清樣本的Passing-Bablok分析Fig.6 Passing-Bablok analysis of serum samples with lithium heparin plasma samples（A） and EDTA-K2 plasma samples （B）

2.11 方法學比較 比較建立的POC-CLIA與已報道的β-HCG檢測方法，目前定量檢測β-HCG的技術主要為免疫分析技術，包括膠體金免疫層析法（GICT）、ELISA、時間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）、直接化學發光免疫分析法（dCLIA）等，本研究的POC-CLIA方法靈敏度更高，線性范圍更寬，檢測速度快，且可實現全自動POC檢測，具有較高臨床應用價值（表6）。

表6 已報道的β-HCG檢測方法與本研究建立方法比較Tab.6 Comparison of reported assay for β-HCG detection and established method in this study

3 討論

HCG是包含237個氨基酸的異二聚體，由α亞基（α-HCG）和β亞基（β-HCG）組成，通過電荷非共價連接，共包含8個糖基側鏈［29］。其中，β-HCG是HCG的特有結構，決定了其分子生物學和免疫學特性，其含量測定在臨床中應用廣泛，常用于診斷妊娠、監測妊娠過程、估計妊娠時間；在異位妊娠、唐氏綜合征、滋養層腫瘤、非妊娠性惡性瘤等疾病中也有顯著變化，如正常宮內妊娠時血清β-HCG倍增時間為1.7～2.4 d，異位妊娠則需3～8 d。因此，建立簡單、快速的β-HCG檢測方法具有重要臨床意義。

本研究將免疫反應、磁分離技術和化學發光檢測技術相結合，建立了一種靈敏度高、線性范圍寬、檢測速度快、特異性強的POC-CLIA檢測方法。由于磁微粒表面積大，增加了抗體承載能力，且Alp-AMPPD發光系統穩定性好，可持續發光，因此本試劑盒具有高靈敏度，最低檢測限僅為0.71 mU/ml。本研究使用了一步程序，比通常使用的兩步程序更快，孵育時間僅為5 min，僅需14.5 min即可獲得準確結果，線性范圍為0.710～1.092×104mU/ml，且在1.7×105mU/ml高濃度時無鉤狀效應影響?？稍?7 ℃穩定保存10 d，相當于4 ℃下18個月。準確度相對偏差在±10%之內，批內、批間精密度良好（CV＜10%），干擾物質與β-HCG均無交叉反應。將該方法用于臨床血清標本β-HCG檢測，結果與對照廠家美國Abbott公司的試劑盒結果具有較高一致性（R2=0.997 0），且可用于血漿β-HCG檢測。

β-HCG檢測最早使用的放射免疫技術由于其放射性污染等逐漸淘汰。膠體金免疫層析法雖不需要特殊儀器設備，易于操作，但僅適用于β-HCG定性檢測，不能用于定量檢測，且靈敏度有限。目前定量檢測β-HCG的技術主要包括ELISA、TRFIA、dCLIA，其中ELISA存在酶穩定性差、光度測量范圍窄、靈敏度較低等問題，易造成假陽性或漏診。TRFIA具有較高的特異度和靈敏度，但易受自然存在的稀土類物質（主要來源于空氣中的灰塵、實驗用蒸餾水、反應容器等）影響，需在實驗室干凈環境下進行。dCLIA靈敏度高，檢測速度較快，但需配備較大儀器設備，不能用于POCT檢測。本研究的POC-CLIA方法靈敏度更高、線性范圍更寬、檢測速度快，且可實現全自動POC檢測。此外，配套儀器體積小，可連續裝載樣本，可實現β-HCG的POC檢測，利于在社區醫院推廣，實現早期妊娠和妊娠相關疾病篩查和監測。